劉 琨, 劉長琳, 陳四清, 張樂樂, 邊 力

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綠鰭馬面鲀精子的超微結(jié)構(gòu)

劉 琨1, 2, 劉長琳2, 陳四清2, 張樂樂1, 2, 邊 力2

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 200090; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島, 266071)

為探討綠鰭馬面鲀()精子的超微結(jié)構(gòu), 作者應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡觀察了其精子外部形態(tài)與各部位的橫切結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明: 綠鰭馬面鲀精子由頭部和尾部兩部分組成。精子頭部呈卵圓形, 無頂體, 頭部主要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞核, 染色質(zhì)致密, 核內(nèi)存在少量染色質(zhì)空隙, 無液泡; 核后端正中有凹入核內(nèi)的植入窩, 呈棒狀, 植入窩較深, 最深處占細(xì)胞核縱長的5/6, 最寬處在細(xì)胞核末端, 約占頭部寬度的1/3。中心粒復(fù)合體位于植入窩內(nèi), 由近端中心粒、中心粒間體和基體組成, 近端中心粒的長軸與基體的縱軸垂直, 排列方式為“T”型; 頭部末端為袖套, 內(nèi)含5個或6個均勻分布的線粒體球和少量隨機(jī)分布的囊泡。尾部細(xì)長, 自基體向后伸出, 尾部無側(cè)鰭結(jié)構(gòu), 其核心結(jié)構(gòu)是軸絲, 軸絲為典型的“9+2”微管復(fù)合體結(jié)構(gòu)。揭示其精子的形態(tài)結(jié)構(gòu), 以期豐富硬骨魚類繁殖生理學(xué)內(nèi)容, 同時為魚種鑒別提供依據(jù)。

綠鰭馬面鲀(); 精子; 超微結(jié)構(gòu)

綠鰭馬面鲀()隸屬于鲀形目(Tetraodontiformes)、單角鲀科(Monacanthidae)、馬面鲀屬()[1], 是溫水性洄游魚類[2-4], 分布于日本、朝鮮及中國東海、黃海海域。其肉質(zhì)鮮美且營養(yǎng)價值高, 是中國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一[5]。20世紀(jì)70年代, 綠鰭馬面鲀成為中國海洋捕撈的主要對象之一, 而進(jìn)入20世紀(jì)90年代, 由于過度捕撈與環(huán)境破壞等原因, 其捕撈產(chǎn)量逐步下降[6-7], 導(dǎo)致其市場價格不斷攀升。為滿足市場需求, 急需進(jìn)行大規(guī)模人工養(yǎng)殖。目前國內(nèi)有關(guān)綠鰭馬面鲀繁殖習(xí)性、胚胎發(fā)育和性腺發(fā)育等方面的研究報道較多[8-10], 但關(guān)于其精子超微結(jié)構(gòu)的研究未見報道。作者以黃海綠鰭馬面鲀精子為研究對象, 揭示其精子的形態(tài)結(jié)構(gòu), 以期豐富硬骨魚類繁殖生理學(xué)內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用8尾綠鰭馬面鲀雄魚由青島金沙灘水產(chǎn)開發(fā)有限公司提供, 體長范圍23.5~31.5 cm, 體質(zhì)量180.6~498.9 g。魚齡兩年以上, 且性成熟。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚培養(yǎng)

養(yǎng)殖用水為自然砂濾海水, 水溫19~23℃, 海水鹽度29~31, 光照強(qiáng)度700~1 200 lx。每天投喂定量鮮雜魚, 投喂時間8: 00和15: 00各1次, 每天喂食前換水, 日換水率200%~400%。培養(yǎng)30 d后, 挑選體表完整且有活力的綠鰭馬面鲀雄魚, 輕輕擠壓腹部, 即可擠出精液, 說明雄魚性腺已發(fā)育成熟。

1.3 精液提取方法

隨機(jī)挑取3條綠鰭馬面鲀, 取精液時用濕毛巾蓋住魚體的鰓部, 再用干毛巾擦干魚體生殖孔周圍水分, 輕輕擠壓腹部, 擠出精液。用經(jīng)過消毒的干燥玻璃吸管吸取乳白色精液滴入干凈管中保存。實(shí)驗(yàn)用精液要求新鮮、無血、無尿、無污染。

