朱麗華 林麗 蔣鵬 王立超 徐武 葉建仁

(南京林業(yè)大學，南京，210037) (南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學))

不同致病力松材線蟲的繁殖能力和移動能力比較1)

朱麗華 林麗 蔣鵬 王立超 徐武 葉建仁

(南京林業(yè)大學，南京，210037) (南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學))

通過黑松和馬尾松接種明確不同松材線蟲蟲株的致病力，進而對不同致病力蟲株的繁殖力、移動能力等生物學特性進行了比較。研究結(jié)果表明，蟲株AMA3C28和USA的致病力顯著強于C14-5和OKD-1，AMA3C28和USA接種35 d后，黑松枯萎率均達100%，而馬尾松枯萎率分別為75%和20%；C14-5和OKD-1對黑松和馬尾松無致病作用或有極弱的致病作用。接種35 d后，AMA3C28和USA在黑松苗內(nèi)的增殖能力顯著強于C14-5和OKD-1。在灰葡萄孢培養(yǎng)條件下，AMA3C28和USA的繁殖力、雌雄性別比例顯著高于OKD-1；強致病力蟲株AMA3C28和USA雌成蟲尾部均為指狀鈍圓，而弱致病力蟲株OKD-1和C14-5雌成蟲中分別28%和2%尾部具有尾尖突。AMA3C28和USA在黑松莖段內(nèi)遷移能力顯著強于C14-5和OKD-1。因此，松材線蟲在樹體內(nèi)的繁殖力及移動能力可能與其致病力有關。

松材線蟲；松樹；致病力；繁殖力；移動能力

松材線蟲病是松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種毀滅性森林病害[1]。1905年，松材線蟲病首次于日本發(fā)現(xiàn)，20世紀80年代，該病害傳入中國和韓國，隨后傳入葡萄牙和西班牙，逐漸成為最具危險性的全球性病害之一[2]。松材線蟲病自1982年傳入我國后不斷擴散蔓延，現(xiàn)已擴散至江蘇、安徽、浙江、云南、陜西、遼寧等17個省市[國家林業(yè)公告(2017年第4號)]，導致了嚴重的生態(tài)破壞和巨大的經(jīng)濟損失[3]。松材線蟲病涉及松材線蟲、傳播媒介、寄主松樹等多個因素相互作用，迄今，其致病機理尚未十分明晰。病原物的致病力是影響病害流行的關鍵因子之一。在過去幾十年中，許多松材線蟲蟲株被收集，不同松材線蟲蟲株間致病力分化明顯[4-5]，有些蟲株致病力甚至喪失，被歸為“無毒”蟲株。松材線蟲蟲株間的致病力差異可能與寄主、地理來源或環(huán)境因素有關[4-5]，也可能與其伴生細菌種類有關[6]，或與其分泌的纖維素酶活力[7]，或與其繁殖力有關[8-9]，但也有研究認為，松材線蟲的致病力與其繁殖力無關[10]，甚至呈負相關[11]。本研究首先對不同松材線蟲蟲株的致病力進行測定，在明確不同蟲株致病力的基礎上，對不同致病力蟲株的生物學特性，包括雌成蟲形態(tài)特征、性別比例、繁殖力、移動能力等進行了比較，旨在更全面地認識松材線蟲致病力分化的原因，為進一步闡明松材線蟲致病機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲株和松苗

來自松材線蟲原產(chǎn)地以及兩個松材線蟲病嚴重發(fā)生國的4株松材線蟲蟲株被用于比較研究，其中，AMA3C28為來自中國強致病力蟲株AMA3的近交系后代(近交20代)，OKD-1和C14-5為由日本引進的弱致病力蟲株，USA蟲株分離自松材線蟲原產(chǎn)地美國的木質(zhì)包裝箱，其致病力未知。所有蟲株來源詳見表1。所有蟲株使用前培養(yǎng)于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上，于冰箱4 ℃保存。

