李文嬌1,2,3,閻 俊1,2,杜 娟1,2,3,黃天嬌 1,2,3,盧 瑛1,2,3,4,5,6,7*

1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306

2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306

3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,上海 201306

4.農(nóng)業(yè)部冷庫及制冷設(shè)備質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心,上海 201306

5.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心,上海 201306

6.上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,上海 201306

7.食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)),上海 201306

蝦蟹等甲殼類和魚類水產(chǎn)品，因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是百姓餐桌上常見的食物。但是，水產(chǎn)品過敏可引起嚴(yán)重的健康問題，如過敏性皮炎、蕁麻疹、哮喘、過敏性鼻炎、口腔綜合癥、腸病綜合癥等，嚴(yán)重的會導(dǎo)致過敏性休克并危及生命[1]。甲殼類水產(chǎn)品的主要過敏原為原肌球蛋白（Tropomyosin，簡稱Tm），分子量35-38 kDa，對酸、熱、蛋白酶均有較強的耐受性，穩(wěn)定性較高[2]。通常，研究水產(chǎn)品的過敏原活性需要對其進行分離純化。傳統(tǒng)的純化蛋白方法有硫酸銨分級沉淀[3]、凝膠柱層析[4]、離子交換層析[5]、高效液相[6]等，它們均存在費時、操作復(fù)雜的缺點。

作為一種新型納米材料，磁珠能用于檢測毒素[7]、病毒[8]、細菌[9]等，也可用于分離特定生物分子[10]。磁性分離技術(shù)是以磁性微粒為載體，在外加磁場的定向控制下，利用磁性微粒表面的配體和受體間的特異性親和作用，可從復(fù)雜的原始生物體系中直接分離出目標(biāo)生物分子，具有簡單方便和高選擇性的雙重優(yōu)勢，為生物分子的快速分離和富集提供一種強有力的手段[11]。

本文以南美白對蝦的過敏原Tm及其特意性單克隆抗體為模式體系，選用2種不同的商業(yè)磁珠構(gòu)建免疫磁珠，利用親和純化法快速分離與純化蝦主要過敏原Tm，通過評價其純度和得率，比較了兩種磁珠對過敏原的純化效果。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

鮮活南美白對蝦購于上海臨港水產(chǎn)品市場；HRP-兔抗鼠IgG抗體（美國Invitrogen生命技術(shù)公司）；MES（2-嗎啉乙磺酸）、EDC［1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺］、NHS（N-羥基琥珀酰亞胺，美國Pierce公司）；A磁珠（PM3-008，上海奧潤微納新材料科技有限公司）；B磁珠（Bangs磁珠，東莞市漢諾生物技術(shù)有限公司）；0.22 μm PVDF膜（美國Millipore公司），甘氨酸、2-嗎啉乙磺酸（MES）、硼酸（BS）、15%SDS-PAGE預(yù)制膠、透析袋、非預(yù)染Marker（26610）和預(yù)染蛋白Marker（26616）、BCA蛋白定量檢測試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB，美國Sigma公司）；其他試劑如無特殊說明均為分析純。2A7H6單抗為本實驗室早期研究制備的抗體細胞株純化所得。

HPPS5001高性能納米粒度分析儀（英國Malvern公司）；JEM-1230透射電子顯微鏡（美國Lake Shore公司）；垂直混合器（HS-3，寧波新芝生物科技股份有限公司）；磁力架（上海奧潤微納新材料科技有限公司）；漩渦振蕩器（QL-901，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；超聲波清洗器（SK5200HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品）；mini-蛋白質(zhì)電泳儀（美國Bio-Rad公司）；半干式轉(zhuǎn)膜儀（AE-8135，日本ATTO公司）；凝膠掃描儀（UMAX，力廣科技股份有限公司）；冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