1.4 掃描電鏡樣品制備

取精液0.5 mL加入10倍體積的2.5 %戊二醛固定液(0.2 mol/L PBS配制, pH7.4, 4℃), PBS緩沖液漂洗。乙醇系列梯度脫水后, 進(jìn)行乙酸異戊脂置換。采用Eiko公司XD-1型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器干燥, Eiko公司IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜, JEOL公司JSM-840掃描電鏡觀察。

1.5 透射電鏡樣品的制備

取精液0.5 mL加入10倍體積的2.5 %戊二醛固定液(0.2 mol/L PBS配制, pH7.4, 4℃), 2 000 r/min離心5 min, 棄上清液。PBS緩沖液沖洗, 1%鋨酸４℃后固定２h。PBS緩沖液沖洗, 乙醇系列梯度脫水, Epon812環(huán)氧樹脂包埋。UltracutE超薄切片機(jī)半薄切片, 甲苯胺藍(lán)染色, 半薄定位。醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色。JEOL公司JEM-1200EX透射電鏡觀察。

1.6 圖像與數(shù)據(jù)處理

選擇清晰的電鏡樣品圖像, 采用Adobe Photoshop CS6 對圖像進(jìn)行編輯處理, 用Microsoft Excel 2010對精子各組成部分長度進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察

掃描電鏡結(jié)果表明, 綠鰭馬面鲀精子由頭部和尾部兩部分部分組成(圖1-1), 無頸部, 屬于鞭毛型。頭部呈卵圓形, 主要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞核(Nucleus), 且頭部無頂體(Acrosome)和核前部凹陷(Nuclear pit)存在(圖1-2), 尾部自頭部后端的中心向后伸出, 纖細(xì)且較長, 尾部末端較短且不分叉(圖1-3)。精子各部分長度見表1。

表1 綠鰭馬面鲀精子各組成部分長度

Tab.1 Length of spermatozoa parts of Thamnaconus septe-n-trionalis (n = 25)

2.2 透射電鏡觀察

2.2.1 頭部微細(xì)結(jié)構(gòu)

頭部細(xì)胞核縱切呈橢圓形, 主要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞核, 細(xì)胞核后端正中間有一凹入核內(nèi)較深的植入窩(Implantation fossa)(圖1-4)。細(xì)胞核前端無頂體, 核內(nèi)充滿高度濃縮的染色質(zhì), 染色較深, 染色質(zhì)中夾雜幾個少量空隙, 即核泡, 核泡的形態(tài)和位置皆不定(圖1-5)。精子質(zhì)膜包裹整個頭部, 中間原生質(zhì)含有少量囊泡(Vesicle), 分布不均勻, 形態(tài)和數(shù)目不定(圖1-5)。

圖1 綠鰭馬面鲀精子超微結(jié)構(gòu)

1-1. 精子整體, 示頭部和鞭毛; 1-2. 精子頭部, 示頭部和線粒體; 1-3. 精子尾部末端; 1-4. 精子頭部縱切, 示精子頭部基本結(jié)構(gòu)(細(xì)胞核, 植入窩, 袖套腔, 線粒體, 近端中心粒, 中心粒間體, 基體, 軸絲, 袖套內(nèi)膜, 袖套外膜, 囊泡); 1-5. 精子頭部中部橫切, 示袖套, 中央微管, 雙聯(lián)體微管和核泡; 1-6. 精子頭部中部橫切, 示袖套腔, 5線粒體結(jié)構(gòu); 1-7. 精子頭部中部橫切, 示6線粒體結(jié)構(gòu); 1-8. 精子尾部橫切, 示中心“9+2”結(jié)構(gòu): 中央微觀和雙聯(lián)體微管; A. 軸絲; BB. 基體; CF. 中央軸絲; F. 鞭毛; H. 精子頭部; IB. 中心粒間體; IF. 植入窩; IM. 袖套內(nèi)膜; M. 線粒體; N. 細(xì)胞核; NV. 核泡; S. 袖套腔; OM. 袖套外膜; PC. 近端中心粒; PF. 外周二連微管; V. 囊泡

