羅玉姣，岳金寶，吳 丹，劉 尋,李 群，譚 勁

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

扶正活血解毒方干預(yù)ANE誘導(dǎo)口腔黏膜成纖維細(xì)胞I型膠原表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

羅玉姣，岳金寶，吳 丹，劉 尋,李 群，譚 勁*

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

目的觀察檳榔提取液（areca nut extract，ANE）對(duì)口腔黏膜成纖維細(xì)胞I型膠原分泌的誘導(dǎo)作用及扶正活血解毒方的干預(yù)作用。方法體外培養(yǎng)口腔黏膜成纖維細(xì)胞，ANE為誘導(dǎo)劑，扶正活血解毒中藥藥物血清（低、中、高）為干預(yù)物；用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)I型膠原的表達(dá)，用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清I型膠原的含量。結(jié)果ANE對(duì)口腔黏膜成纖維細(xì)胞 I型膠原的合成有促進(jìn)作用（P＜0.01），扶正活血解毒方含藥血清（中、高）對(duì)ANE刺激下的FB膠原合成有抑制作用（P＜0.05）。結(jié)論扶正活血解毒中藥可下調(diào)ANE誘導(dǎo)的口腔黏膜成纖維細(xì)胞I型膠原的表達(dá)。

檳榔提取液；扶正活血解毒方；口腔黏膜成纖維細(xì)胞；I型膠原

研究表明大量咀嚼檳榔導(dǎo)致的口腔黏膜成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積是導(dǎo)致口腔黏膜下纖維化 （Oral Submucous Fibrosis,OSF）的重要病因之一[1-2]。OSF已被世界衛(wèi)生組織定義為癌前狀態(tài)[3]。I型膠原蛋白（collagen type I)是膠原蛋白（collagen)的一種，它是一種結(jié)構(gòu)蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其主要的功能是對(duì)組織細(xì)胞支持和連接的作用。研究發(fā)現(xiàn)I型膠原蛋白的高表達(dá)與許多的纖維化疾病的發(fā)生是密切相關(guān)的[4]，目前還發(fā)現(xiàn)I型膠原蛋白在多種腫瘤如舌癌[5]、頭頸鱗癌[6]、胰腺癌[7]等中也呈高表達(dá)。有資料顯示，I型膠原蛋白在OSF晚期和口腔鱗癌中表達(dá)顯著性增多并更具有活性[8-9]。因此，I型膠原蛋白可能在OSF及癌變發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中扮演一個(gè)非常重要的角色。近年來(lái)本院口腔科采用扶正活血解毒中藥治療OSF，取得良好療效[10]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察扶正活血解毒中藥含藥血清對(duì)檳榔提取液（areca nut extract，ANE）誘導(dǎo)的口腔黏膜成纖維細(xì)胞I型膠原分泌影響的作用，初步探討中醫(yī)藥體外抗OSF及癌變的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基 (GIBCO),胎牛血清（GIBCO），一抗 （兔抗 Collagen I，Abcam）， 二抗 （羊抗兔 IgG，Vector），DAB 試劑盒（Vector）,I型膠原 ELISA 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。扶正活血解毒方由丹參、當(dāng)歸、紅花、生地黃、玄參、白花蛇舌草、生黃芪、薄荷等藥組成，藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，浸泡、煎煮、去渣，濃縮至藥液濃度為每毫升含生藥1 g，冷藏備用。ANE（按文獻(xiàn)方法[11]制備）。二氧化碳培養(yǎng)箱(M2300,Sheldon Manufacturing Inc), 酶標(biāo)儀（ELM3000，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥血清的制備 成年健康SD大鼠32只，隨機(jī)分為4組（正常組和中藥低、中、高劑量組），每組8只，分別以蒸餾水、扶正活血解毒方4、8、16 g/kg（按照體表面積藥物劑量換算公式計(jì)算，分別相當(dāng)70 kg成人劑量的 1、2、4 倍）灌胃，2 次/d，連續(xù) 5 d。大鼠末次灌胃1 h后,無(wú)菌條件下頸動(dòng)脈采血，室溫靜置2 h，1 500轉(zhuǎn)/分離心10 min制備血清，56℃滅活30 min，0.22 μm濾器除菌后，用DMEM配制成含10%大鼠血清的培養(yǎng)液備用。

