王歡 杜鳳國 蘭河 李玉峰

(吉林省林業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室(北華大學)，吉林省·吉林市，132013) (遼源市錦繡谷生態(tài)園藝有限公司)

觀果樹種輪生冬青離體快繁技術(shù)1)

王歡 杜鳳國 蘭河 李玉峰

(吉林省林業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室(北華大學)，吉林省·吉林市，132013) (遼源市錦繡谷生態(tài)園藝有限公司)

以輪生冬青幼嫩莖段為外植體，通過篩選啟動培養(yǎng)基、比較不同增殖培養(yǎng)基及繼代次數(shù)對增殖的影響，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選,建立了輪生冬青的離體快速繁殖技術(shù)體系。結(jié)果表明:最適腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.05 mg·L-1；適宜增殖培養(yǎng)基為B5+6-BA1.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1,第4次繼代時增殖系數(shù)最大為6.3，叢生芽長勢好；適宜的繼代周期為35 d；最佳生根培養(yǎng)基為1/2B5+IBA0.2 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1,生根率可達100%。移栽于V(珍珠巖)∶V(蛭石)∶V(腐殖土)=2∶1∶1的混合基質(zhì)中,成活率達90%以上。

輪生冬青；繼代次數(shù)；組織培養(yǎng)；植株再生

輪生冬青(Ilexverticillata)又名北美冬青，是冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬落葉灌木；雌雄異株，花小白色，數(shù)朵叢生于葉腋，密集鮮紅的漿果經(jīng)冬不落，是珍貴的觀果樹種。原產(chǎn)北美東部和加拿大東南部，喜生長于潮濕地區(qū)，在歐美國家普遍用作切枝觀果和園林景觀美化。輪生冬青具有很強的抗寒性、耐熱性，喜光梢耐陰，喜肥沃微酸性至中性土壤，喜溫暖濕潤環(huán)境，可在我國北至黑龍江南至福建的大部分地區(qū)生長[1]。近幾年來，國內(nèi)已開始大量引種栽培及園林應(yīng)用。

輪生冬青現(xiàn)多采用播種和扦插方式繁殖。其種子具有深休眠特性，未經(jīng)低溫層積處理的種子隔年發(fā)芽[2]，低溫冷藏結(jié)合80 ℃高溫處理種子，當年萌發(fā)率可達90%以上[3]，但種子繁殖后代的性狀不穩(wěn)定。目前，關(guān)于北美冬青扦插繁殖[4-8]研究較多，研究了插穗幼嫩程度及長度、不同生根劑及濃度、基質(zhì)等對北美冬青成活率的影響。6、7月將北美冬青結(jié)果枝環(huán)剝0.5～1.0 cm寬，以稀釋1/4～1/2的200 mg·L-1IBA+500 mg·L-1NAA的生根劑處理，可實現(xiàn)高空壓條繁殖[9]。但扦插和壓條繁殖受季節(jié)及樹齡等多方面限制，且需要大量插穗。輪生冬青現(xiàn)普遍采用播種和扦插進行繁殖[2-8],也可通過高空壓條繁殖[9]。但種子繁殖后代的性狀不穩(wěn)定，扦插和壓條繁殖受季節(jié)、樹齡及枝條質(zhì)量等方面限制。而通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)可采用較少的材料，實現(xiàn)周年生產(chǎn)。目前，利用該技術(shù)開展輪生冬青離體繁殖僅有少量報道。采用MS培養(yǎng)基，比較了不同外源激素對美洲冬青當年生枝條組培的影響[10]。張俊林等以北美冬青成年雌株半木質(zhì)化莖段為材料，建立了以WPM為基本培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)繁殖體系[11]。以北美冬青葉片和莖段為外植體，進行了愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究[12]。這些研究主要集中在離體快繁體系的構(gòu)建，僅研究了繼代培養(yǎng)一代的增殖率及生長分化情況，關(guān)于輪生冬青在組織離體培養(yǎng)過程中多次繼代的增殖系數(shù)及組培苗質(zhì)量等相關(guān)研究未見報道。本文在前人的研究基礎(chǔ)上，比較不同基本培養(yǎng)基、繼代周期及繼代次數(shù)對輪生冬青生長分化的影響，為其繼代增殖培養(yǎng)提供合理化建議，這將為實現(xiàn)輪生冬青的工廠化育苗、加快其推廣應(yīng)用等方面具有重要意義。