1.2 免疫磁珠的制備

參考Liu等[12]的NHS/EDC化學(xué)偶聯(lián)方法，將Tm的單克隆抗體2A7H6與磁珠化學(xué)偶聯(lián)。首先，分別取A和B兩種磁珠1 mg，用50 mM MEST溶液（含0.05%Tween-20，pH 5.2）洗滌3次，分別加入1.6 μg的EDC和NHS，混合均勻后室溫反應(yīng)30 min。然后用MEST洗滌磁珠3次，再用10 mM硼酸鹽緩沖液（簡稱BST，含0.05%Tween-20，pH 9.0）洗滌2次，分別加入25、50、75、100和125 μg的2A7H6抗體，室溫混合反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后收集上清液用于偶聯(lián)量測定。用BST洗滌3次后，加入500 μL封閉液（含1%BSA的BST溶液），室溫反應(yīng)30 min。最后，將免疫磁珠重懸在500 μL保存液（含0.05%NaN3和0.1%BSA的BST溶液）中，4℃冷藏備用。

1.3 原肌球蛋白富集液的制備

蝦類Tm的富集純化參照孫佳益等[13]的方法，并略作修改。首先將蝦肉制成丙酮粉，過夜抽提后進行硫酸銨濃縮，透析后得到Tm的富集樣本，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫磁珠分離純化原肌球蛋白

首先，取制備好的免疫磁珠，用500 μL 20 mM PBS溶液（pH 7.2）洗滌3次后，加入1 mg Tm富集液反應(yīng)30 min，然后回收上清液用于蛋白定量。接著用500 μL PBS洗滌磁珠2次，加入500 μL 20 mM甘氨酸-HCl緩沖液（pH 2.7）于垂直混合器上反應(yīng)，洗脫15 min。在收集洗脫液的離心管中提前加入適量的Tris-HCl緩沖液（pH 9.0），使洗脫液pH保持中性。洗脫后的免疫磁珠用MEST緩沖液洗滌4次后重懸在500 μL保存液中，4℃冷藏保存。

1.5 偶聯(lián)量的測定

以免疫磁珠制備以及免疫磁珠純化過敏原過程中回收的上清液作為樣本，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白含量。并根據(jù)下面公式計算得到偶聯(lián)量和偶聯(lián)率：

抗體偶聯(lián)量（μg）=加入的抗體的量-上清中的抗體量

抗體的偶聯(lián)率（%）=（加入的抗體量-上清中的抗體量）/加入的抗體量

1.6 SDS-PAGE和Western blot

采用SDS-PAGE和Western-blot分別鑒定Tm的純度和特異性。用15%的預(yù)制膠進行電泳，考馬斯亮藍（CBB）染色后，用凝膠掃描儀拍照成像。另取電泳后的凝膠，用半干式電轉(zhuǎn)印法[14]將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，加入封閉液（含1%BSA的PBS，pH 7.2）反應(yīng)1 h。用PBST洗滌3次后分別和單抗2A7H6、HRP-兔抗鼠二抗（1:5000稀釋）室溫反應(yīng)1 h，最后用DAB底物溶液顯色并拍照。

1.7 磁珠粒徑測試和形貌表征

利用馬爾文動態(tài)光散射粒度儀（DLS）測試磁珠偶聯(lián)抗體前后的水力學(xué)粒徑；采用JEM-1230透射電子顯微鏡對免疫磁珠表面形貌進行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體偶聯(lián)效率

為比較兩種磁珠的抗體偶聯(lián)效率，我們設(shè)置了5個添加量的抗體分別與兩種磁珠（A、B）進行偶聯(lián)。通過BCA定量，分別得到A、B免疫磁珠的偶聯(lián)量和偶聯(lián)率結(jié)果，如圖1所示。由圖1（a）可見，兩種免疫磁珠的抗體偶聯(lián)量均與抗體添加量呈正比關(guān)系，且在任一抗體添加量下，A磁珠的抗體偶聯(lián)量均高于B磁珠。并且從圖1（b）中對比兩種磁珠偶聯(lián)率的結(jié)果可知，A磁珠的偶聯(lián)效率也明顯高于B磁珠。同時，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)2A7H6抗體添加量大于75 μg時，A、B磁珠的抗體偶聯(lián)率均隨著抗體添加量的增加而明顯降低?？贵w添加量在75 μg時偶聯(lián)率最高，但是偶聯(lián)的抗體總量低于100、125 μg，而偶聯(lián)的抗體越多越有利于后續(xù)的純化實驗，因此我們結(jié)合實際偶聯(lián)量并考慮經(jīng)濟因素，最終確定兩種磁珠最優(yōu)的抗體添加量為100 μg。

