孫艷玲，李澤琦，馮冠英，鄭彧

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

·中藥工業(yè)·

超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取菟絲子總黃酮工藝優(yōu)化△

孫艷玲，李澤琦，馮冠英，鄭彧*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的將酶解法和超聲波法聯(lián)用，通過工藝優(yōu)化提高菟絲子總黃酮的含量。方法實驗采用紫外分光光度法測定總黃酮提取率，選取酶解pH、酶解溫度和超聲時間3個指標(biāo)為影響因素，菟絲子總黃酮提取率為響應(yīng)值，Design-Expert 8.0統(tǒng)計分析軟件的響應(yīng)面分析法安排試驗后獲得最適合工藝參數(shù)。結(jié)果最適合的工藝參數(shù)是PH為4.0，酶解溫度為52.6 ℃，超聲時間為20.3 min，在此條件下得到的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.39 mg·g-1。結(jié)論此工藝操作簡單、穩(wěn)定性好、總黃酮提取率高，可為菟絲子總黃酮的相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

菟絲子總黃酮；復(fù)合酶；超聲波；響應(yīng)面分析法

菟絲子(Cuscutae semen)系旋花科植物菟絲子CuscutachinensisLam.的干燥成熟種子，其味辛、甘，性平，歸肝腎經(jīng)，具有滋補肝腎、益精安胎、固精縮尿、明目止瀉的功能。菟絲子作為補腎藥中不可或缺的一味藥[1]，其總黃酮具有促進下丘腦-垂體-性腺軸[2]的功能。菟絲子質(zhì)地較硬，其有效成分不易被充分提取或提取率較低[3]。酶解法可以破壞植物細(xì)胞壁，在此基礎(chǔ)上超聲波進行二次破壞，使細(xì)胞內(nèi)有效成分容易溶出。因此，本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^酶解法和超聲波法聯(lián)用來提高菟絲子總黃酮產(chǎn)率，為其開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

菟絲子經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室翟延君教授鑒定為菟絲子；蘆丁對照品(成都普菲德生物技術(shù)公司)；纖維素酶(1萬U·g-1，阿拉丁試劑)；果膠酶(3萬U·g-1，阿拉丁試劑)；氫氧化鈉(NaOH)、亞硝酸鈉(NaNO2)、硝酸鋁[AL(NO3)3]、無水乙醇、冰乙酸(分析純)。

1.2 儀器

SPD-10AVP紫外檢測器(日本島津公司)；AE240十萬分之一分析天平(瑞士MettLer公司)；50 g手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限司)；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：50 kHz)；pH計(PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃條件下干燥至恒重的蘆丁對照品10 mg置于50 mL的容量瓶中，用70%的乙醇定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.2 g·L-1的蘆丁對照品溶液[4]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

依次吸取對照品溶液0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL置于EP管中，加水至2.6 mL，加入5%亞硝酸鈉0.2 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁0.2 mL，搖勻，靜置6 min，加入4%氫氧化鈉2 mL，加水至5 mL，搖勻，靜置15 min，在510 nm處測得吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]，得到回歸方程Y=6.412 5X-0.039 4，r=0.999 5，結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.092 3～0.153 8 g·L-1線性關(guān)系良好。

2.3 樣品溶液的制備

將菟絲子飲片置于60 ℃的烘箱中干燥至恒重，粉碎之后過4號篩，裝入干燥袋，置于干燥皿中備用。精密稱取菟絲子粉末0.5 g，精密稱取2%纖維素酶和2%果膠酶，精密吸取pH為4.5的冰乙酸溶液10 mL，依次置于100 mL的燒瓶中，加熱攪拌[3]，停止酶解后加入無水乙醇(V無水乙醇∶V冰乙酸=2∶1)，超聲10 min，補足失重，靜置10 min，吸取上清液，離心，即得樣品溶液。

2.4 總黃酮含量的測定

精密吸取2.3項下制備的提取液0.6 mL置于EP管中，按照2.2項制備供試品溶液后測得吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品溶液總黃酮的濃度?？傸S酮含量計算公式：總黃酮含量=X×5÷0.6×V÷0.5×0.75(V為提取總黃酮時冰乙酸和無水乙醇總體積)。

