李秋玲 ，吳智艷 ，喬 潔 ，黃 巖 ，侯曉強

（1.廊坊師范學院，河北廊坊 065000；2.河北省高校食藥用菌資源開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北廊坊 065000；3.廊坊市食用菌技術(shù)重點實驗室，河北廊坊 065000）

基于ITS序列對野生大型真菌進行分子鑒定及系統(tǒng)地位研究

李秋玲1，2，3，吳智艷1，2，3，喬 潔1，2，3，黃 巖1，侯曉強1，2，3

（1.廊坊師范學院，河北廊坊 065000；2.河北省高校食藥用菌資源開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北廊坊 065000；3.廊坊市食用菌技術(shù)重點實驗室，河北廊坊 065000）

針對目前我國食用菌存在資源廣、利用少的問題，對采集于河北省廊坊市自然公園的7株大型野生真菌進行鑒定，為其開發(fā)利用與馴化栽培奠定基礎(chǔ)。提取子實體基因組DNA，利用PCR技術(shù)對其rDNA的ITS區(qū)段進行擴增并測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast比對。采用鄰接法對7株菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。鑒定結(jié)果：ZR-1和ZR-7為大肥蘑菇（Agaricus bitorquis）、ZR-3屬于傘菌屬（Agaricus julius），ZR-4屬于黏滑菇屬（Hebeloma sp.），ZR-5屬于傘菌屬（Agaricus sp.），ZR-8為罕見類群中國產(chǎn)地菇狀馬蒂奧洛菌（網(wǎng)孢地菇）（Mattirolomyces terfezioides≡Terfezia terfezioides），TYG-1為野生金針菇（Flammulina velutipes）。這些結(jié)果為野生資源利用奠定了基礎(chǔ)。

野生大型真菌；鑒定；ITS；系統(tǒng)地位

0 引言

野生大型真菌種質(zhì)資源的收集與鑒定是一項長期的基礎(chǔ)性研究工作。傳統(tǒng)的鑒定分類方法主要依據(jù)子實體形態(tài)、顏色、氣味和孢子特征等，一般直接觀察形態(tài)，或借助顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)[1]。大型真菌的形態(tài)特征不僅受到子實體的生長環(huán)境、生長時期等客觀因素的影響，而且形態(tài)性狀的選擇和判斷也受主觀因素的影響，因此具有一定的局限性和主觀性，并且同一個屬中不同種的菌絲特征和孢子形態(tài)雖有略微差異，即使在顯微鏡下觀察，也會因為其相似性而造成誤判，如蘑菇屬的不同種之間，其菌絲無鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象[2]，所以難以分辨。要將一株大型真菌準確鑒定到某一個種的水平比較困難，特別是同一個屬中，有些種菌絲和孢子形態(tài)特征極為相近，這就很難準確區(qū)分鑒定到種一級水平[3]。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，利用分子生物學方法，通過DNA序列比較分析，同時借助國際核酸數(shù)據(jù)庫的大量信息資源，有助于準確鑒定野生大型真菌，并且分子生物學技術(shù)鑒別種質(zhì)資源具有快速、準確等優(yōu)點。rDNA上的ITS（Internal Transcribed Spacer）序列長度一般在650～750bp之間，是中度保守序列，表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異較明顯，這些特征使ITS廣泛應(yīng)用于真菌物種的分子鑒定及遺傳多樣性研究[4]。

雖然我國野生大型真菌資源豐富，但開發(fā)利用得非常少。因此，結(jié)合分子生物學技術(shù)，采用一種準確、快速、有效的方法對野生大型真菌資源進行鑒定勢在必行。通過對采自廊坊自然公園的7株野生大型真菌子實體進行基因組DNA提取，進一步根據(jù)ITS序列進行核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank同源性檢索比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以期為野生大型真菌物種鑒定提供分子依據(jù)，為野生菌的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

7株野生大型真菌采集自廊坊自然公園，其中5株為新鮮子實體（圖1），2株為保存于廊坊師范學院生命科學學院實驗室標本。

1.2 試劑

化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑北京有限公司和OXIOD公司；分子生物學試劑，引物合成及序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

圖1 5株野生大型真菌的子實體圖片

1.3 DNA的提取及檢測

取少量子實體于1.5 mL的離心管中，DNA的提取反應(yīng)程序參照許峰等[5]的方法。提取的基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。取DNA樣品5μL進行凝膠電泳20 min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察基因組DNA的提取質(zhì)量并拍照記錄。