1.2.2 口腔黏膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與分組干預(yù)處理 口腔黏膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及ANE誘導(dǎo)增殖按課題組前期實(shí)驗(yàn)[11]介紹的方法進(jìn)行。取第3代細(xì)胞分為5組：（1）正常組：正常大鼠血清；（2）實(shí)驗(yàn)對(duì)照組： 正常大鼠血清+100 μg/mL ANE；（3）實(shí)驗(yàn)組（分低、中、高劑量組）：低劑量扶正活血解毒方含藥血清+100 μg/mL ANE、中劑量扶正活血解毒方含藥血清+100 μg/ml ANE、高劑量扶正活血解毒方含藥血清+100 μg/mL ANE。將經(jīng)鼠尾膠處理的蓋玻片植入24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種植于蓋玻片上，每組6孔，培養(yǎng)48 h后，收集上清液，-80℃保存，用于ELISA檢測(cè)；培養(yǎng)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.3 ELISA檢測(cè)上清液中Ⅰ型膠原含量 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，設(shè)置對(duì)照品組、樣品組及空白組，顯色后，以空白孔調(diào)零，在波長(zhǎng)490 nm 處讀取OD值;以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)得的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出Ⅰ型膠原含量的相應(yīng)濃度。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Ⅰ型膠原的表達(dá) 免疫細(xì)胞化學(xué)染色主要步驟依次為:0.01MPBS漂洗，1%過(guò)氧化氫溶液10 min，0.01 MPBS漂洗，5%正常小牛白蛋白 （BSA）+0.3%TritonX-100室溫下封閉l h,吸棄封閉液，直接滴加一抗 (1∶500)，4℃過(guò)夜,0.01 MPBS 漂洗，加入二抗（1∶200），37 ℃孵育 l h；0.01 MPBS漂洗，加入ABC復(fù)合物，37℃孵育l h；0.01 MPBS，DAB顯色試劑盒37℃顯色,梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。用PBS替代一抗做陰性對(duì)照，排除二抗的非特異性染色。每片取5個(gè)視野，在高倍鏡下攝取圖像，采用圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定免疫陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值,同時(shí)測(cè)量背底灰度值，計(jì)算其差值的絕對(duì)值,即得出免疫陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組培養(yǎng)液中Collagen I的含量比正常組顯著增高（P＜0.01）；加入扶正活血解毒方干預(yù)后各實(shí)驗(yàn)組的Collagen I的含量均有所降低，中劑量組和高劑量組Collagen I的含量比實(shí)驗(yàn)對(duì)照組顯著減少（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

Collagen I免疫陽(yáng)性物質(zhì)在正?？谇火つこ衫w維細(xì)胞胞漿中有表達(dá)，但染色較淺。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組Collagen I免疫陽(yáng)性物質(zhì)在胞漿中表達(dá)較強(qiáng)，染色較深，與正常組相比，免疫陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)灰度值明顯要大（P＜0.01）。各劑量實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，免疫陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)灰度值均有所減小，并且隨劑量的增加而遞減，中劑量組和高劑量組的作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表 1，圖 1。

表1 扶正活血解毒中藥對(duì)ANE刺激下的Collagen I表達(dá)的影響 (±s,n=6)

表1 扶正活血解毒中藥對(duì)ANE刺激下的Collagen I表達(dá)的影響 (±s,n=6)

注:與正常組相比，△△P＜0.01；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別正常組實(shí)驗(yàn)對(duì)照組低劑量實(shí)驗(yàn)組中劑量實(shí)驗(yàn)組高劑量實(shí)驗(yàn)組F P培養(yǎng)液（pg/mL）138±10.6 246±21.7△△221±20.8 157±13.2*150±12.7*51.064 0.000細(xì)胞（相對(duì)灰度值）41.4±3.8 73.1±6.9△△66.5±6.2 46.8±4.5*44.5±4.3*44.217 0.000