2.5 方法考察

2.5.1 穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.3項下制備的提取液0.4 mL，按照2.2項制備供試品溶液，6 h內(nèi)每隔1 h測定一次吸光度，RSD為1.12%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取2.3項下提取液6份，各0.4 mL，按照2.2項制備供試品溶液，測得吸光度，RSD為0.88%，表明精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密吸取2.3項下得到提取液0.4 mL，按照2.2項制備供試品溶液，測得吸光度，測定6次，RSD為0.89%，表明重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收試驗 精密稱取菟絲子粉末0.5 g，6份，制備提取液方法同2.3項，在提取液中加入一定量的蘆丁對照品，按照2.2項制備供試品溶液，測得吸光度，結(jié)果見表1，回收率為97.88%，RSD為1.25%。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.6 總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.6.1 提取方法的選擇 首先考察不同提取方法對菟絲子總黃酮含量的影響。按照表2中方法制備提取液，按照2.2項方法制備供試品溶液后測得吸光度。結(jié)果顯示，單用超聲波提取比單用酶解法提取和無酶提取效果好，酶解提取聯(lián)用超聲波提取相對于其他提取方法菟絲子總黃酮提取率高。

表2 不同提取方法對菟絲子總黃酮含量的影響

2.6.2 酶解pH單因素試驗 按照2.3項下方法制備提取液時，酶解所用冰乙酸的pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，總黃酮提取量依次為21.75、23.61、21.00、19.84、19.80 mg·g-1。結(jié)果表明，pH為4.0時菟絲子提取效果最佳，酸的濃度過大或者過小都會抑制酶的活性。見圖1。

圖1 酶解pH單因素試驗結(jié)果

2.6.3 酶解時間單因素試驗 在采用2.3項中的操作方法制備提取液時，酶解時間分別為10、30、60、90、120 min，總黃酮提取量依次為18.32、23.61、23.82、23.68、22.03 mg·g-1。結(jié)果表明，酶解時間為30 min提取效果最佳，雖然時間增加為60 min總黃酮產(chǎn)率稍微提高，但是從經(jīng)濟方面考慮，酶解時間無需延長至60 min。見圖2。

圖2 酶解時間單因素試驗結(jié)果

2.6.4 酶解溫度單因素試驗 在采用2.3項中的操作方法制備提取液時，酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，總黃酮提取量依次為19.78、21.97、23.62、23.59、21.89 mg·g-1。結(jié)果表明，酶解溫度為50～60 ℃提取效果最佳，溫度過高或者過低可能會抑制酶活性，高溫甚至有可能使酶失去活性。見圖3。

圖3 酶解溫度單因素試驗結(jié)果

2.6.5 超聲時間單因素試驗 在采用2.3項中的操作方法制備提取液時，超聲時間分別為0、10、20、30、40 min，總黃酮提取量依次為21.26、23.61、23.39、22.00、21.57 mg·g-1。結(jié)果表明，超聲時間為20 min時提取效果最佳，時間過長可能是雜質(zhì)的含量增加導(dǎo)致總黃酮提取率下降。見圖4。

圖4 超聲時間單因素試驗結(jié)果

2.6.6 料液比單因素試驗 在采用2.3項中的操作方法制備提取液時，冰乙酸體積分別為5、10、15、20、25 mL，則無水乙醇體積相應(yīng)地為10、20、30、40、50 mL，總黃酮提取量依次為19.58、23.61、23.87、24.00、24.40 mg·g-1。結(jié)果表明，料液比對總黃酮提取率沒有太大影響，從經(jīng)濟角度和提取率兩方面考慮，1∶20料液比最佳。見圖5。

圖5 料液比單因素試驗結(jié)果

3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶解pH(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)為考察對象，以菟絲子總黃酮含量為響應(yīng)值(Y)，采用Design-Expert.8.0統(tǒng)計分析軟件的響應(yīng)面分析法安排試驗，最后獲取最適合工藝參數(shù)[5]。采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進行試驗設(shè)計，因素水平設(shè)計見表3。

