時(shí) 潔 耿曉康

鹽酸吉西他濱對非小細(xì)胞肺癌患者骨髓CD34+造血細(xì)胞的毒性研究

時(shí) 潔 耿曉康

目的探討非小細(xì)胞肺癌患者骨髓CD34+前體造血細(xì)胞在細(xì)胞毒藥物鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)下，發(fā)生細(xì)胞凋亡情況及DNA損傷修復(fù)信號通路上相關(guān)基因表達(dá)的變化。方法采用免疫磁珠法分選出80例非小細(xì)胞肺癌患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測其純度。用鹽酸吉西他濱(終末濃度為10 μg/ml)誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞凋亡，檢測誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率的差異。提取細(xì)胞RNA，利用基因芯片技術(shù)，將藥物誘導(dǎo)前后的CD34+細(xì)胞在DNA損傷修復(fù)信號通路的相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并分析比較。結(jié)果80份骨髓樣本CD34陽性率為(6.06±1.61)%；TNM分期不同的患者樣本間CD34的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。免疫磁珠法分選后，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+細(xì)胞的純度為(88.63±7.29)%； CD34+細(xì)胞在經(jīng)過鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)0 h、4 h、8 h、12 h后，凋亡率分別為(5±1.37)%、(18±4.76)%、(39±8.15)%、(56±9.64)%，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的凋亡率之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05?；蛐酒Y(jié)果顯示，骨髓CD34+細(xì)胞在鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)凋亡0 h與誘導(dǎo)12 h后相比，表達(dá)差異2倍以上的基因有13種，其中9種基因表達(dá)是升高的，4種基因表達(dá)降低。結(jié)論鹽酸吉西他濱可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者骨髓前體CD34+細(xì)胞發(fā)生凋亡，隨著藥物作用時(shí)間延長，細(xì)胞凋亡率上升；DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中，部分基因表達(dá)水平出現(xiàn)變化。

非小細(xì)胞肺癌；CD34；細(xì)胞凋亡；DNA 損傷

鹽酸吉西他濱廣泛用于局限晚期及晚期非小細(xì)胞肺癌的化療，是一種抗代謝類藥物，其作用機(jī)制有細(xì)胞周期特異性,主要作用于S期的細(xì)胞,在一定條件下也可以發(fā)揮阻止G1期向S期進(jìn)展的作用。該藥物有明顯的抗腫瘤效果，但同時(shí)也經(jīng)常出現(xiàn)骨髓抑制的不良反應(yīng)，白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板減少。而化療后骨髓抑制這種不良反應(yīng)的產(chǎn)生，主要與造血前體細(xì)胞對化療藥物的高度敏感性有關(guān)。本研究以非小細(xì)胞肺癌患者CD34+骨髓造血前體細(xì)胞為研究對象，體外試驗(yàn)中，分析其在鹽酸吉西他濱作用下細(xì)胞凋亡情況以及DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015 年1月至2015年12 月經(jīng)胸外科手術(shù)治療的的非小細(xì)胞肺癌患者80例，其中鱗癌40例,腺癌40例；男性58例,女性22例；年齡32～65歲,中位年齡49歲；Ⅰ期9例,Ⅱ期37例,Ⅲ期34例；術(shù)前均未行化療。因手術(shù)方式需要，患者術(shù)中均切除了部分肋骨，征得患者同意，切除的肋骨用于采集骨髓細(xì)胞。

1.2 骨髓CD34+細(xì)胞分離

將手術(shù)中切除的肋骨標(biāo)本，在無菌條件下，用生理鹽水沖洗及抽吸出骨髓細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。用含有10%FBS的分離緩沖液稀釋,用200目的濾網(wǎng)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液收集，清洗后重懸于適量體積生理鹽水中，緩慢加在Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液(相對密度1.077)液面上，用2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗2遍。接下來用免疫磁珠法(美天旎公司)分選出CD34+細(xì)胞。然后用含0.5%FBS、2 mmol/L EDTA的PBS重懸單個(gè)核細(xì)胞，使得終體積為300 μL。按照試劑盒的操作說明，分別加入100 μL FcR Blocking Reagent，100 μL CD34+microbeads混合均勻，然后置于4～8 ℃中，反應(yīng)30 min，終止后將細(xì)胞離心洗滌，洗滌后的細(xì)胞重新懸浮于500 μL的緩沖液中，將細(xì)胞懸液加入到預(yù)處理過的MACS-LS柱中(置于磁力架上)，使液體自然流出，然后再用緩沖液清洗3遍，之后將LS柱從磁場中移出，用5 mL緩沖液加壓沖洗LS柱，收集沖洗液，得到CD34+細(xì)胞。將CD34+細(xì)胞使用CD34-FITC抗體(德國美天旎)標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀(Becton Dickson)分別檢測每一例標(biāo)本分離前后CD34+細(xì)胞的純度。