1.4 ITS-PCR擴增

ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作為引物，以提取的基因組DNA作為模板進行PCR擴增。擴增條件：95℃5min（預(yù)變性）；95℃30s，58℃1min，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。反應(yīng)體系為50 μL。PCR反應(yīng)完成后進行電泳檢測。

1.5 ITS基因測序及分析

PCR產(chǎn)物切膠回收后送北京生工測序部測序。將菌株的ITS序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行比較，并用MEGA4.0.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。用Alignment程序?qū)π蛄羞M行多重對位排列，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)抽樣1000次分析系統(tǒng)樹各分枝的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取

取5μL提取的基因組DNA樣品，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，基因組DNA樣品條帶明亮清晰，無拖尾現(xiàn)象，說明提取的基因組DNA可用于后續(xù)實驗。

圖2 基因組的電泳圖

2.2 ITS擴增結(jié)果

以提取的基因組DNA為模板，選取2個通用引物進行PCR擴增ITS序列，結(jié)果如圖3所示，所得產(chǎn)物片段大小700 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相一致，條帶單一，表明擴增結(jié)果較好，可用于后續(xù)測序分析。

圖3 ITS片段擴增結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將7個樣品測得的ITS序列與通過BLAST檢索比對，從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得30個與供試菌株具有較高相似度的物種（表1）。

對7個樣品ITS序列及相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明30個ITS序列聚為4類，分別為傘菌屬（Agaricus）、黏滑菇屬（Hebeloma）、地菇屬（Terfezia）和金針菇屬（Flammulina）。ZR-1、ZR-3、ZR-5和 ZR-7是傘菌屬（Agaricus），其中 ZR-1和ZR-7與Agaricus bitorquis聚在一起，鑒定為大肥蘑菇，ZR-3與 Agaricus julius聚在一起，ZR-5與 A－garicus sp.聚在一起，鑒定為擬雙環(huán)林地蘑菇。ZR-4與Hebeloma sp.聚在一起，ZR-8 與Mattirolomyces ter－fezioides ≡ Terfezia terfezioides聚在一起，鑒定為罕見類群中國產(chǎn)地菇狀馬蒂奧洛菌（網(wǎng)孢地菇），TYG-1與Flammulina velutipes聚在一起，鑒定為野生金針菇。

表1 與供試7個未知真菌ITS序列最相似的物種

3 討論

利用ITS序列對大型真菌包括食藥用菌、外生菌根菌進行分類鑒定和分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究越來越受到人們的關(guān)注[7-9]。研究者對東亞鵝膏菌[10]、日本鵝膏菌[11]及各種鵝膏菌標本[12-13]的系統(tǒng)發(fā)育和一些鵝膏菌[14]的純培養(yǎng)菌種進行了分子鑒定，這些研究從分子水平對鵝膏菌屬大型真菌的自然分布群體、屬內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等進行了系統(tǒng)研究。另外，Masaki等[15]，采用ITS-RFLP方法通過限制性內(nèi)切酶酶切研究了不同香菇菌株間的親緣關(guān)系。楊永彬等[16]對福建13個香菇主要栽培品種進行了ITS系統(tǒng)發(fā)育分析。黃晨陽等[17]分析了側(cè)耳屬16個種不同菌株間ITS序列?？梢?，ITS分析用于研究不同品種的親緣關(guān)系也日趨成熟。本研究利用大型真菌rDNA ITS區(qū)段的保守性，同時借助GenBank數(shù)據(jù)庫的大量信息，在分子水平上對采自廊坊自然公園的7株真菌的ITS序列進行了BLAST比對，結(jié)果表明，這幾株野生大型真菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列同源性達到99%。

圖4 根據(jù)ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

野生食藥用菌種質(zhì)資源的收集與鑒定是其開發(fā)利用的前提。田慧敏等[18]利用形態(tài)學及ITS序列鑒定了赤峰地區(qū)5個未知真菌。筆者采集的7株野生大型真菌中，有1株屬于黏滑菇屬（Hebeloma sp.），4株屬于傘菌屬（Agaricus）。傘菌屬的食用菌是當前全球性食用菌產(chǎn)業(yè)中栽培面積最大、產(chǎn)量最高的食用菌品種。傘菌屬大型真菌大多數(shù)品種可以食用或藥用，但真正廣泛栽培的僅有雙孢蘑菇（A.bisporus）和大肥菇（A.bitorquis）[19]。因此，野生傘菌屬資源的開發(fā)利用還有很大空間。