1-1. The total length of a sperm, showing head and flagellum; 1-2. The head of the spermatozoa, showing head and mitochondrion; 1-3. End piece of the flagellum; 1-4. Longitudinal section of the sperm head, showing the basic structure nuclear of sperm head (nuclues, implantation fossa, mitochondrion, proximal centriole, intercentriolar body, basal body, axoneme, inner memberane of the sleeve, outer memberane of the sleeve and vesicle; 1-5. Longitudinal section of sperm head, showing the center microtubule, doublet microtubule and nuclear vacuole; 1-6. Cross section of sperm’head at midpiece, showing central space of the sleeve and five mitochondria’s structure; 1-7. Cross section of sperm’head at midpiece, showing the six mitochondria’s structure; 1-8. Cross section of end piece of the sperm flagellum, showing the structure of “9+2”: center microtubule and doublet microtubule; A. Axoneme; BB. Basal body; CF. Center microtubule; F. Flagellum; H. Head of the spermatozoa; IB. Interce-ntriolar body; IF. Implantation fossa; IM. Inner menbrane of the sleeve; M. Mitochondrion; N. Nucleus; NV. Nuclear vacuole; S. Central space of the sleeve; OM. Outer memberane of the sleeve; PC. Proximal centriole; PF. Plasma membrane; V. vesicle

植入窩形似棒狀, 長度0.89~1.11 μm, 寬度0.36~0.54 μm。中心粒復(fù)合體(Centriolar complex)位于窩內(nèi), 由近端中心粒(Proximal centriole)、中心粒間體(Intercentriolar body)和基體(Basal body) 3部分組成, 近端中心粒在植入窩最內(nèi)端, 呈橢圓形, 長度約0.2 μm, 排列方向與基體縱軸垂直, 呈“T”型(圖1-4); 中心粒間體位于近端中心粒和基體間, 并將兩者隔開, 與核的長軸相垂直; 基體與核的長軸平行, 位于細(xì)胞核底部。從中心粒復(fù)合體開始, 開始延伸出尾部, 并出現(xiàn)“9+2”結(jié)構(gòu)(圖1-6)。

袖套(Sleeve)呈袖筒狀, 由袖套膜包裹線粒體而成, 長約0.70 μm, 占頭長的1/4。起始于核的后端。兩側(cè)的袖套大小形狀近似且對稱。其縱切可見兩側(cè)各有1個橢圓形線粒體(圖1-4), 而橫切則可見5個或6個呈正多邊形均勻分布的線粒體(圖1-6, 圖1-7), 且彼此不融合。袖套末端的原生質(zhì)中分布著少量含有電子致密物質(zhì)的泡狀囊泡與空囊泡(Vesicle)(圖1-6, 圖1-7)。袖套與鞭毛近核端圍成空腔, 即袖套腔(Central space of the sleeve)(圖1-4)。袖套膜分袖套內(nèi)膜(Inner membrane of the sleeve)和袖套外膜(Outer membrane of the sleeve), 袖套內(nèi)膜位于袖套內(nèi)側(cè), 袖套外膜與袖套內(nèi)膜平行且與細(xì)胞質(zhì)膜相連, 袖套內(nèi)膜略厚于袖套外膜(圖1-4)。

2.2.2 尾部微細(xì)結(jié)構(gòu)

在中心復(fù)合體末端開始出現(xiàn)尾部, 穿過袖套腔并向后方延伸, 近核端較短, 遠(yuǎn)核端較長, 尾部細(xì)長, 末端不分叉。尾部核心結(jié)構(gòu)是軸絲(Axoneme)。軸絲始于中心粒復(fù)合體(圖1-4), 可以清楚觀察到典型的“9+2”二聯(lián)微管對復(fù)合體結(jié)構(gòu), 即由外周的9組外周二聯(lián)微管(Plasma membrane)和中央的2條中央纖維(Central fibril)組成(圖1-8)。鞭毛未見側(cè)鰭(Lateral fin)結(jié)構(gòu), 只有鞭毛質(zhì)膜, 質(zhì)膜內(nèi)無液泡(圖1-8)。

3 討論

硬骨魚的受精方式可分為體外和體內(nèi)受精兩類。體內(nèi)受精種類的精子結(jié)構(gòu)相對于體外受精的更為復(fù)雜[11]。綠鰭馬面鲀?yōu)轶w外受精[1], 故精子結(jié)構(gòu)較為簡單, 綠鰭馬面鲀精子屬于鞭毛型, 這與黃鰭東方鲀()[12]、紅鰭東方鲀()[13]和暗紋東方鲀()[14]等鲀形目魚類一致, 但在細(xì)微結(jié)構(gòu)上有所區(qū)別, 如黃鰭東方鲀和紅鰭東方鲀精子皆由頭部和尾部組成, 而暗紋東方鲀還存在粗短頸部。4種鲀形目魚類的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異見表2, 而據(jù)表中數(shù)據(jù)顯示, 4種鲀形目魚類的結(jié)構(gòu)差異主要為頭部大小、線粒體數(shù)量和尾部長度。