1.3 鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及凋亡檢測分析

CD34+細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液(青霉素100 IU/ml,鏈霉素100 μg/ml,L-谷胺酰胺2 mmol/L)(GIBCO),37 ℃,5% CO2。調(diào)整細(xì)胞密度大約為106/ml。鹽酸吉西他濱(江蘇豪森)用RPMI-1640培養(yǎng)基配成，加入CD34+細(xì)胞中，使藥物最終濃度為10 μg/ml,加藥培養(yǎng)1 h后，洗滌細(xì)胞，除去藥物，將清洗后的細(xì)胞重新懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中，37 ℃,5% CO2培養(yǎng)。然后于不同的時(shí)間點(diǎn)(0 h、4 h、8 h、12 h)收獲細(xì)胞，用annexinV-FITC法(晶美生物公司)檢測CD34+細(xì)胞凋亡率。

1.4 細(xì)胞基因芯片雜交和化學(xué)發(fā)光檢測

將以上藥物處理0 h及處理12 h的骨髓CD34+細(xì)胞樣本各取105個(gè)細(xì)胞混合成為2組，混勻后從2組細(xì)胞中各取106個(gè)，2組均加入Trizol試劑(Invitrogen life technologies)提總RNA，然后使用NanoDrop?ND-1000和變性瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA濃度和純度。繼而反轉(zhuǎn)錄并合成cDNA，下一步分別用TrueLabeling-AMPTM線性RNA擴(kuò)增試劑盒、SuperArray ArrayGrade cRNA純化試劑盒Biotin-16-UTP(Roche)進(jìn)行cRNA標(biāo)記以及合成。將TrueLabeling-AMP制備所得的生物素標(biāo)記的cRNA樣品，置于0.75 mL預(yù)熱的GEAhyb雜交液之中，用Oligo GEArray?芯片進(jìn)行雜交，繼而使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒Chemiluminescent Detection Kit(SuperArray Bioscience)繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。

1.5 圖像采集和數(shù)據(jù)分析

用X膠片和掃描儀獲得化學(xué)發(fā)光的芯片圖。采用綜合型GEArray表達(dá)分析配套軟件(GEArray Expression Analysis Suite)進(jìn)行全面的芯片數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 CD34+在80例骨髓標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)，以及分選后CD34+細(xì)胞的百分率

流式細(xì)胞術(shù)分析80份骨髓樣本單個(gè)核細(xì)胞，CD34分子陽性表達(dá)率為(6.06±1.61)%。進(jìn)一步分析TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者樣本，其CD34陽性表達(dá)率分別為(6.02±1.67)%、(6.35±1.46)%、(5.81±1.79)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用免疫磁珠法分選后CD34+細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，獲得的總體樣本CD34+細(xì)胞的純度為(88.63±7.29) %。

2.2 鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)骨髓CD34+細(xì)胞凋亡

因部分樣本所獲取的CD34+細(xì)胞數(shù)量較少，不能滿足細(xì)胞凋亡檢測所需細(xì)胞量，因此本步驟中選取了CD34+細(xì)胞數(shù)量較多的20例樣本(其中鱗癌及腺癌各10例)進(jìn)行研究。流式細(xì)胞術(shù)檢測20例樣本中，CD34+細(xì)胞經(jīng)過鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)0 h、4 h、8 h、12 h后的凋亡率分別為(5±1.37)%、(18±4.76)%、(39±8.15)%、(56±9.64)%。經(jīng)單向方差分析分析，各時(shí)間點(diǎn)凋亡率之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05。

2.3 骨髓CD34+細(xì)胞在鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)0 h和誘導(dǎo)12 h后DNA損傷及修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)變化