1 材料與方法

試驗材料及處理：試驗材料為吉林省遼源市錦繡谷生態(tài)園藝有限公司提供的由荷蘭引種栽培8年的扦插苗。2016年5月20日剪取生長健壯、無病蟲害的當年萌發(fā)的枝條，放在盛有清水的塑料燒杯中帶回實驗室。先將枝條置于流水下沖洗30 min，然后剪去葉片，留少許葉柄，參考范諸平等[13]對外植體的處理方法。先將枝條置于流水下沖洗30 min，然后剪去葉片，留少許葉柄，修剪成5～6 cm長的莖段,放在盛有洗潔精溶液的燒杯中浸泡20 min，其間不斷攪動，然后沖洗干凈洗潔精。最后在超凈工作臺上先用70%乙醇浸泡20～30 s,倒掉乙醇溶液再用0.1% HgCL2溶液浸泡6 min,無菌水反復(fù)沖洗5次。將消毒后的外植體修剪成帶1～2個芽的莖段,接種至誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的初代培養(yǎng)基上。

腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：采用L9(34)正交試驗設(shè)計篩選適宜輪生冬青芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。設(shè)計基本培養(yǎng)基分別采用WPM、B5和MS，細胞分裂素6-BA質(zhì)量濃度設(shè)為0.3、0.5、1.0 mg·L-1,IBA質(zhì)量濃度設(shè)為0、0.05、0.1 mg·L-1的三因素三水平正交試驗。每個處理接種20瓶。培養(yǎng)30 d后觀察腋芽生長情況，根據(jù)外植體萌發(fā)率、新梢長度篩選適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)：將腋芽萌發(fā)形成的新梢轉(zhuǎn)接到不同增殖培養(yǎng)基。根據(jù)外植體在不同初代培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化情況,增殖培養(yǎng)采用B5培養(yǎng)基,添加不同質(zhì)量濃度的6-BA(1.5和2.0 mg·L-1)和IBA(0.1和0.3 mg·L-1)。將初代培養(yǎng)獲得的嫩枝隨機地接種到不同增殖培養(yǎng)基，每個處理接種30瓶,分別繼代培養(yǎng)5次。培養(yǎng)周期為35 d,統(tǒng)計每代的平均增殖系數(shù),觀察記錄中間繁殖體的生長狀況。

生根培養(yǎng)挑選增殖培養(yǎng)獲得的高約3 cm健壯芽苗接種到以下生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基:(1)1/2WPM+IBA0.2 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1；(2)1/2WPM+NAA0.5 mg·L-1；(3)1/2B5+IBA0.2 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1；(4)1/2B5+IBA0.5 mg·L-1。每種處理接種20瓶,定期觀測根系生長情況，30 d統(tǒng)計生根率、不定根數(shù)量及長度等指標。

煉苗移栽：待不定根長至2 cm左右時挑選生長健壯、根系發(fā)達的組培苗，打開鋁箔紙，向培養(yǎng)瓶中注入少量自來水，在室內(nèi)自然光下煉苗3 d，用鑷子取出試管苗放在水盆里，小心洗掉根部附著的培養(yǎng)基，栽入已消毒的腐殖土、珍珠巖及蛭石的混合基質(zhì)中。保證濕度是移栽成活的關(guān)鍵，移栽前期每天少量多次噴施1/2B5大量元素的水溶液，30 d后統(tǒng)計移栽成活率。

培養(yǎng)條件：所有培養(yǎng)基的瓊脂質(zhì)量濃度均為6 g·L-1，蔗糖質(zhì)量濃度在芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為30 g·L-1、生根培養(yǎng)基為15 g·L-1，pH均為5.8。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強度約為2 000 lx,光照時間12 h·d-1。

數(shù)據(jù)處理：采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對腋芽誘導(dǎo)萌發(fā)的影響

