沈維亮，靳艷玲，丁 凡，余金龍，方 揚，譚 力，易卓林，何開澤，趙 海

(1.中國科學院成都生物研究所，中國科學院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川 成都 610041； 2.中國科學院成都生物研究所，環(huán)境微生物四川省重點實驗室，四川 成都 610041； 3.綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院，四川 綿陽 621000)

甘薯淀粉加工廢渣生產(chǎn)蛋白飼料的工藝

沈維亮1，2，靳艷玲1，2，丁 凡3，余金龍3，方 揚1，2，譚 力1，2，易卓林1，2，何開澤1，2，趙 海1，2

(1.中國科學院成都生物研究所，中國科學院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川 成都 610041； 2.中國科學院成都生物研究所，環(huán)境微生物四川省重點實驗室，四川 成都 610041； 3.綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院，四川 綿陽 621000)

以甘薯淀粉加工廢渣為原料，研究了以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母以及雙菌混合培養(yǎng)生產(chǎn)菌體蛋白的工藝。結(jié)果表明：以釀酒酵母為菌種，其最佳培養(yǎng)條件為自然pH值、薯渣含水率75%、培養(yǎng)溫度32℃、接種量10%、尿素1.5%、纖維素酶0.5%、異淀粉酶0.5%，薯渣中真蛋白質(zhì)量分數(shù)達12.01%；以產(chǎn)朊假絲酵母為菌種，除尿素添加量為1%外，其利用甘薯渣生產(chǎn)菌體蛋白的最適培養(yǎng)條件與釀酒酵母一致，薯渣中真蛋白質(zhì)量分數(shù)達16.36%；以釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母進行混合接種培養(yǎng)時，其最佳接種配比為1∶1，此時薯渣中真蛋白質(zhì)量分數(shù)達18.08%。

甘薯；廢渣；菌體蛋白；飼料

我國是世界第一大甘薯生產(chǎn)國，據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization,FAO)統(tǒng)計，2014年我國甘薯產(chǎn)量為7 154萬t，占全球甘薯總產(chǎn)量的67%。近年來，我國加工用甘薯的比例逐漸提升，但是目前我國甘薯加工產(chǎn)品種類很少，仍以淀粉、粉絲、粉條等“三粉”加工為主。根據(jù)國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系2010～2011年的調(diào)查資料分析，北方薯區(qū)淀粉加工所占比例為 58.7%，長江中下游薯區(qū)和南方薯區(qū)分別為44.4% 和31.3%[1]。每加工1 t鮮薯產(chǎn)生2～3 t廢渣，其含水量在75%以上，不易儲存和運輸，若不能有效利用，極易腐敗變質(zhì)而造成環(huán)境污染[2-4]。因此，如何開發(fā)利用甘薯淀粉加工廢渣已經(jīng)成為當前我國甘薯淀粉行業(yè)亟需解決的難題。

同時，我國是一個飼料蛋白資源嚴重短缺的大國，每年需從國外進口大量豆粕、魚粉等以填補國內(nèi)市場的不足[5]，利用食品工業(yè)廢料、農(nóng)副產(chǎn)品下腳料、農(nóng)作物秸稈等廢棄物資源培養(yǎng)酵母菌、乳酸菌等可飼用菌體蛋白是當前研究開發(fā)的熱點[6-9]，既可變廢為寶，解決日益嚴峻的環(huán)境污染問題，又為快速發(fā)展的養(yǎng)殖業(yè)提供短缺的高蛋白飼料。鑒于此，本研究以甘薯淀粉加工廢渣為原料，綜合應(yīng)用酶解與微生物固體培養(yǎng)技術(shù)，通過正交試驗，獲得甘薯渣生產(chǎn)蛋白飼料的最佳工藝，提高甘薯渣中微生物菌體蛋白的含量，為廢渣的綜合利用提供參考，并為解決甘薯淀粉加工業(yè)的環(huán)境污染問題開辟新途徑。