圖1 A、B磁珠的抗體偶聯(lián)量(a)和偶聯(lián)效率(b)比較Fig.1 Comparison of amount of coupling antibody(a)and coupling efficiency(b)of magnetic beadsAand B

2.2 過敏原的洗脫效果評價

圖2為免疫磁珠純化過敏原Tm的SDS-PAGE（左圖）和Western blot（右圖）結(jié)果。在CBB染色后的電泳圖中，條帶3、4分別是A和B免疫磁珠的洗脫液，分子量約為36 kDa，與報道相符合[15]。Western blot所用抗體2A7H6對甲殼類和部分軟體動物的主要過敏原Tm均有特異性反應(yīng)[16]，在Western blot（右圖）中可以清晰看到，36 kDa蛋白質(zhì)和2A7H6抗體有特異性反應(yīng)條帶，表明洗脫液中含有Tm過敏原。此外，Western blot圖中條帶3略深于條帶4，說明免疫磁珠B純化的抗原量少于免疫磁珠A。其純化效果見表2，免疫磁珠A可結(jié)合較多Tm，為免疫磁珠B的1.5倍；且免疫磁珠A的洗脫率也明顯高于B，約1.8倍。對于1 mg富集液樣本，免疫磁珠A純化Tm的得率是47.9%，為免疫磁珠B的3倍。由此得出，不同的免疫磁珠對目標(biāo)蛋白的純化效果有顯著差異。

圖2 原肌球蛋白過敏原的洗脫結(jié)果（左圖，SDS-PAGE；右圖，Western blot）1.粗蛋白提取液 Crude protein extract；2.過敏原富集液 Enrichment solution of allergen；3.免疫磁珠A分離的Tm Purified Tm by immunomagnetic beads A；4.免疫磁珠B分離的Tm Purified Tm by immunomagnetic beads BFig.2 Elution result of Tm(left,SDS-PAGE;right,Western blot)

表1 兩種免疫磁珠對過敏原的純化效果比較Table 1 Purification effects of Tm for immunomagnetic beads A and B

2.3 影響機制討論

為了解析兩種磁珠對Tm過敏原純化效果的差異性產(chǎn)生原因，我們對磁珠的粒徑和形貌進行了分析。磁珠A在偶聯(lián)抗體前后的平均水力學(xué)粒徑分別為184.9 nm和294.7 nm，多分散系數(shù)（PDI）由0.036變?yōu)?.051，呈現(xiàn)出較好的分散性。磁珠B偶聯(lián)抗體前后的平均水力學(xué)粒徑分別為375.6 nm和1002 nm，PDI由0.170變?yōu)?.451，分散性能變差，出現(xiàn)較明顯的團聚現(xiàn)象。圖3是兩種免疫磁珠的電鏡圖。圖中可以看出，免疫磁珠A呈單分散均勻分布，而免疫磁珠B則呈現(xiàn)較多粒子團聚，分散性能差。一些研究已發(fā)現(xiàn)，磁珠的形狀、粒徑等對免疫層析實驗影響較大，單分散性能差的免疫磁珠會發(fā)生堵塞現(xiàn)象[17-19]。因此，我們推測以A、B兩種磁珠制備的免疫磁珠純化過敏原Tm，其純化效果的顯著差異主要是由于這兩種磁珠的分散性能引起的，B磁珠偶聯(lián)抗體時出現(xiàn)團聚降低了抗體偶聯(lián)效率，從而影響其純化效果。

圖3 免疫磁珠的電鏡照片，比例尺為200 nm（左圖，免疫磁珠A；右圖，免疫磁珠B）Fig.3 TEM images of immunomagnetic beadsA(left)and B(right).The scale is 200 nm.