ITS序列是位于rDNA編碼基因18S、5.8S和28S之間的小基因片段[20]，由于ITS區(qū)在進化中承受的自然選擇壓力較小，能容忍更多的變異，因此在大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了較為廣泛的序列多態(tài)性[21]。雖然本研究中7株大型真菌序列與數(shù)據(jù)庫中同源性高達99%，但仍然有單核苷酸突變，將來可進一步研究其單核苷酸突變與性狀的關(guān)系。本研究根據(jù)ITS基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，傘菌屬的4種大型真菌親緣關(guān)系較近，與黏滑菇屬的大型真菌親緣關(guān)系較遠。黃龍花等[22]對20株靈芝的ITS序列進行了測定分析，將形態(tài)學特征難以區(qū)分的靈芝屬的菌株進行了有效分類。戴璐等[23]同樣用ITS序列測定與分析對秦嶺冷水溝的10株羊肚菌進行了鑒定。Ro等[24]對12株不同的杏鮑菇進行了ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析。因此，ITS序列分析在已知的不同品種的親緣關(guān)系研究方面有著重要的地位。

4 結(jié)論

本研究中的野生大型真菌是在廊坊自然公園人員稀少處獲得的，對廊坊地區(qū)野生資源的收集有一定的意義。因目測無法辨別其遺傳地位，因此利用ITS序列分析方法，對采集的菌株生物學地位未知的野生大型真菌進行了序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，為這7種野生菌的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)ITS序列分析的分子生物學方法，對形態(tài)學上不易辨別的野生大型真菌進行遺傳學鑒定，這表明利用分子生物學方法與形態(tài)學方法相結(jié)合確定物種的生物學遺傳地位，是可行和有效的。

［1］馮曉宇，鄒莉，王志英，等.內(nèi)蒙古野生銀白離褶傘子實體組織分離試驗［J］.中國食用菌，2010，29（3）：13-14.

［2］楊新美.食用菌研究法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，1998.

［3］張國廣，鄒金美，鄭琳，等.一株野生大型真菌的ITS分析及生物學特征研究 ［J］.云南民族大學學報 （自然科學版），2010，17（6）：395-399.

［4］李晶，林雄杰，林占熺.一株野生大型真菌的形態(tài)鑒定及ITS序列分析［R］.福建：第九屆全國藥用真菌學術(shù)會議暨藥用真菌專業(yè)組織成立三十周年慶，2009.

［5］許峰，劉宇，王守現(xiàn)，等.一種適于PCR反應(yīng)的快速提取食用菌基因組 DNA 提取方法［J］.生物技術(shù)，2011，21（2）：43-44.

［6］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA：Molecular Evolutionary Genetics Analysis （MEGA）Software Version 4.0 ［J］.Mol.Niol.Evol.，2007，24（8）：1596-1599.

［7］ Avin FA，Bhassu S，Shin TY，Sabaratnam V.Molecular classification and phylogenetic relationships of selected edible Basidiomycetes species ［J］.Mol Biol Rep，2012，39 （7）：7355-7364.

［8］ Bunyard B A，Chaichuchote S，NichoIson M S，et a1.Ribosomal DNA analysis for resolution of genotypic classes of Pleurotus［J］.Mycol Res，1996，100（2）：143-150.

［9］林曉民，李振岐，王少先.真菌rDNA的特點及在外生菌根菌鑒定中的應(yīng)用［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2005，14（2）：120-125.

［10］ Zhang L F，Yang J B，Yang Z L，et a1.Molecular phylogeny of eastern Asian species of Amanita （Agaricales，Basidiomycota）：taxonomic and biogeographic implications ［J］.Fungal Diversity，2004，17（1）：219-238.

［11］ Oda T，Tanaka C，Tsuda M.Molecular phylogeny of Japanese Amanita species based on nucleotide sequences of the internal transcribed spacer region of nuclear ribosomal DNA［J］.Mycoscience，1999，40（1）：57-64.

［12］ Wei B M，Yang Z L，Oberwinkler F.Molecular phylogenetic studies in the genus Amanita［J］.Canada Journal of Botany，

1998，76（7）：1170-1179.