1 試驗材料

1.1 微生物菌種

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)為本實驗室保存菌種。

1.2 原料

甘薯渣由中國科學院成都生物研究所雙流中試基地提供。

1.3 試劑

α-淀粉酶購自諾維信公司，標準酶活力為90 KNU/ml，KNU為諾維信液化酶的專有單位，1 KNU的定義在37℃、pH5.6時，每小時水解5.26 g淀粉的酶量；糖化酶購自諾維信公司，標準酶活力為500 AGU/ml，AGU為諾維信糖化酶專有單位，1 AGU的定義是指在25℃、pH4.3標準條件下，每分鐘水解1 mmol麥芽糖所需的酶量；纖維素酶購自綿陽禾本生物工程有限公司，CMC濾紙酶活>1 000 U/g，1個纖維素酶活力單位定義是指在50℃、pH4.5條件下，每分鐘催化濾紙纖維水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量；果膠酶購自綿陽禾本生物工程有限公司，標準酶活力>1 000 U/ml，1個果膠酶活力單位定義是指在50℃、pH 4.5條件下，每分鐘催化果膠多糖水解生成1 μmol還原糖所需的酶量；異淀粉酶購自綿陽禾本生物工程有限公司，標準酶活力>5 000 U/g，1個異淀粉酶活力單位定義是指在50℃、pH 6.5條件下，每分鐘催化支鏈淀粉水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。

1.4 儀器設(shè)備

ELSD 2000高效液相色譜儀：美國奧泰公司；IS-RDS 3恒溫培養(yǎng)箱：美國精琪公司；Kjeltec 2200 凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司。

2 方法

2.1 測定方法

淀粉含量參照GB/T 5009.9-2008改進后的方法測定[10-11]。色譜條件：采用Aminex HPX-87P糖分析柱，柱溫79℃。以超純水為流動相，控制流速0.6 ml/min，蒸發(fā)光檢測器溫度110℃，載氣壓力0.32 MPa，進樣量20 μl，所得的結(jié)果為糖濃度，再除以1.1即為淀粉含量；總灰分參照GB/T 5009.4-2010采用直接灰化法測定[12-13]；粗蛋白質(zhì)參照GB/T 5009.5-2010采用半微量凱氏定氮法測定[12-13]；真蛋白測定時先將樣品用10%三氯乙酸洗3次，浸出水溶性含氮物，過濾，濾渣烘干，再按照粗蛋白質(zhì)的測定方法測定濾渣中蛋白氮含量[11,14]。粗纖維參照GB/T 6434-2006采用酸性洗滌纖維法測定[11,13]。

2.2 菌種種子液制備

酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)115℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接種菌種，28℃、轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)24 h。

2.3 薯渣菌種培養(yǎng)

除特別說明外，甘薯渣(含水率約75%)中加入0.5%KH2PO4、0.1% α-淀粉酶和0.5%糖化酶，無需滅菌。按10%的接種量加入OD600為1的酵母菌種子液，攪拌均勻，30℃培養(yǎng)3 d。

2.4 釀酒酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)條件優(yōu)化

以薯渣的含水率、培養(yǎng)溫度、接種量和尿素添加量為考察因素，設(shè)計4因素3水平L9(34)正交試驗，以優(yōu)化薯渣生產(chǎn)菌體蛋白的工藝條件，試驗設(shè)計見表1。

表1 釀酒酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)條件正交試驗因素水平表

2.4.2酶添加優(yōu)化

以薯渣中真蛋白含量作為考察指標，選擇異淀粉酶、纖維素酶、果膠酶為考察因素，設(shè)計3因素4水平L16(43)正交試驗，以優(yōu)化酶的添加種類和添加量，試驗設(shè)計見表2。

表2 酶添加正交試驗因素水平表

2.5 產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

選擇培養(yǎng)溫度、接種量及尿素添加量為考察因素，設(shè)計3因素2水平L4(23)正交試驗，以優(yōu)化產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)條件，試驗設(shè)計見表3。

表3 產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)條件正交試驗因素水平表

2.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)為3次重復的平均值，采用DPS軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 甘薯渣基本成分分析

按照2.1的測定方法，檢測了甘薯渣的基本成分，結(jié)果見表4。甘薯漿和甘薯渣掃描電鏡照見圖1。

表4 甘薯渣主要組成成分(干基)