圖1 口腔黏膜成纖維細(xì)胞 Collagen I免疫化學(xué)染色

3 討論

膠原又稱膠原蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，迄今已報(bào)道的膠原蛋白有20多類，膠原通常由3條肽鏈組成，每條單肽鏈稱α鏈。根據(jù)膠原在體內(nèi)的分布和功能特點(diǎn)分為兩大類:成纖維膠原和非成纖維膠原。I型膠原屬成纖維膠原，主要由成纖維細(xì)胞、網(wǎng)織細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等生成[12]。I型膠原由2條α1-肽鏈和1條α2-肽鏈組成。I型膠原較粗大，交聯(lián)緊密，抗張力強(qiáng)，其含量高的組織不易伸展、僵硬度高。增生性瘢痕組織中以Ⅰ型膠原為主，瘢痕質(zhì)地越硬，其含量越高[13]。I型膠原蛋白的高表達(dá)與纖維化疾病的發(fā)生是密切相關(guān)的，目前還發(fā)現(xiàn)I型膠原蛋白在多種腫瘤中也呈高表達(dá)，I型膠原蛋白可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。OSF是以膠原纖維堆積為主要病變特征具有癌變傾向的口腔黏膜病[14]，研究發(fā)現(xiàn)，口腔黏膜下纖維化隨病變程度進(jìn)展的加深，Ⅰ型膠原的表達(dá)逐漸增加，OSF晚期和口腔鱗癌中Ⅰ型膠原的表達(dá)顯著性增多并更具有活性[9,15]，口腔黏膜下纖維化晚期患者出現(xiàn)固有層纖維彈性改變、上皮萎縮、口腔黏膜僵硬，張口受限，乃致不能進(jìn)食，治療方法主要采用注射膠原酶溶解膠原纖維和手術(shù)切除纖維條索[16]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，口腔黏膜下纖維化是由于嗜食辛辣燥熱之品，濕熱邪毒郁積局部，引起局部氣機(jī)不暢，日久氣滯血瘀，形成病損[17]。根據(jù)本病“毒瘀虛”互結(jié)的總體病機(jī),我們采用扶正活血解毒中藥治療口腔黏膜下纖維化，臨床療效確切[10]。方中丹參、當(dāng)歸、紅花活血化瘀,生黃芪、白芍益氣扶正,生地、玄參養(yǎng)陰清熱,白花蛇舌草、茵陳解毒散瘀;全方共奏扶正活血解毒之功?，F(xiàn)代研究表明丹參及化學(xué)組分具有抗纖維化、抗腫瘤的藥理學(xué)作用[18-19],丹參素可減少高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞Ⅰ型膠原的分泌[20];白花蛇舌草含有黃酮、三萜類、甾醇類等多種抗腫瘤活性成分，其主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生超氧化物、影響癌基因表達(dá)、增強(qiáng)免疫功能、干擾腫瘤細(xì)胞能量代謝等多種途徑起到抗腫瘤的作用[21]。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)：正常培養(yǎng)的口腔黏膜成纖維細(xì)胞存在少量的Ⅰ型膠原表達(dá)，經(jīng)檳榔提取物刺激后Ⅰ型膠原的含量明顯增多。扶正活血解毒中藥含藥血清作用于ANE刺激下的FB后，上清液和細(xì)胞中Ⅰ型膠原量均有所下降 （與ANE刺激組相比P＜0.05），提示這種拮抗Ⅰ型膠原的作用可能是其治療OSF的有效機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)觀察到了ANE對(duì)口腔黏膜成纖維細(xì)胞I型膠原分泌的誘導(dǎo)作用及扶正活血解毒方的干預(yù)作用，然而Ⅰ型膠原的合成通路和降解通路是一系列復(fù)雜的分子事件，扶正活血解毒中藥干預(yù)通路中的哪一環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Fuzheng Huoxue Jiedu Decoction on the Expression of Collagen I in Oral Mucosal Fibroblasts Induced by ANE

LUO Yujiao,YUE Jinbao,WU Dan,LIU Xun,LI Qun,TAN Jin*
(The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the expression of collagen I in oral mucosal fibroblasts induced by ANE and the intervention of Fuzheng Huoxue Jiedu decoction.MethodsOral mucosal fibroblasts were cultured in vitro,ANE was used as an indicator,and Fuzheng Huoxue Jiedu decoction as intervention medicine.The expression of collagen I was measured by immunocytechemical method,and the content of collagen I was determined by ELISA.ResultsANE had promotion effect on the synthesis of collagen I in oral mucosal fibroblasts(P＜0.01),Fuzheng Huoxue Jiedu decoction drug serum had inhibition effect on the expression of collagen I induced by ANE (P＜0.05).ConclusionFuzheng Huoxue Jiedu decoction can inhibit the expression of collagen I in oralmucosal fibroblasts induced by ANE.

areca nut extract;Fuzheng Huoxue Jiedu decoction;oral mucosal fibroblasts;collagen I

R285；R593.2

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.12.003

本文引用：羅玉姣，岳金寶，吳 丹，劉 尋,李 群，譚 勁.扶正活血解毒方干預(yù)ANE誘導(dǎo)口腔黏膜成纖維細(xì)胞I型膠原表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（12）：1308-1311.

2017-10-11

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81373701）。

羅玉姣，女，在讀碩士研究生，主要從事口腔黏膜病防治研究。

*譚 勁，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:tanjinhn@aliyun.com。

（本文編輯 匡靜之）