接種10 d左右，不同處理均可見腋芽膨大，20 d開始陸續(xù)可見腋芽萌發(fā)展葉(圖1A)，但多數(shù)腋芽萌發(fā)抽出的嫩莖節(jié)間短。由表1可知，在基本培養(yǎng)基、6-BA質(zhì)量濃度及IBA質(zhì)量濃度3個因素中，生長素IBA質(zhì)量濃度是影響輪生冬青腋芽萌發(fā)及伸長生長的主要因素，基本培養(yǎng)基種類次之，6-BA質(zhì)量濃度影響最弱。隨著IBA質(zhì)量濃度升高，腋芽萌發(fā)率先升高后降低，同時發(fā)現(xiàn)隨著IBA質(zhì)量濃度升高，外植體基部形成的愈傷組織增大。3種基本培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，但MS的誘導(dǎo)效果較WPM、B5培養(yǎng)基差。從正交試驗分析結(jié)果得出，適宜輪生冬青誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基為B5+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.05 mg·L-1。

表1 培養(yǎng)基對輪生冬青腋芽誘導(dǎo)的影響

2.2 6-BA與IBA不同質(zhì)量濃度配比及繼代次數(shù)對輪生冬青增殖的影響

由表2可知,將初代培養(yǎng)中輪生冬青腋芽萌發(fā)的嫩枝接種到不同質(zhì)量濃度6-BA和IBA組合的B5培養(yǎng)基中,在最初的2次繼代培養(yǎng),增殖系數(shù)較小,主要以腋芽萌發(fā)抽枝為主；到第3次繼代培養(yǎng),3種處理的增殖系數(shù)均明顯增大,組培苗長勢健壯,葉片綠色,部分莖段葉腋處形成叢生芽(圖1B)；到第4代，6-BA與IBA比值較低的，增殖系數(shù)大于6，腋芽生長快，葉片綠色，在6-BA1.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1培養(yǎng)基增殖系數(shù)最大,新梢伸長生長明顯。而6-BA與IBA比值為15的培養(yǎng)基，增殖率開始降低，葉片窄小，芽叢生矮小，個別試管苗葉片透明、卷曲。隨著繼代次數(shù)增加,6-BA與IBA比值為5和6.7的2種組合，在第5次繼代培養(yǎng)時增殖倍數(shù)有所下降,芽苗基部形成致密的愈傷組織。同時在繼代培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，繼代周期30～35 d比較適宜，若時間過長，組培苗會逐漸出現(xiàn)黃化或莖尖枯死現(xiàn)象。從輪生冬青增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù)及組培苗生長分化情況綜合得出,適宜輪生冬青繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為B5+6-BA1.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1。

表2 不同質(zhì)量濃度6-BA、IBA對輪生冬青增殖的影響

注：增殖系數(shù)為平均值±標準差,同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

A.莖段腋芽萌發(fā)；B.增殖培養(yǎng)；C.生根培養(yǎng)；D.組培苗移栽成活。

2.3 不同生根培養(yǎng)基對輪生冬青生根的影響

在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d后，陸續(xù)可見從皮部產(chǎn)生白色不定根，培養(yǎng)20 d后，先分化的不定根上又長出大量須根，根系密被根毛(圖1C)。由表3可知，只使用NAA或IBA一種生長素，或兩種生長素同時使用,都能不同程度誘導(dǎo)輪生冬青生根。但單獨使用IBA，生根率低且生根時間長，根系生長慢，產(chǎn)生的不定根數(shù)量較少,而單獨使用NAA與NAA、IBA共同使用生根效果基本無明顯差異。大量元素濃度減半的WPM和B5培養(yǎng)基均可用作輪生冬青誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基，在生根后期發(fā)現(xiàn)1/2WPM培養(yǎng)基中，多數(shù)根系平展在培養(yǎng)基表面；而1/2B 5培養(yǎng)基中多數(shù)根系伸向培養(yǎng)基，個別根系平展在培養(yǎng)基表面。因此，從生根率及根系質(zhì)量綜合得出，輪生冬青適宜的生根培養(yǎng)基為1/2B 5+IBA0.2 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1。