表1 供試松材線蟲及擬松材線蟲蟲株來源

致病力測定用松苗為3年生盆栽黑松(Pinusthunbergii)和馬尾松(P.massoniana)，使用前培養(yǎng)于南京林業(yè)大學森林保護系溫室。

1.2 松材線蟲的培養(yǎng)

將實驗室保存的上述蟲株在超凈臺下接入灰葡萄孢培養(yǎng)基上，封口后放入恒溫箱中25 ℃培養(yǎng)。5～7 d后，待灰葡萄孢快要吃盡時，用貝爾曼漏斗法分離線蟲。

1.3 松材線蟲致病力測定

取上述4株松材線蟲，采用皮接法對3年生黑松和3年生馬尾松盆栽苗進行接種，每蟲株接種松苗6～26株，接種線蟲數(shù)量為4 500條/株，以無菌水接種為對照。接種后的幼苗放置于28 ℃，光照18 h的溫室中培養(yǎng)，隔日澆水。觀察松苗的發(fā)病情況，記錄萎蔫癥狀出現(xiàn)的最早時間(針葉出現(xiàn)失水褪綠癥狀開始記錄)和各蟲株致萎蔫松苗數(shù)量，計算枯萎率((萎蔫數(shù)量/接種數(shù)量)×100%)。接種35 d后，采用貝爾曼漏斗法對黑松體內(nèi)線蟲進行再分離，24 h后，收集橡膠管底部液體，顯微鏡下統(tǒng)計線蟲數(shù)量。

1.4 松材線蟲在灰葡萄孢上的繁殖力及性別比例測定

在超凈臺中，將上述蟲株接入長滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。1周后，采用貝爾曼漏斗分離法分離線蟲。24 h后，將松材線蟲收集于無菌離心管中，3 500 r/min，離心3 min，棄上清液，無菌重懸，顯微鏡下計數(shù)線蟲的數(shù)量，調(diào)節(jié)濃度至5 000條/mL。用移液槍取20 μL線蟲懸浮液(約100條線蟲)接種于新鮮灰葡萄孢上，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每蟲株4皿，重復3次。1周后分離灰葡萄孢上的松材線蟲，在顯微鏡下統(tǒng)計線蟲數(shù)量和性別比例，并觀察雌成蟲尾部形態(tài)。

1.5 松材線蟲的移動能力測定

取3年生黑松當年生枝條，切成5 cm長莖段，用挑針在每個莖段頂部挖一小孔，每個孔的深度保持一致，立即用于試驗。將松枝下端插到盛有4 mL無菌水的15 mL錐形離心管中(離心管上部事先已剪去，保留約4 cm高度)，將20 μL混合齡的松材線蟲(約2 000條)懸浮液接種于莖段頂部小孔中。將接種過的莖段置于帶蓋的大塑料盒中，于培養(yǎng)箱中25 ℃保濕培養(yǎng)。分別于接種2、4、6、8、10、24、48、72 h后從離心管底部取水樣，顯微鏡下統(tǒng)計線蟲數(shù)量。每蟲株接種3根莖段，重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPadPrism分析軟件對各項數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同松材線蟲蟲株對黑松和馬尾松的致病力

將松材線蟲蟲株AMA3C28、USA、C14-5和OKD-1接種于3年生盆栽黑松苗，結(jié)果表明，不同松材線蟲蟲株對黑松的致病力不同。松材線蟲AMA3C28和USA接種的黑松苗于接種后第12天首先觀察到萎蔫癥狀，并且發(fā)病松苗數(shù)量逐日增加，35 d后發(fā)病率達100%；蟲株OKD-1和C14-5接種35 d后針葉與對照一樣依然保持健康嫩綠，無任何植株出現(xiàn)萎蔫癥狀，發(fā)病率為0(表2)。

表2 黑松苗和馬尾松苗接種不同松材線蟲蟲株后的結(jié)果

蟲株編號馬尾松接種數(shù)量/株最早出現(xiàn)萎蔫癥狀時間/d42d后枯萎率/%AMA3C28161575．0USA103520．0C14-526383．8OKD-124—0CK(無菌水)10—0