3 結(jié)論

磁分離技術(shù)具有反應(yīng)時間短、操作簡便、所得抗原純度高等優(yōu)點，其在免疫檢測、細胞分離、生物大分子純化和分子生物學(xué)等方面得到了越來越廣泛的應(yīng)用。本研究比較了兩種商業(yè)磁珠制備成的免疫磁珠對目標(biāo)抗原的純化性能，結(jié)果表明磁珠A的抗體偶聯(lián)量高于磁珠B，且免疫磁珠A對抗原的純化產(chǎn)量約為B的3倍。此外，我們發(fā)現(xiàn)磁珠的粒徑、單分散性對于磁性納米材料應(yīng)用于純化活性物質(zhì)有重要的影響。整個純化過程在1 h內(nèi)，極大地縮短了過敏原純化的時間，為以后過敏原的純化提供了一定的理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。

[1]Madsen CB,Hattersley S,Allen KJ,et al.Can we define a tolerable level of risk in food allergy?Report from a EuroPrevall/UK food standards agency workshop[J].Clinical and Experimental Allergy,2012,42:30-37

[2]Rao PVS,Rajagopal D,Ganesh KA.B-and T-cell epitopes of tropomyosin,the major shrimp allergen[J].Allergy,1998,53(46):44?47

[3]Lee EG,Lee SH,Baek PJE,et al.Efficient recovery of recombinant human erythropoietin from milk of transgenic pigs by two-step pretreatment[J].Biotechnology&Bioprocess Engineering,2008,13(2):189-196

[4]胡曉苗,余為一,張丹俊.犬血清IgG的純化、抗體制備及其鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(21):8940-8940

[5]WangY,Zhang P,Liu S,et al.Purification of IgG from sera of rabbit and guinea pig by flow-through mode ion-exchange chromatography using DEAE sepharose fast flow column[J].Chromatographia,2011,74:209-214

[6]Wildner GF,Fiebig C,Dedner N,et al.The use of HPLC for the purification of the Qв-protein[J].Zeitschrift Für Naturforschung C,1987,42(6):739-741

[7]謝 芳,賴衛(wèi)華,史愛武,等.免疫磁珠富集結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附法檢測醬油中黃曲霉毒素B1[J].食品科學(xué),2013,34(18):165-169

[8]張永江,馬 潔,李桂芬,等.應(yīng)用納米磁珠實時熒光PCR檢測非洲木薯花葉病毒[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013,29(6):203-207

[9]余曉峰,張 萍,宗 凱,等.免疫磁珠法檢測脫水蒜制品中沙門氏菌[J].食品科學(xué),2012,24:257-259

[10]山 珊,牛瑞江,賴衛(wèi)華,等.免疫磁珠法富集沙門氏菌的優(yōu)化及應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技,2013,34(13):153-156

[11]李貴平,張 輝,汪 勇.磁性納米微粒在磁性分離技術(shù)中的應(yīng)用進展[J].放射免疫學(xué)雜志,2005,18(5):380-383

[12]Liu Y,Zhang Z,Wang Y,et al.A highly sensitive and flexible magnetic nanoprobe labeled immunochromatographic assay platform for pathogen Vibrio parahaemolyticus[J].International Journal of Food Microbiology,2015,211:109-116

[13]孫佳益,王錫昌,李振興,等.蝦類原肌球蛋白的Balb/c小鼠致敏動物模型構(gòu)建研究[J].免疫學(xué)雜志,2013,2:161-164

[14]Renner SW.Immunoblotting and dot immunobinding.Emerging techniques in protein immunochemistry[J].Archives of Pathology&Laboratory Medicine,1988,112(8):780-786

[15]Rosalia A,Grishina G,Bardina L,et al.Myosin light chain is a novel shrimp allergen,Lit v 3[J].Journal of Allergy&Clinical Immunology,2008,122(4):795-802

[16]Lu Y,Ohshima T,Ushio H,et al.Immunological characteristics of monoclonal antibodies against shellfish major allergen tropomyosin[J].Food Chemistry,2007,100:1093-1099

[17]Yan J,Liu Y,Wang Y,et al.Effect of physiochemical property of Fe3O4particle on magneticlateral flow immunochromatographic assay[J].Sensors&Actuators B Chemical,2014,197:129-136

[18]Thorek DLJ,Andrew T.Size,charge and concentration dependent uptake of iron oxide particles by non-phagocytic cells[J].Biomaterials,2008,29(26):3583-90

[19]Wang Y,Xu H,Wei M,et al.Study of superparamagnetic nanoparticles as labels in the quantitative lateral flow immunoassay[J].Materials Science&Engineering C,2009,29(3):714-718