［13］ Drehmel D，Moncalvo J M，Vilgalys R.Molecular phylogeny of Amanita based on large-subunit ribosomal DNA sequences：implications for taxonomy and character evolution ［J］.Mycologia，1999，91（4）：610-618.

［14］ Zhang P，Chen Z H，Hu J S，et a1.Production and characterization of Amanita toxins from a pure culture of Amanita exitialis［J］.FEMS Microbiol Lett，2005，252（2）：223-228.

［15］ Masaki F，Tadashi S，Yoko O.Genetic analysis of nuclear ribosomal DNA of Lentinula edodes ［J］.Mycoscience，2006，47（6）：347-350.

［16］楊永彬，蘭家細，謝福泉，等.基于香菇菌株rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.微生物學雜志，2010，30（4）：27-29.

［17］黃晨陽，陳強，高山，等.側(cè)耳屬主要種類ITS序列分析［J］.菌物學報，2010，29（3）：365-372.

［18］田慧敏，劉鐵志，文靜，等.基于形態(tài)學及ITS序列鑒定赤峰地區(qū)五個未知真菌［J］.食用菌學報，2017，24（1）：21-26.

［19］呂彩蓮，趙磊，陳有君，等.野蘑菇菌絲生長培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2011，（6）：36-41.

［20］陳劍山，鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（13）：3785-3786.

［21］ Wang P，Liu Y，Yin Y G，et al.Diversity of microorganisms isolated from the soil sample surround Chroogomphus rutilus in the Beijing region ［J］.Int.J.Biol.Sci.，2011，7（2）：209-220.

［22］黃龍花，楊小兵，張智，等.基于ITS序列分析鑒定靈芝屬菌種［J］.中國食用菌，2010，29（1）：55-57.

［23］戴璐，李峻志，李安利，等.基于ITS序列分析對秦嶺冷水溝羊肚菌的鑒定［J］.中國食用菌 2010，29（6）：45-46.

［24］ Ro HS，Kim SS，Ryu J S，etal.Comparative studies on the diversity of the edible mushroom Pleurotus eryngii：ITS sequence analysis，RAPD fingerprinting，and physiological characteristics［J］.Mycol Res，2007，（111）：710-715.

Molecular Identification and Analysis of Phylogenetic Position for

Seven Wild Fruitingbody-forming Fungi
LI Qiu-ling1,2,3,WU Zhi-yan1,2,3,QIAO Jie1,2,3,HUANG Yan1，HOU Xiao-qiang1,2,3（1.Langfang Teachers University,Langfang 065000,China;2.Edible and Medicinal Fungi Research Center of Hebei Universities,Langfang 065000,China;3.Langfang Key Laboratory of Edible Fungi Technology,Langfang 065000,China）

For the case of less domestication of the wild mushrooms in contrast with their abundant distribution at present time,this study identified seven wild mushrooms collected from Natural Park in Langfang city,Hebei province to lay the foundation for the exploitation,domestication,and cultivation of wild mushrooms.The Genomic DNA was extracted from fruiting body.Based on PCR,ITS regions of rDNA of the macrofungi were amplified using the special pairs of primers ITS1/ITS4 and sequenced.Further phylogenetic analysis based on the ITS sequence was conducted to confirm the genetic position of these fungi.The results showed that about 700 bp length fragment was amplified.Then the phylogenetic trees were constructed by neighbor-joining method.Phylogenetic analysis indicated that ZR-1 and ZR-7 areAgaricus bitorquis,ZR-3 is Agaricus Julius,ZR-4 is Hebeloma sp.,ZR-5 is Agaricus sp.,ZR-8 is Mattirolomycesterfezioides ≡ Terfeziaterfezioides,and TYG-1 is Flammulina velutipes.These results established an identification method for the wild fruitingbody forming fungi and laid the foundation of the application of these fungi.

wild macrofungi；identification；ITS；phylogenetic position

S184

A

1674-3229（2017）04-0053-05

2017-09-28

河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心（YF201411）；國家自然科學基金項目（31402056）；河北省高等學校青年拔尖人才計劃項目（BJ2014048）資助

李秋玲(1979-)，女，博士，廊坊師范學院生命科學學院副教授，研究方向：分子生物學。

吳智艷（1962-），女，廊坊師范學院生命科學學院教授，研究方向：微生物學。