注：“—”表示沒有觀察到。

4個蟲株接種3年生盆栽馬尾松的試驗結(jié)果顯示，不同松材線蟲蟲株對馬尾松的致病力差異較大。AMA3C28和USA接種的馬尾松苗分別于接種后第15天和第35天首先觀察到萎蔫癥狀，42 d后發(fā)病率分別為75%和20%；C14-5接種的26株松苗中，有1株發(fā)病，發(fā)病率為3.8%，而OKD-1接種的松苗均無任何植株表現(xiàn)萎蔫癥狀(表2)。

2.2 不同松材線蟲蟲株在黑松體內(nèi)的繁殖力

接種35 d后，對黑松體內(nèi)線蟲進行再分離。結(jié)果顯示，蟲株AMA3C28和USA均在黑松體內(nèi)大量繁殖，線蟲數(shù)量平均分別達16 024條和41 173條；而OKD-1和C14-5未能在黑松體內(nèi)建立種群，僅分離到極其少量的線蟲(表3)。

表3接種35 d后不同松材線蟲蟲株在黑松苗體內(nèi)的繁殖數(shù)量

蟲株編號分離數(shù)量/株再分離線蟲數(shù)量/條AMA3C28316024±5780USA341173±20480C14-5311±17OKD-130±1CK——

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；—表示沒有分離。

2.3 不同致病力松材線蟲蟲株在黑松莖段內(nèi)的移動能力

將不同致病力松材線蟲接種黑松莖段，結(jié)果表明，不同致病力蟲株在黑松莖段內(nèi)的移動能力不同。強致病力蟲株AMA3C28和USA在接種后2 h分別有5和2條線蟲通過黑松莖段，72 h后累計通過黑松莖段的線蟲數(shù)量分別為203和98條；而弱致病力蟲株C14-5和OKD-1在接種6 h后分別有1和3條線蟲穿過黑松莖段，72 h后累計通過莖段的線蟲分別為29和20條。因此，可以看出強致病力線蟲AMA3C28和USA在黑松體內(nèi)移動的能力明顯強于弱致病力蟲株C14-5和OKD-1。

2.4 不同致病力松材線蟲蟲株雌成蟲尾部形態(tài)

通過對不同致病力松材線蟲蟲株雌成蟲尾部的觀察，發(fā)現(xiàn)強致病力蟲株AMA3C28和USA雌成蟲尾部均為指狀鈍圓。弱致病力蟲株OKD-1和C14-5大部分雌成蟲尾部形態(tài)為指狀鈍圓形，小部分雌成蟲尾部具有2～3 μm的尾尖突。統(tǒng)計結(jié)果表明，OKD-1中具尾尖突的雌成蟲數(shù)量占28.8%，C14-5中具尾尖突的雌成蟲數(shù)量占2.16%。

2.5 不同致病力松材線蟲蟲株在灰葡萄孢上的繁殖力和性別比例

取AMA3C28、USA、OKD-1和C14-5混齡線蟲接種在灰葡萄孢上，100條每皿，1周后分離線蟲，顯微鏡觀察并統(tǒng)計線蟲數(shù)量。結(jié)果表明，強致病力蟲株AMA3C28和USA在灰葡萄孢上的繁殖力大于弱致病力蟲株OKD-1，差異顯著(P<0.05)；AMA3C28和USA的繁殖力高于C14-5，但差異不顯著；兩株弱致病力蟲株OKD-1和C14-5繁殖量差異不顯著。繁殖1周后，蟲株AMA3C28平均線蟲量為(20 781±4 541)條，USA為(21 450±4 687)，C14-5為(12 428+1 883)條，OKD-1為(5 411±1 182)條。