圖1 甘薯漿和甘薯渣掃描電鏡照

由表4可以看出，甘薯渣中淀粉質(zhì)量分數(shù)高達54.6%，與文獻報道一致，根據(jù)淀粉提取工藝水平不同，甘薯渣中殘余淀粉質(zhì)量分數(shù)一般為41.45%～67.53%[15-17]，如直接丟棄將成為污染環(huán)境的主要COD來源，如作為培養(yǎng)微生物的原料，能為微生物提供充足碳源維持生長。另外，甘薯渣中粗纖維質(zhì)量分數(shù)也較高，達到了25.42%。如圖1所示，在未提取過淀粉的甘薯漿中，淀粉顆粒存在于纖維素、果膠等多糖形成的細胞壁中，而提取淀粉后的甘薯渣中仍殘余大量淀粉顆粒，且基本都包埋于堆積的細胞壁中，很難再進一步提取出來。同時，甘薯渣中的蛋白質(zhì)量分數(shù)則很低，僅有2.85%。因蛋白質(zhì)含量低、粗纖維含量高，導致適口性差、營養(yǎng)價值低，而不適宜直接作為家畜飼料使用。

3.2 釀酒酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

3.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)條件優(yōu)化

甘薯渣中蛋白質(zhì)含量較低，為保障微生物在其中快速生長，本研究通過外加尿素的方式為微生物提供氮源，并通過微生物的生長將廉價的無機氮源轉(zhuǎn)化為易于被動物利用的微生物菌體蛋白。根據(jù)表1的試驗方案考察了以釀酒酵母為菌種時甘薯渣含水率、培養(yǎng)溫度、接種量和尿素添加量對產(chǎn)物真蛋白含量的影響。試驗結(jié)果見表5。

表5 釀酒酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

由表5可見，影響產(chǎn)物真蛋白含量的主次因素順序為C、A、B、D，即接種量對培養(yǎng)產(chǎn)物中真蛋白含量的影響最大，其次是甘薯渣的含水率和培養(yǎng)溫度，二者對蛋白質(zhì)含量也有顯著影響，而尿素的添加量對菌體蛋白生產(chǎn)影響較小，其極差R分別為1.42，0.91，0.79和0.32。各因素的優(yōu)水平組合為A2B3C3D3，即薯渣含水率75%，培養(yǎng)溫度32℃，接種量10%，尿素添加1.5%，在該條件下培養(yǎng)甘薯渣，產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分數(shù)可達到9.46%。

3.2.2酶添加優(yōu)化

甘薯渣中剩余的大量的纖維素與果膠具有較強的吸水性與持水性，導致甘薯渣黏度大，培養(yǎng)過程中傳質(zhì)傳熱困難。此外，甘薯渣中淀粉質(zhì)量分數(shù)高達54.6%，其中75%左右為支鏈淀粉[18]，支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵不易被糖化酶水解，異淀粉酶能專一性地切開支鏈淀粉分支點的α-1,6-糖苷鍵，可剪下整個側(cè)支，形成直鏈淀粉，有助于淀粉糖化迅速且完全[19]。因此選用異淀粉酶、纖維素酶和果膠酶這三種酶處理薯渣。根據(jù)表2的試驗方案，考察了異淀粉酶、纖維素酶、果膠酶對產(chǎn)物真蛋白含量的影響。試驗結(jié)果見表6。

