余鈴，郭衛(wèi)春，代國

(武漢大學 人民醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430060)

·基礎研究·

華蟾酥毒基對U2OS細胞增殖和凋亡的影響△

余鈴，郭衛(wèi)春，代國*

(武漢大學 人民醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430060)

目的觀察華蟾酥毒基對人骨肉瘤細胞系U2OS增殖和凋亡的影響，從而探討華蟾酥毒基誘導骨肉瘤凋亡的可能機制。方法體外培養(yǎng)人骨肉瘤細胞系U2OS，CCK-8法檢測不同濃度華蟾酥毒基對骨肉瘤細胞系U2OS增殖的抑制作用，Annexin V-FITC/PI 染色，流式細胞術檢測細胞凋亡，Hoechst 33258 染色，顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化，應用逆轉錄熒光定量PCR法檢測華蟾酥毒基對凋亡通路相關mRNA表達的影響。結果CCK-8檢測顯示華蟾酥毒基可抑制人骨肉瘤U2OS細胞增殖，并具有時間和劑量依賴性，在華蟾酥毒基濃度為20 nmol·L-1時，對細胞增殖的抑制作用明顯增強；流式細胞術檢測顯示華蟾酥毒基可明顯誘導骨肉瘤細胞凋亡；Hoechst 33258 染色可見凋亡小體；逆轉錄熒光定量PCR分析顯示經華蟾酥毒基處理后的骨肉瘤細胞系U2OS表達Caspase-3，8，9較用藥前明顯增高。結論華蟾酥毒基對骨肉瘤細胞系U2OS的增殖有顯著抑制作用，并可誘導其發(fā)生凋亡，其作用機制可能與激活Caspase依賴的凋亡途徑有關。

華蟾酥毒基；骨肉瘤；細胞增殖；細胞凋亡

骨肉瘤是最常見的骨的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，主要發(fā)生于長骨遠端，目前主要的治療方法是行新輔助化療后，再手術切除。得益于此治療方案，使得骨肉瘤患者的5年生存率提高到了60%[1-2]。誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡是治療的一個重要目標，近年來，許多學者把目光放在尋找新的藥物上，以尋求更好的治療效果。

華蟾素是中華大蟾蜍全皮經過水化萃取而制成的中藥制劑，具有清熱解毒、利水消腫、化瘀潰堅等作用，其化學成分復雜，包括吲哚生物堿、還原糖、氨基酸以及蟾蜍毒素、蟾蜍色胺等。華蟾素具有低毒、抗癌譜廣等諸多優(yōu)點，目前已成為我國臨床上應用較廣的抗腫瘤中藥制劑之一[3-4]。華蟾酥毒基(cinobufagin，CB)作為華蟾素中提取的主要毒性配基之一，亦具有良好的抗腫瘤作用。先前有許多研究證實華蟾素可以通過抑制腫瘤細胞增殖誘導其凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)其對肝癌、乳腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有良好的抗癌功效[5-8]。但將華蟾酥毒基應用于骨肉瘤的研究并不多見。本實驗探討了華蟾酥毒基對人骨肉瘤U2OS細胞的增殖抑制和誘導凋亡的作用，并檢測了其對凋亡相關mRNA表達的調控，為進一步明確華蟾酥毒基的抗腫瘤機制提供理論依據。

1 材料

DMEM培養(yǎng)基、新鮮小牛血清(Hyclone公司)；華蟾酥毒基(美國Sigma公司)，用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成0.01 mol·L-1的儲備液分裝備用，使用時用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，DMSO的含量小于1‰；Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁化學研究所)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；DMSO、Hoechst 33258及胰蛋白酶(美國Sigma公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen Life Technologies公司)；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；2X SYBR綠色熒光染料反應混合液(美國Ambino公司)。Caspase-3，8，9引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每24 h換液，用0.25%含EDTA胰酶消化液隔天消化、傳代，取對數生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8法檢測華蟾酥毒基對U2OS細胞增殖的影響

取對數生長期的細胞，制成1×105·mL-1的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h待其貼壁后加入終濃度分別為20、50、100、150、200 nmol·L-1的華蟾酥毒基，陰性對照組加等體積的DMEM培養(yǎng)液處理(每個濃度設5個復孔)，每個濃度處理24、48、72 h后，加入CCK-8 10 μL 培養(yǎng)1 h，酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度(A)值，實驗重復3次。按公式(1)計算細胞存活率。

細胞存活率=(A給藥組-A空白組)/(A陰性對照組-A空白組)×100%

(1)

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染結合流式細胞術檢測華蟾酥毒基對U2OS細胞凋亡的影響

收集處于對數生長期的骨肉瘤U2OS細胞，制備單細胞懸液，計數后調整細胞密度為2×105·mL-1，按2 mL/孔接種于6孔板，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁后吸棄原培養(yǎng)液，加入終濃度分別為20、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基的新鮮DMEM培養(yǎng)液，同時設立空白對照組。藥物作用48 h后，各組重復3次，經胰酶消化，收集細胞于流式管內，1500 r·min-1、4 ℃離心5 min，棄上清液，4 ℃預冷的磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞1次，用稀釋好的結合緩沖液[結合緩沖液-去離子水(1∶10)]500 μL重懸細胞。每管依次加Annexin V-FITC 5 μL，再加入5 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫下避光孵育5 min，上流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。以Annexin V為橫坐標，PI為縱坐標，左上象限代表壞死細胞碎片，左下象限代表活細胞(Annexin V和PI雙陰性)、右下象限代表凋亡早期(Annexin V陽性，PI陰性)、右上象限代表凋亡晚期(Annexin V和PI雙陽性)。