骨髓CD34+細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)0 h及誘導(dǎo)12 h后的2組細(xì)胞，RNA量分別為2 160 ng和2 108 ng。A260/A280分別為1.82和1.87，A260/A230分別為1.97和2.06。DNA損傷信號通路基因芯片中，有DNA損傷信號通路的113個(gè)基因，包括ATR/ATM通路以及DNA損傷相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。本研究所檢測樣本顯示，骨髓中分離的CD34+細(xì)胞在鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)凋亡前與誘導(dǎo)12 h后相比，表達(dá)差異在2倍以上的基因有13種，其中9種基因表達(dá)是升高的，4種基因表達(dá)降低。見表1。

表1 骨髓CD34+細(xì)胞在鹽酸吉西他濱誘導(dǎo)0 h和誘導(dǎo)12 h后表達(dá)變化在2倍以上的DNA損傷及修復(fù)相關(guān)基因

3 討論

肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，是近年來我們國家的城市人口惡性腫瘤死亡的首要原因[1]。許多肺癌患者就診時(shí)已處于疾病晚期，臨床上治療晚期非小細(xì)胞肺癌主要通過化學(xué)治療。鹽酸吉西他濱是晚期肺癌患者常用的化療藥物之一[2-4]。化療后骨髓抑制是該藥物常見的不良反應(yīng)[5-7]，化療后骨髓抑制現(xiàn)象的發(fā)生，常與造血系統(tǒng)中的前體細(xì)胞對化療藥物的敏感性有關(guān)。來自動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)下，造血前體細(xì)胞可以發(fā)生DNA的損傷，然后可以繼發(fā)造血細(xì)胞的一系列復(fù)雜的修復(fù)事件，如DNA損傷的修復(fù)未能成功，細(xì)胞就會出現(xiàn)凋亡[8-10]。

本研究選取非小細(xì)胞肺癌患者的骨髓造血細(xì)胞為研究對象，用抗代謝藥物鹽酸吉西他濱進(jìn)行干預(yù)，我們觀察到，CD34+的造血祖細(xì)胞在藥物作用下，可以發(fā)生細(xì)胞凋亡，在本研究觀察的幾個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)凋亡率存在顯著性差異。

我們利用基因芯片技術(shù)，分別檢測CD34+骨髓細(xì)胞在鹽酸吉西他濱作用前后，DNA損傷通路的113個(gè)基因的變化。其結(jié)果表明，誘導(dǎo)凋亡前與誘導(dǎo)12 h后相比，表達(dá)差異在2倍以上的基因有13種，其中9種基因表達(dá)是升高的，4種基因表達(dá)降低。這些基因表達(dá)的變化提示細(xì)胞發(fā)生了一系列事件，促使細(xì)胞修復(fù)損傷，而嚴(yán)重的損傷無法修復(fù)，使部分細(xì)胞發(fā)生了凋亡。雖然我們無法辨別這些基因表達(dá)變化中，哪些是凋亡的啟動(dòng)因素，哪些是繼發(fā)于細(xì)胞凋亡事件。有相關(guān)研究表明，其他細(xì)胞毒藥物也可誘導(dǎo)骨髓CD34+細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡率高于CD34-的細(xì)胞，也同樣可以引起CD34+骨髓細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的變化，但和本研究所觀察到的具體基因存在一定差異，這與不同藥物的作用機(jī)理差異有關(guān)[11-12]。

綜上所述，鹽酸吉西他濱可以引起部分骨髓造血前體細(xì)胞發(fā)生DNA損傷修復(fù)，而未能完全修復(fù)的部分細(xì)胞會發(fā)生凋亡，這可以部分解釋化療引起的骨髓抑制，但詳細(xì)機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

[1] Swanton C,Govindan R.Clinical implications of genomic discoveries in lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2016,374(19):1864-1873.

[2] 魏 磊.吉西他濱和順鉑聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌的效果分析 〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2015,30(8):1166-1169.

[3] Hu X,Pu K,Feng X,et al.Role of gemcitabine and pemetrexed as maintenance therapy in advanced NSCLC:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials〔J〕.PLoS One,2016,11(3):e0149247.

[4] Pilkington G,Boland A,Brown T,et al.A systematic review of the clinical effectiveness of first-line chemotherapy for adult patients with locally advanced or metastatic non-small cell lung cancer〔J〕.Thorax,2015,70(4):359-367.