表6 酶添加正交試驗結(jié)果

由表6可見，從真蛋白含量的R值可以看出，影響真蛋白含量的因素排列順序為B>A>C，其中，B和A的影響較顯著，C則不顯著。說明培養(yǎng)過程中纖維素的水解對蛋白質(zhì)含量影響最大，當纖維素酶添加量為0.5%時最有利于提高培養(yǎng)飼料中的蛋白質(zhì)含量，一方面與纖維素酶水解纖維素提供易于被微生物利用的葡萄糖有關(guān)，另一方面可能與纖維素酶可降低甘薯渣的黏度有關(guān)，黏度下降有利于酵母的擴散、傳質(zhì)、傳熱，使酵母保持較高的活力，從而增加繁殖速度，積累菌體蛋白?；谑碓欣w維素含量較高這一特點，產(chǎn)纖維素酶的微生物常被研究者采用與酵母菌混合培養(yǎng)。贠建民利用白地霉∶產(chǎn)朊假絲酵母∶釀酒酵母按8∶1.5∶0.5比例接種，混合培養(yǎng)55 h，真蛋白質(zhì)量分數(shù)由培養(yǎng)前的4.08%提高到培養(yǎng)產(chǎn)物中的16.52%[11]。趙華采用黑曲霉、里氏木霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母四種菌株進行混菌固態(tài)培養(yǎng)甘薯渣，粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)從6.37%提高到9.75%[20]。雖然產(chǎn)纖維素酶微生物的應(yīng)用往往可以提高蛋白質(zhì)含量，但是產(chǎn)酶的穩(wěn)定性、霉菌產(chǎn)生的霉腐異味、霉菌的食用安全性以及培養(yǎng)步驟和控制條件的復雜性等均易造成飼料品質(zhì)的不可控。相較之下，本研究的酵母菌加0.5%的纖維素酶和0.5%的異淀粉酶培養(yǎng)，甘薯渣中真蛋白由培養(yǎng)前的2.85%提高到12.01%，增幅達321%，且所用酶制劑價格低廉，效果穩(wěn)定，在提高飼料蛋白質(zhì)的同時使產(chǎn)品品質(zhì)更有保證。另外，異淀粉酶對培養(yǎng)飼料中蛋白質(zhì)含量的影響也較大，R值為0.63，而果膠酶的影響則相對較小。由極差分析結(jié)果所得的最優(yōu)水平為A4B4C4，因為最優(yōu)組合A4B4C4中酶的使用種類最多，使用量也最大，而蛋白質(zhì)產(chǎn)量較組合A3B3無顯著優(yōu)勢，因此，綜合成本和蛋白質(zhì)產(chǎn)量考慮，我們選擇A3B3即0.5%的纖維素酶和0.5%的異淀粉酶為最適酶添加組合。

綜上所述，釀酒酵母的最佳培養(yǎng)條件為：甘薯渣含水率75%，培養(yǎng)溫度32℃，接種量10%，尿素添加1.5%，同時添加0.5%的纖維素酶和0.5%的異淀粉酶，其培養(yǎng)產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分數(shù)達到12.01%。

3.3 產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)以上試驗，確定了酶處理甘薯渣的最佳添加組合為分別添加0.5%的纖維素酶和異淀粉酶，以及甘薯渣固態(tài)培養(yǎng)的最適含水率為75%，在此基礎(chǔ)上，按L4(23)正交設(shè)計，研究了產(chǎn)朊假絲酵母在不同培養(yǎng)溫度、接種量及尿素添加量條件下對甘薯渣中真蛋白含量的影響，結(jié)果見表7。

表7 產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果

表7結(jié)果顯示，以產(chǎn)朊假絲酵母單菌培養(yǎng)時影響甘薯渣真蛋白含量的主次因素順序為：培養(yǎng)溫度、接種量、尿素添加量，其極差R分別為2.05、1.1 和0.38。優(yōu)選方案培養(yǎng)溫度為32℃，接種量為10%，尿素添加量為1%，產(chǎn)物真蛋白質(zhì)量分數(shù)最高，為16.36%，高于釀酒酵母的真蛋白產(chǎn)量。

3.4 雙菌混合培養(yǎng)