對上述于灰葡萄孢上繁殖1周后的松材線蟲蟲株的雌雄成蟲比例進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，2株強致病力蟲株AMA3C28和USA的雌雄比例顯著大于2株弱致病力蟲株OKD-1和C14-5，差異顯著(P<0.05)。2株強致病力蟲株雌雄成蟲比例大于1，其中，AMA3C28和USA雌雄比例分別為(1.29±0.25)和(1.27±0.24)；2株弱致病力蟲株雌雄比例小于1，其中C14-5為(0.86±0.10)，OKD-1為(0.84±0.16)；而2株強致病力蟲株之間雌雄比例差異不顯著，2株弱致病力蟲株之間差異亦不顯著(表4)。

表4不同致病力松材線蟲蟲株在灰葡萄孢上的繁殖力和性別比例

蟲株編號繁殖力/條性別比例AMA3C28(20781±4541)a(1．29±0．25)aUSA(21450±4687)a(1．27±0．24)aC14-5(12428±1883)ab(0．86±0．10)bOKD-1(5411±1182)b(0．84±0．16)b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本研究比較了4株松材線蟲的致病力，并探討了不同致病力松材線蟲蟲株之間生物學特性的差異。通過對不對寄主松樹的接種試驗表明，試驗選取的4株松材線蟲致病力分化明顯。其中，AMA3C28和USA對黑松的致萎蔫率均達100%，而OKD-1和C14-5均未能導致黑松萎蔫。對馬尾松的接種試驗顯示，AMA3C28的致病力強于USA，C14-5致病力稍強于OKD-1。通過對兩種寄主的致病力測定，4株松材線蟲致病力從強到弱分別為AMA3C28、USA、C14-5、OKD-1。該試驗結(jié)果與Aikawa等[8]以及Mota等[12]的結(jié)果相似。Aikawa等的接種結(jié)果顯示，C14-5和OKD-1的致病力顯著低于其他測試蟲株，其中C14-5對黑松的致病力為5%，而OKD-1未能使黑松發(fā)病。Mota等[12]亦報道，C14-5對黑松的致病力明顯弱于葡萄牙蟲株。

關于松材線蟲繁殖力和移動能力與其致病力的關系，目前尚未十分明晰。有研究認為松材線蟲的繁殖力是影響松樹萎蔫病發(fā)生發(fā)展的關鍵因子，松材線蟲通常在侵染后10 d內(nèi)在松樹體內(nèi)大量繁殖，最終導致松樹死亡[13]，因此，較強的繁殖能力對其致病力有很大貢獻。Kiyohara和Bolla[4]的研究顯示，強致病力蟲株在灰葡萄孢上培養(yǎng)6 d后，其繁殖量是弱致病力蟲株的4倍。Wang et al.[14]發(fā)現(xiàn)強致病力蟲株的代時短于弱致病力蟲株，強致病力蟲株的種群增長速率快于弱致病力蟲株。朱麗華等[15]通過不同致病力蟲株雜交后代的致病力測定亦發(fā)現(xiàn)，松材線蟲致病力與其在松樹體內(nèi)的繁殖力存在正相關性。Mota et al.[12]的研究亦表明，弱致病力蟲株在樹體內(nèi)的繁殖力顯著低于強致病力蟲株(平均僅6條/g干質(zhì)量)。Aikawa和Kikuchi[8]認為，松材線蟲的致病力可以通過其在灰葡萄孢上或松樹枝段中的繁殖力進行初步判斷，松樹枝段可能比灰葡萄孢更適合于作為致病力評價的材料，因為線蟲取食活的松樹組織細胞并在松樹組織中建立種群的能力是確定其毒力水平的重要因素。但也有研究認為，松材線蟲的致病力與其繁殖力無關[10]，而Eo et al.[11]發(fā)現(xiàn)，松材線蟲的繁殖力與其致病力呈負相關。本研究中，強致病力蟲株在黑松苗內(nèi)增殖的線蟲平均數(shù)量顯著高于弱致病力蟲株。在灰葡萄孢上，強致病力蟲株產(chǎn)生的后代數(shù)量也比弱致病力蟲株更多，雌雄比例顯著大于弱致病力蟲株雌雄性別比例。