表3 不同培養(yǎng)基對輪生冬青生根的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差,同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

將根系發(fā)育良好,枝葉健壯的再生植株移栽于已消毒的V(珍珠巖)∶V(蛭石)∶V(腐殖土)=2∶1∶1混合基質(zhì)中,加強養(yǎng)護管理，保證濕度及光照需求。移栽20 d左右,植株葉片變大，根系進一步發(fā)育，移栽成活率達90%(圖1D)。

3 結(jié)論與討論

在木本植物組織培養(yǎng)過程中，選擇適合的基本培養(yǎng)基對其誘導(dǎo)分化及器官再生至關(guān)重要。因此，本試驗中采用MS、B5和WPM3種培養(yǎng)基，通過正交設(shè)計初步篩選適合輪生冬青初代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為WPM或B5。而以MS為基本培養(yǎng)基的組合中，腋芽誘導(dǎo)率低。這可能是由于不同基本培養(yǎng)基所含有的營養(yǎng)物質(zhì)組成與含量差異造成的，由3種培養(yǎng)基所需大量元素的無機鹽組成可以看出，氧化態(tài)氮和還原態(tài)氮的含量差異較大。MS培養(yǎng)基中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均很高(NH4NO31 650 mg·L-1,KNO31 900 mg·L-1)，而WPM培養(yǎng)基(NH4NO3400 mg·L-1,Ca(NO3)2556 mg·L-1)、B5培養(yǎng)基(KNO32 500 mg·L-1,(NH4)2SO4134 mg·L-1)[14]硝態(tài)氮含量高,而銨態(tài)氮含量較低，可能是MS培養(yǎng)基較高的銨鹽濃度對輪生冬青的生長分化不利，產(chǎn)生了一定毒害作用。另外，氧化態(tài)氮與還原態(tài)氮的相對比例對培養(yǎng)物的細胞分裂及分化也具有顯著影響[15]，可能較高的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的比值有利于輪生冬青的誘導(dǎo)分化。

在植物離體快繁中，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、用量及配比對培養(yǎng)物的誘導(dǎo)分化起重要作用。在培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以改變和影響外植體的內(nèi)源激素水平，從而導(dǎo)致外植體在添加不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化能力差異很大[10-12,16-18]。本研究在啟動培養(yǎng)階段，選用不同質(zhì)量濃度的6-BA與IBA組合，腋芽萌發(fā)率隨著6-BA質(zhì)量濃度增大而提高，隨著IBA質(zhì)量濃度增大先提高后降低，正交試驗結(jié)果表明1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA為適宜誘導(dǎo)輪生冬青莖段啟動培養(yǎng)的最佳組合。在初代培養(yǎng)階段，外植體腋芽萌發(fā)率較高，但新梢伸長生長慢且節(jié)間短。植物生長素具有促進細胞伸長生長的作用，在繼代繁殖時通過提高IBA質(zhì)量濃度，促進了新梢的伸長生長，在B5+6-BA1.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1增殖培養(yǎng)基，輪生冬青增殖率最高，新梢高生長明顯，組培苗長勢好。

繼代次數(shù)是影響平均增殖倍數(shù)的重要因素之一。馬大雜種相思經(jīng)多次繼代培養(yǎng)，隨繼代次數(shù)增加，增殖倍數(shù)呈下降趨勢[16]。毛葉棗在前6代繼代培養(yǎng)時，隨繼代次數(shù)增加，增殖系數(shù)遞增，而后下降[17]。這與本實驗研究結(jié)果一致。在輪生冬青最初的幾代繼代培養(yǎng)過程中，隨繼代次數(shù)增加,增殖率逐漸提高,但繼代到5代時略有下降。這可能是由于培養(yǎng)物經(jīng)多次繼代培養(yǎng)在體內(nèi)積累了高濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，超過了其適宜分裂的濃度范圍從而抑制細胞分裂分化。同時楊增海認為組培苗在多次繼代培養(yǎng)過程中逐漸消耗了原有母體組織中存在的與器官形成的特殊物質(zhì)，致使分化能力降低或喪失[19]。因此，在生產(chǎn)實踐中，應(yīng)根據(jù)組培苗的生長狀況，及時調(diào)整培養(yǎng)基中植物細胞分裂素及生長素用量。尤其在經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)后，應(yīng)降低細胞分裂素的濃度，待增殖能力明顯下降或組培苗長勢變?nèi)鯚o法用于繼代培養(yǎng)時，需重新采集外植體進行新一輪離體培養(yǎng)。