[5] 尹 梅,賴 寒,羅朝朗，等.吉西他濱單藥治療老年晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察〔J〕.腫瘤藥學(xué),2014,4(3):197-200.

[6] Liu J,Ji F,Li J,et al.Efficacies and toxicities of different platinum-based combination chemotherapies for patients with advanced non-small cell lung cancer〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2014，94(8):580-583.

[7] Infante JR,Papadopoulos KP,Bendell JC,et al.A phase 1b study of trametinib,an oral Mitogen-activated protein kinase kinase (MEK) inhibitor,in combination with gemcitabine in advanced solid tumours〔J〕.Eur J Cancer,2013 ，49(9):2077-2085.

[8] Xu G,Wu H,Zhang J,et al.Metformin ameliorates ionizing irradiation-induced long-term hematopoietic stem cell injury in mice〔J〕.Free Radic Biol Med,2015，87:15-25.

[9] Thys RG,Lehman CE,Pierce LC,et al.Environmental and chemotherapeutic agents induce breakage at genes involved in leukemia-causing gene rearrangements in human hematopoietic stem/progenitor cells〔J〕.Mutat Res,2015，779:86-95.

[10] Lin W,Yuan N,Wang Z,et al.Corrigendum:Autophagy confers DNA damage repair pathways to protect the hematopoietic system from nuclear radiation injury〔J〕.Sci Rep,2016，6:30095.

[11] 鄒 游,黃 丹,李小蘭,等.奧沙利鉑誘導(dǎo)人骨髓造血細(xì)胞凋亡及 DNA 損傷修復(fù)〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,44(6):617-621,628.

[12] Vandevoorde C,Vral A,Vandekerckhove B,et al.Radiation sensitivity of human CD34(+) cells versus peripheral blood T lymphocytes of newborns and adults:DNA repair and mutagenic effects〔J〕.Radiat Res,2016，185(6):580-590.

CytotoxicResponseofHumanMarrowHematopoieticCD34+ProgenitorCellsInducedbyGemcitabineHydrochlorideinPatientswithNon-smallCellLungCancer

SHIJie,GENGXiaokang.

EnshiCentralHospital,Enshi,445000

ObjectiveTo investigate human bone marrow hematopoietic CD34+ progenitor cells induced by gemcitabine hydrochloride in patients with non-small cell lung cancer,the apoptotic response and gene expression change of DNA damage signaling pathway.MethodsCD34+ hematopoietic cells were isolated and purified by MiniMACS immunomagnetic beads from mononuclear cells of bone marrow samples in 80 patients with non-small cell lung cancer.The purity of CD34 fractions was detected by flow cytometry.The CD34+ cells were treated by gemcitabine,after 0 h，4 h，8 h，12 h,the apoptosis rates were detected by flow cytometry,total RNA were extracted from the cells,and gene expression of DNA repair signaling pathway were analyzed by Oligo DNA damage signaling pathway microarray.ResultsThe percentage of CD34+ cells from 80 samples were(6.06±1.61)%；There was no significant difference in CD34 expression between patients with different TNM stages,P>0.05.After immunomagnetic isolation,purity of CD34+cells were (88.63±7.29) %.when treated by gemcitabine for 0 hour,4hours,8hours and 12 hours,the apoptosis rates of CD34+ cells were(5±1.37)%,(18±4.76)%,(39±8.15)%，(56±9.64)%,there were significant differences between them,P<0.05.In the detection of genes related to DNA repair signaling pathway,over two-fold differences of 13 genes between bone marrow CD34+cells treated for 0 hour and 12 hours,including 9 kinds of genes expression were higher in the latter than the former,4 kinds of genes expression were lower in the latter than the former.Conclusion

Human bone marrow hematopoietic CD34+ progenitor cells,in patients with non-small cell lung cancer,can be induced to apoptosis when treated by gemcitabine hydrochloride,the apoptosis rate can rise with time extended,accompanied by changes of gene expression levels of damage signaling pathway.

Non-small cell lung cancer;CD34;Apoptosis;DNA damage

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1797～1800)

445000 湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.017

R734.2

A

1001-5930(2017)11-1797-04

2016-11-09

2017-04-20)

(編輯：甘艷)