以上單一菌種培養(yǎng)試驗表明，不同菌種對甘薯渣的真蛋白產(chǎn)量有不同影響。產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)產(chǎn)物中真蛋白含量最高，但其風味欠佳，培養(yǎng)后具有強烈的腐臭味，釀酒酵母的真蛋白產(chǎn)量次之，但培養(yǎng)后產(chǎn)物具有怡人的醇香和酯香味。為了兼顧蛋白質(zhì)含量和風味，對上述兩種酵母混合接種進行了研究。根據(jù)對釀酒酵母及產(chǎn)朊假絲酵母最優(yōu)培養(yǎng)條件比較分析后確定的適宜條件為：甘薯渣含水率75%，培養(yǎng)溫度32℃，尿素1%，纖維素酶0.5%和異淀粉酶0.5%。在此基礎(chǔ)上，以總接種量為10%設(shè)定了3個菌種配比：a(產(chǎn)朊假絲酵母∶釀酒酵母為4∶1)，b(產(chǎn)朊假絲酵母∶釀酒酵母為1∶1)和c(產(chǎn)朊假絲酵母∶釀酒酵母為1∶4)。

雙菌不同接種比例對甘薯渣真蛋白含量的影響見圖2。

圖2 雙菌不同接種比例對甘薯渣真蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，由于不同菌種組合中兩種菌的配比不同，使得組合固態(tài)培養(yǎng)甘薯渣的分解利用能力有所差異，只有組合b產(chǎn)物真蛋白含量高于單菌種培養(yǎng)的最高真蛋白含量。在產(chǎn)物風味方面，a無醇香味且有顯著腐臭味，b略有一些腐味，c有少許的醇香味。因此，在實際生產(chǎn)中以總蛋白產(chǎn)量為主時，可以雙菌混合培養(yǎng)或者為簡化工序僅接種產(chǎn)朊假絲酵母；以釀酒酵母為菌種時，則總蛋白產(chǎn)量稍少，但有良好的醇香風味。

4 結(jié)論

(1)通過正交試驗確定釀酒酵母的最佳培養(yǎng)條件為：甘薯渣含水率75%，培養(yǎng)溫度32℃，接種量10%，尿素1.5%，纖維素酶0.5%，異淀粉酶0.5%，其培養(yǎng)產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分數(shù)達到12.01%，且具有醇香風味。

(2) 產(chǎn)朊假絲酵母最佳培養(yǎng)條件為：甘薯渣含水率75%，培養(yǎng)溫度32℃，接種量10%，尿素1%，纖維素酶0.5%，異淀粉酶0.5%，其培養(yǎng)產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分數(shù)達到16.36%，但風味略差。

(3)當產(chǎn)朊假絲酵母∶釀酒酵母為1∶1時，培養(yǎng)產(chǎn)物真蛋白質(zhì)量分數(shù)最高，達18.08%，且可兼顧風味及蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

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Proteinfeedpreparationtechnologyfromsweetpotatoresidue

SHEN Wei-liang1,2,JIN Yan-ling1,2,DING Fan3,YU Jin-long3,FANG Yang1,2,TAN Li1,2,YI Zhuo-lin1,2,HE Kai-ze1,2,ZHAO Hai1,2

(1.Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology,Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China;2.Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610041,China;3.Mianyang Institute of Agricultural Science,Mianyang 621000,China)

Sweetpotato starch residue was used as the raw material to investigate the culture technology for protein production bySaccharomycescerevisiae,Candidautilisand the mixed strains.The results showed that the optimized culture conditions forSaccharomycescerevisiaewere as follows:natural pH,moisture content of sweetpotato residue75%,culture temperature 32℃,inoculum 10%,urea 1.5%,cellulase 0.5%,isoamylase 0.5%.Under these optimized conditions,true protein content in sweetpotato residue reached 12.01%.The optimized culture conditions forCandidautiliswere similar as that ofSaccharomycescerevisiaeexcept urea content (1%),true protein content in sweetpotato residue reached 16.36%.When the mixed strains were used,the optimized inoculation proportion was 1∶1,and the protein content in sweetpoato residue reached 18.08%.

sweetpotato;residue;microbial protein;feed

2017-09-13；

2017-11-28

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-10-B22)、中國科學院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室/環(huán)境微生物四川省重點實驗室開放研究基金(Y1D5031101)。

沈維亮(1982-)，男，博士，助理研究員，研究方向為甘薯產(chǎn)后加工。

靳艷玲(1981-)，女，博士，副研究員，主要研究以生化技術(shù)進行甘薯產(chǎn)后加工。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.12.011

S816.9

A

1003-6202(2017)12-0041-05

梅竹)