組培苗黃化是在離體培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)基組成、環(huán)境條件及培養(yǎng)時間等因素引起的組培苗葉片部分或全部變黃[20]。在輪生冬青的離體繁殖過程中發(fā)現(xiàn)，繼代周期超過35 d，個別組培苗會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，但及時轉(zhuǎn)瓶，更換新鮮培養(yǎng)基，葉片又重新變綠，這可能與采用鋁箔紙作為封口材料導(dǎo)致瓶內(nèi)通氣不良，長時間不轉(zhuǎn)瓶糖已耗盡有關(guān)，具體原因有待進一步研究。

通常在離體培養(yǎng)誘導(dǎo)生根時，采用低鹽的培養(yǎng)基或?qū)⑴囵B(yǎng)基中的大量元素濃度降低，以利于根原基的形成及發(fā)育。同時對于絕大多數(shù)植物而言，添加生長素也是誘導(dǎo)生根必不可少的。Hidehiro等研究表明，在一定的IBA濃度范圍內(nèi)，內(nèi)源IAA含量隨著IBA濃度增加而增加；外源NAA能促進內(nèi)源IAA的合成,有利于根的形成[21]。在本實驗中,單獨使用IBA，生根時間長，根系生長慢；而單獨使用相同濃度NAA所形成的根系質(zhì)量與二者同時使用差異很小，這可能和前期繼代培養(yǎng)使用IBA有關(guān)。本試驗采用0.2 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA的組合,生根率達85%以上,根系發(fā)達，植株生長健壯。這與張俊林等對繼代培養(yǎng)的第6代組培苗未能誘導(dǎo)生根不一致[11]，這可能和植物來源及前期培養(yǎng)階段采用的培養(yǎng)基組成不同，尤其是與植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類及濃度配比具有一定關(guān)系。

本研究建立了高效的輪生冬青組培快繁技術(shù)體系，篩選出B5培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，在初代培養(yǎng)時，適宜添加6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.05 mg·L-1；繼代增殖培養(yǎng)階段，B5+6-BA1.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1培養(yǎng)基的增殖系數(shù)大，組培苗長勢好，但經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)后，應(yīng)根據(jù)組培苗的生長分化情況和生產(chǎn)需求調(diào)整6-BA和IBA的用量；生根誘導(dǎo)階段適宜采用1/2B5+IBA0.2 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1培養(yǎng)基，根系質(zhì)量好有利于移栽成活。這將為實現(xiàn)輪生冬青工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，有利于推動冬季觀果樹種在園林景觀上的應(yīng)用。

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Ilexverticillata; Subculture times; Tissue culture; Plantlet regeneration

1)中央財政林業(yè)科技推廣示范項目(吉推【2014】13號)。

王歡，女，1978年8月生，吉林省林業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室(北華大學)，副教授。E-mail：magnolia2009@126.com。

杜鳳國，吉林省林業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室(北華大學)，副教授。E-mail：dfg4656@qq.com。

2017年9月12日

潘 華。

Q943.1

We developed a fastinvitropropagation system forIlexverticillatawith the segments of tender stems as explants. We tested various culture media for inducing axillary buds and roots and for shoot multiplication, and studied the influences of subculture times and period on multiplication were studied. The results show that B5+6-BA1.0 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1was the optimal culture medium for inducing axillary buds. The optimal culture medium for shoot proliferation was B5+6-BA 1.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1, resulting in a maximum multiplication coefficient of 6.3 at the fourth subculture. Cluster buds grew well. Subculture period of 35 d was appropriate. The optimal culture medium for root induction was 1/2 B5+IBA0.2 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1. The rooting rate was 100%. After being transplanted into a mixture of pearlite, vermiculite and humus (2∶1∶1,V/V/V), the survival rate of the plantlets was above 90%.