表2 鲀形目魚類精子形態(tài)特征

Tab.2 Morphological characteristics of the spermatozoa in Tetraodontiformes

3.1 頭部

在這4種鲀形目魚類中, 暗紋東方鲀[14]頭部最大, 紅鰭東方鲀[13]與綠鰭馬面鲀依次減小, 黃鰭東方鲀[12]最小。而在具體結(jié)構(gòu)上, 綠鰭馬面鲀精子頭部細(xì)胞核內(nèi)充滿高濃度染色質(zhì), 其中存在少量染色淺且形狀不規(guī)則的空隙, 即核泡(Nuclear vacuole), 此結(jié)構(gòu)在黃鰭東方鲀[12]和紅鰭東方鲀[13]中也有出現(xiàn)。實(shí)際上該結(jié)構(gòu)是精子細(xì)胞核中的核泡致密染色質(zhì)中相對稀疏的區(qū)域[12~13]。核泡內(nèi)有少量電子致密小顆粒存在, 這種電子致密小顆粒的形狀和大小與濃縮的染色質(zhì)有明顯差異, 對于這種核泡結(jié)構(gòu), Billard[15]在硬頭鱒的研究中認(rèn)為該結(jié)構(gòu)可能是頂體的前身, 而劉利平[16]等則認(rèn)為是在受精過程中起到緩沖保護(hù)的作用, 同時劉利平[16]也認(rèn)為袖套腔作為鞭毛和袖套膜的空隙, 可能起到緩沖運(yùn)動的作用。

3.2 植入窩

這4種鲀形目魚類都具有植入窩結(jié)構(gòu), 但大小存在差異, 由表2可知, 綠鰭馬面鲀植入窩最大, 暗紋東方鲀[14]與紅鰭東方鲀[13]依次減小, 黃鰭東方鲀[12]最小, 推測這種大小差異首先可能與精子頭部大小相關(guān), 然后與精子細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮程度有關(guān), 即染色質(zhì)濃縮程度大, 植入窩隨之增大。研究表明, 不同硬骨魚的精子植入窩長度有較大區(qū)別, 其中較高等的魚類大多數(shù)精子植入窩較深[17]。綠鰭馬面鲀精子植入窩最深處約占整個細(xì)胞核的5/6, 最寬處在細(xì)胞核末端, 約占頭部寬度的1/3左右, 因此綠鰭馬面鲀精子屬于植入窩較深種類。綠鰭馬面鲀植入窩周圍空隙處還分布少量囊泡和小顆粒。而根據(jù)Walker[18]對動物精子細(xì)胞形成過程的研究, 將核染色質(zhì)濃縮形態(tài)分為顆粒狀、纖維狀、片狀, 因此推測綠鰭馬面鲀的這種小顆粒結(jié)構(gòu)可能為小顆粒狀染色體, 且其他3種鲀形目魚類也有類似結(jié)構(gòu)[12-14]。

3.3 近端中心粒排列方式

目前硬骨魚類精子近端中心粒的排列方式可分為4種類型[13]: (1)近端中心粒長軸與精子縱軸呈“T”形[19]; (2)呈倒“L”形, 如鯉魚()[20]; (3)近端中心粒體與其精子縱軸互為125°角關(guān)系, 呈“亻”形, 如鯽魚()[21]精子; (4)近端中心粒與精子縱軸平行且在同一條直線上, 即呈“I”形, 如黃顆魚()[22]。綠鰭馬面鲀近端線粒體呈橢圓形, 其縱軸與基體縱軸成垂直關(guān)系, 基體縱軸與精子縱軸在同一條直線上, 因此其排列方式屬于第一種類型。而黃鰭東方鲀和紅鰭東方鲀精子近端中心粒與基體縱軸既不垂直也不平行[12-13], 這與綠鰭馬面鲀精子相區(qū)別。因此推測精子近端中心粒與基體縱軸的排列方式可作為鲀形目魚類分類的重要依據(jù)。