2.4 Hoechst 33258 檢測細胞凋亡

選取對數生長期的U2OS細胞接種于6孔板，采用經CCK-8和流式檢測作用較明顯的20、50 nmol·L-1的華蟾酥毒基分別作用，含等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基作為對照。收集作用后48 h的細胞，PBS洗2次，用75%的乙醇水4 ℃固定5 min，PBS沖洗，Hoechst 33258 染色10 min 后置于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 實時熒光定量PCR分析細胞Caspase mRNA表達的變化

收集不同濃度華蟾酥毒基作用48 h后的U2OS細胞約1×107個，應用TRIzol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA含量。使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。cDNA(5 μL；1∶100)被添加到12.5 μL的2X SYBR綠色熒光染料反應混合液，使得總體積為25 μL，以GAPDH為內參，通過觀察擴增曲線來測量Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的CT值(擴增曲線達到閾值時的循環(huán)圈數)。數據處理采用相對定量中的2-ΔΔCt計算結果來表示各個基因表達的水平，最后取3次重復實驗平均值作為最終結果，具體引物見表1。

表1 引物信息表

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 華蟾酥毒基對骨肉瘤U2OS細胞增殖的影響

CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，用不同濃度華蟾酥毒基處理后，在24～72 h內U2OS細胞生長增殖均受到明顯抑制(與對照組相比，P<0.05或P<0.01)，并且抑制作用呈劑量依賴性，在濃度為20 nmol·L-1時即出現(xiàn)抑制細胞增殖的作用，在一定范圍內隨著華蟾酥毒基劑量的增加和作用時間的延長抑制效果增加，各個劑量及作用時間對U2OS細胞增殖的抑制作用均有統(tǒng)計學差異，見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。圖1 CCK-8法檢測華蟾酥毒基對骨肉瘤U2OS細胞的抑制作用

3.2 華蟾酥毒基對骨肉瘤U2OS細胞凋亡的影響

通過Annexin V-FITC和PI雙染標記法檢測，結果顯示，隨著華蟾酥毒基濃度的增加，凋亡率逐漸升高，華蟾酥毒基50、100、200 nmol·L-1組處理48 h時，其凋亡率分別為(25.4±1.3)%、(52.7±0.8)%、(65.9±2.8)%，與空白對照組(2.1±0.3)%比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 流式細胞術檢測不同濃度華蟾酥毒基對骨肉瘤U2OS細胞的凋亡率

3.3 Hoechst 33258 熒光染色法觀察細胞形態(tài)學改變

熒光顯微鏡下對照組人骨肉瘤U2OS細胞核完整，著色均勻，熒光呈彌散狀，比較黯淡(見圖3)。華蟾酥毒基(20、50 nmol·L-1)處理48 h 后組細胞染色質凝聚，細胞核裂解，著色不規(guī)則，部分濃聚，呈現(xiàn)出細胞凋亡的典型變化即核碎裂，產生凋亡小體(見圖3)。

圖3 Hoechst 33258 熒光染色法顯示不同濃度華蟾酥毒基處理后細胞形態(tài)學的改變

3.4 華蟾酥毒基對骨肉瘤細胞Caspase依賴的凋亡通路相關mRNA表達的影響

不同濃度的華蟾酥毒基作用于U2OS細胞48 h后，應用RT-PCR法檢測Caspase依賴的凋亡信號通路相關mRNA Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達情況。結果顯示，20、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基均能夠提高Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的表達水平，且隨著濃度的增加，促凋亡mRNA的表達量不斷增高，見圖4。

圖4 不同濃度華蟾酥毒基對骨肉瘤細胞Caspase依賴的凋亡通路相關mRNA的表達

4 討論

盡管早期手術治療結合新輔助化療已很大程度提高骨肉瘤患者的5年生存率(60%～70%)，但目前仍有20%～40%的患者死于骨肉瘤的遠處轉移。如何延緩其生長及轉移，進一步提高其治療效果仍然是目前骨肉瘤治療的難題之一[9-12]。傳統(tǒng)化療藥因其毒副作用高和耐藥性等原因，常導致化療失敗。因此尋找一種具有高抗腫瘤活性的新型藥物，能夠協(xié)助或者替代傳統(tǒng)化療藥物促進骨肉瘤細胞的凋亡，以減少傳統(tǒng)化療藥物的使用時間和使用劑量，降低其毒副作用或逆轉耐藥性的發(fā)生，從而提高骨肉瘤患者的耐受性和長期生存率是目前骨肉瘤的研究熱點之一[13-14]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中藥蟾皮或蟾酥的主要成分華蟾酥毒基是一種甾體類，具有較強的抗腫瘤活性而得到廣泛的關注。華蟾素作為抗腫瘤中藥制劑，在腫瘤治療方面應用很廣，對肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤都有一定的治療作用[8，15-17]。此外，相關毒理研究還證實其具有副作用小、使用安全的特點。目前認為華蟾酥毒基主要通過線粒體或Fas/FasL介導的凋亡通路、上調Caspases蛋白酶誘導凋亡、抑制Notch信號通路、誘導細胞周期阻滯、調節(jié)凋亡抑制基因的表達等多種機制誘導腫瘤細胞凋亡而對腫瘤起到治療作用[3，18-22]。