本研究中，與弱致病力蟲株相比，強致病力蟲株以更快的速度和更大的種群數(shù)量通過松樹莖段。Odani et al.[16]的研究表明，松材線蟲和擬松材線蟲的遷移擴散能力與線蟲毒力強弱之間有正相關性，Ichihara et al.[13]亦報道，強致病力蟲株較弱致病力蟲株在木質(zhì)部樹脂道和皮層組織中的擴散速度更快。但是，Togashi et al.[17]和Eo et al.[11]的研究結(jié)果與此相反，認為線蟲的致病力與其遷移能力無相關性。馬海賓等[18]認為，評價松材線蟲遷移運動能力與松材線蟲致病力的關系，應該綜合考慮松材線蟲分泌的致病性相關酶、群體遷移數(shù)量、繁殖力以及種源地等一系列因素。松材線蟲在樹體內(nèi)移動的能力與其致病力可能存在一定關系。

已有研究表明，松材線蟲可分為圓尾型(R型)和尖尾型(M型)。R型松材線蟲雌成蟲一般尾部末端鈍圓，無尾尖突，并且該類群中大部分個體無尾尖突。M型松材線蟲的雌成蟲均具有明顯的尾尖突，且該尾尖突經(jīng)灰葡萄孢人工培養(yǎng)也不消失。有關松材線蟲形態(tài)分化與致病性分化之間相互關系方面的研究未見報道。本研究觀察結(jié)果顯示，在灰葡萄孢培養(yǎng)條件下下，2株強致病力蟲株雌成蟲的尾部均為指狀鈍圓，而2株弱致病力蟲株中，小部分雌成蟲尾部具有尾尖突。

綜上所述，松材線蟲不同蟲株致病力不同，不同致病力蟲株在繁殖力、移動能力等方面差異較大，引起上述差異的本質(zhì)原因有待進一步深入研究。

致謝：感謝日本京都大學Yuko Takeuchi副教授友情贈送弱致病力松材線蟲蟲株。

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ComparisononFecundityandMigrationAbilityofBursaphelenchusxylophiluswithDifferentVirulence

Zhu Lihua, Lin Li, Jiang Peng, Wang Lichao

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China); Xu Wu, Ye Jianren(Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University)Journal of Northeast Forestry University，2017,45(12)：76-79.

Bursaphelenchusxylophilus；Pinusthunbergii； Virulence； Proliferation； Migration

1)江蘇省高校自然科學研究重大項目(15KJA220003)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)。

朱麗華，女，1970年10月生，南京林業(yè)大學林學院，副教授。E-mail:lhzhu@njfu.edu.cn。

葉建仁，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學)，教授。E-mail:jrye@njfu.edu.cn。

2017年7月20日。

潘 華。

S763

The virulence of different strains ofBursaphelenchusxylophiluswas determined by challenging withPinusthunbergiiandP.massoniana. The strains with different virulence were screened and their biological characteristics were compared. Strains AMA3C28 and USA were more virulent than C14-5 and OKD-1. The wilting ratio onP.thunbergiiwas 100% for 35 d after inoculation with AMA3C28 and USA, while onP.massonianawere 75% and 20%, respectively. C14-5 and OKD-1 had no or very weak pathogenicity on bothP.thunbergiiandP.massoniana. AMA3C28 and USA proliferated rapidly inP.thunbergiiseedlings 35 d after inoculation, which was significantly higher than that of C14-5 and OKD-1. The fecundity of AMA3C28 and USA was significantly higher than that of OKD-1 and C14-5 when feeding onB.cinerea. The sex ratio of male and female in AMA3C28 and USA was significantly higher than that in C14-5 and OKD-1. Difference was also observed in tail morphology of adult female between virulent and avirulent strains when feeding on Botrytis cinerea. For strong virulent strains (AMA3C28 and USA), 100% adult females had no terminal mucro. However, about 28% of adult females of OKD-1 had terminal mucro and 2% of adult females of C14-5 had terminal mucro. The migration ability of AMA3C28 and USA in the stem segment ofP.thunbergiiwas higher than that of C14-5 and OKD-1.