3.4 袖套

4種鲀形目魚類袖套結(jié)構(gòu)相似, 皆由袖套外膜和袖套內(nèi)膜包裹線粒體而成, 而線粒體數(shù)量存在差異, 黃鰭東方鲀袖套內(nèi)縱切面可見2個球形線粒體, 橫切顯示有4個[12]; 紅鰭東方鲀袖套內(nèi)縱切面可見2個球形線粒體, 橫切有7~8個[13]; 而綠鰭馬面鲀頭部橫切有5~6個線粒體, 而像這種線粒體數(shù)量差異在4種蝦虎魚()[23]中也有出現(xiàn); 暗紋東方鲀橫切顯示有8個球形線粒體[14]。同時紅鰭東方鲀[13]和綠鰭馬面鲀的精子尾部較長, 在40 μm以上, 而黃鰭東方鲀[12]和暗紋東方鲀[14]的精子尾部尾部較短, 均在40μm以下。關(guān)于這種線粒體和尾部長度的差異, 推測可能是因?yàn)檩^大的精子頭部和較長的鞭毛活動需要更多的能量支持。

3.5 尾部

綠鰭馬面鲀精子尾部無側(cè)鰭結(jié)構(gòu)且尾部末端不分叉, 而暗紋東方鲀尾部末端具有2根細(xì)而長的裸露尾絲[14], 而黃鰭東方鲀和紅鰭東方鲀都具有側(cè)鰭[12-13]。Stoss[24]認(rèn)為精子鞭毛的側(cè)鰭結(jié)構(gòu)可能改善精子鞭毛的游泳速率, 從而提高受精率; Afzelius[25]則認(rèn)為側(cè)鰭與精子游泳速率的提高無關(guān)。綠鰭馬面鲀精子尾部外周有鞭毛質(zhì)膜, 質(zhì)膜內(nèi)無液泡, 除軸絲外沒有其他明顯結(jié)構(gòu), 這與紅鰭東方鲀[13]近核端有較多小囊泡相區(qū)別。因此, 精子的長度、頭部形狀、線粒體數(shù)目及鞭毛長寬等都可作為鲀形目種間鑒定的依據(jù)。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Ultrastructure of spermatozoa of

LIU Kun1, 2, LIU Chang-lin2, CHEN Si-qing2, ZHANG Le-le1, 2, BIAN Li2

(1. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 200090, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

To study the ultrastructure of the spermatozoa of, we observed its external form and cross-section structure by scanning and transmission electron microscopy. The spermatozoa ofconsists of a head and tail. The head has no acrosome, is shell-shaped, and its main structure is the nucleus. At its caudal end there is a deep implantation fossa, 5/6 as deep as the head length. We observed the nucleus to consist of electron dense chromatin materials, with a head pit and nuclear vacuole whose chromatin was free. The centriolar compound of the midpiece is situated in the implantation fossa, which consists of three parts: the proximal centriole, the intercentriolar, and the basal body. The proximal centriole and the basal body were arranged orthogonally in a “T” structure, whereas the basal body was parallel to the spermatozoa. The sleeve was very deep, with the deepest point one third of the head length. The implantation fossa are shaped like rods and the sleeve is located behind the nucleus, which contains five to six mitochondria arranged in a circle. We found there to be a few ellipse vesicles in the sleeve outside the mitochondrion. The structure of the flagellum was such that it facilitated spermatozoa movement. The main structure of the tail was the axoneme, which was slim and long. The tail structure was a typical “9 + 2” model. The flagella were fine and they had no lateral fins. In this paper, we describe the morphological structure of the spermatozoa to enrich our understanding of the physiological contents of teleosts and to provide the basis for the identification of fish species.

; spermatozoa; ultrastructure

[The Basic Research Business of Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences, No.20603022016005]

Jan. 19, 2017

S962.1

A

1000-3096(2017)08-0040-06

10.11759//hykx20170119003

2017-01-19;

2017-03-30

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)(20603022016005)

劉琨(1991-), 男, 山東青島人, 在讀研究生, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)研究, 電話: 13045085912, E-mail: lkstardust@163.com;通信作者: 陳四清, 電話: 13589271079, E-mail: chensq@ysfri.ac.cn