在本實驗中，采用不同濃度的華蟾酥毒基體外作用于人骨肉瘤系U2OS，通過CCK-8法檢測細胞增殖，發(fā)現(xiàn)不同濃度華蟾酥毒基可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，且其存活率與華蟾酥毒基的濃度和作用時間均有關，當華蟾酥毒基濃度為20 nmol·L-1，作用時間48 h時抑制作用明顯增強，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)。本研究與國外其他學者研究結果相似[21]，提示華蟾酥毒基可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，對骨肉瘤細胞起到殺傷作用。

凋亡在腫瘤治療中起著重要作用，凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有很大關系，誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤治療有重要意義，許多抗癌藥物都是通過誘導凋亡而發(fā)揮殺傷癌細胞的作用。本文流式分析結果顯示，華蟾酥毒基在體外試驗中誘導人骨肉瘤U2OS細胞發(fā)生凋亡，且其凋亡率隨著華蟾酥毒基濃度的增加而增加(見圖2)。Hoechst 33258 可透過細胞膜并對DNA染色而發(fā)出明顯而強烈的藍色熒光，常常用來進行凋亡細胞的形態(tài)學檢測的研究。本文通過熒光顯微鏡下觀察顯示20、50 nmol·L-1的華蟾酥毒基處理后可誘導骨肉瘤U2OS細胞發(fā)生凋亡，細胞出現(xiàn)核固縮、碎裂，以及凋亡小體。以上這些結果都說明，華蟾酥毒基可以誘導骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡機制失調是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制之一[23]，在細胞凋亡的執(zhí)行過程中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族起著非常重要的作用，這種凋亡方式稱為Caspase依賴的細胞凋亡。Caspase家族包含多個成員，在細胞凋亡過程中起著非常關鍵的作用。正常情況下Caspase以無活性的酶原形式存在，在促凋亡因素的作用下級聯(lián)激活而觸發(fā)凋亡。本文檢測不同濃度華蟾酥毒基對Caspase-3、8、9 mRNA表達的影響，從圖4的結果中可以看到U2OS細胞中Caspase-3、8、9 mRNA的表達在加入華蟾酥毒基處理后均有不同程度明顯增高，提示華蟾酥毒基誘導的U2OS細胞凋亡與Caspase級聯(lián)活化有關，并可能同時涉及線粒體通路和死亡受體通路。

綜上，華蟾酥毒基具有抑制骨肉瘤U2OS細胞增殖并誘導細胞凋亡的作用，其效應呈時間和濃度依賴性。華蟾酥毒基可能通過Caspase依賴的凋亡途徑誘導了U2OS骨肉瘤細胞凋亡，其作用機制涉及上調Caspase mRNA表達，最終可能與啟動了細胞凋亡的信號轉導的級聯(lián)反應過程有關?？傊?，本研究為華蟾酥毒基治療骨肉瘤提供了新的實驗依據，下一步我們將進行更加深入的在體實驗研究。

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EffectofCinobufaginonProliferationandApoptosisofU2OS

YU Ling，GUO Weichun，DAI Guo*

(DepartmentofOrthopedics，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective:To investigate the effect of cinobufagin on the growth inhibition，apoptosis and the expression of Caspases mRNA in human osteosarcoma cell line U2OS．MethodsOsteosarcoma cell line U2OS was culturedinvitro． Cell proliferation was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8).The cells stained by Annexin V and PI were observed by flow cytometry ( FCM) for apoptosis．Hoechst 33258 was used to detect the morphological change of apoptotic cells.The mRNA expression of Caspases in U2OS was observed by RT-PCR．ResultsThe proliferation of human osteosarcoma cell line U2OS could be inhibited and apoptosis could be induced by cinobufagin．The inhibition rate and apoptosis rate were different with the different concentrations．The inhibition rate and apoptosis rate of U2OS cells rose significantly when the concentration of cinobufagin was over 20 nmol·L-1．Apoptotic body could be observed by Hoechst 33258 dying．The Caspases mRNA expression of human osteosarcoma cell line U2OS increased obviously by using cinobufagin.ConclusionCinobufagin could significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS．Its mechanism of action may be related to activation of Caspase dependent apoptosis pathway．

Cinobufagin；osteosarcoma；proliferation；apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.008

國家自然科學基金(81341078)

*

代國，住院醫(yī)師，研究方向：脊柱外科與骨腫瘤；E-mail：daiguo720@sina.com

2017-03-06)