表3 因素分析水平表

菟絲子總黃酮提取工藝優(yōu)化結(jié)果見表4，共17個試驗，1～12為析因試驗，13～17為中心試驗，用來分析試驗誤差。經(jīng)回歸擬合后，研究因素與響應(yīng)值回歸方程為Y=23.50+0.14X1+0.34X2+0.05X3+0.16X1X2+0.38X1X3-0.017X2X3-0.87X12-0.72X22-1.37X32。

菟絲子總黃酮響應(yīng)面方差分析見表8，由方差分析結(jié)果可知，各因素中A2、B2和C2是高度顯著的，B和AC是顯著的(A為酶解pH，B為酶解溫度，C為超聲時間)，表明各試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。上述回歸方程中，F(xiàn)檢驗來判定各變量對響應(yīng)值影響的顯著性。從實驗整體分析，回歸模型F檢驗是高度顯著的，決定系數(shù)r=0.963 2，說明預(yù)測值與實測值之間具有高度相關(guān)性，其失擬項檢驗不顯著，說明具有統(tǒng)計學(xué)意義。該模型可以較好地描述研究因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可用此模型對菟絲子總黃酮提取率進行分析預(yù)測。

表4 響應(yīng)面分析法方案和結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

注：*表示顯著差異(P<0.05)，**表示極顯著差異(P<0.01)。

研究因素酶解溫度和pH值對菟絲子總黃酮提取率產(chǎn)生的影響見圖6。圖中曲面的彎曲程度反應(yīng)兩選取因素交互作用的顯著程度，曲面越平，交互作用越不顯著。從響應(yīng)面的最高點和等高線可以看出，在所取試驗參數(shù)范圍內(nèi)存在極值，其是響應(yīng)面的最高點和等高線的中心點。

圖6 影響因素間交互作用對菟絲子總黃酮提取率影響

4 結(jié)論與討論

通過數(shù)據(jù)分析最后得到最佳條件：pH為4.05，酶解溫度為52.59 ℃，超聲時間為20.32 min，此條件下菟絲子總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.555 1 mg·g-1。在此條件下重復(fù)實驗，重復(fù)實驗值為23.39 mg·g-1(n=3)，與理論預(yù)測值誤差為0.7%。說明該情況與實際情況相符，印證了實驗結(jié)果的可靠性，此工藝參數(shù)可靠，具有實用價值。

近些年，很多新技術(shù)在天然成分提取方面應(yīng)用廣泛。彭金年等[6]比較了回流提取法、索式提取法、微波輔助萃取法和閃氏提取法對總黃酮提取率的影響，索式提取法和常規(guī)回流法雖然提取效果較好，但是提取時間過長。綜合考慮，微波輔助法最佳，但是提取率較低，總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.44 mg·g-1。周蓉等[4]采用酶解法，總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.96 mg·g-1，提取率很高但是酶解時間過長。林曉等[7]采用超聲輔助提取法，超聲15 min，工藝很簡單但是總黃酮量較低，為14.10 mg·g-1。植物細(xì)胞壁的主要組成成分是纖維素和果膠，酶解法利用纖維素酶和果膠酶破壞細(xì)胞壁[8]，超聲波產(chǎn)生空化現(xiàn)象，進一步造成植物細(xì)胞壁破裂[9]，雙重作用加速有效成分溶出，可縮短提取時間。本實驗表明，酶解法和超聲提取法確實具有協(xié)同作用，將兩種提取方法聯(lián)用可以提高總黃酮產(chǎn)率，縮短提取時間。此外，提取工藝簡單，后處理容易，方法穩(wěn)定可行，為有關(guān)菟絲子總黃酮的工業(yè)生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。但是，該工藝下總黃酮中單體成分含量的變化情況還有待進一步研究。

[1] 劉成標(biāo).菟絲子大勢看漲[J].中國現(xiàn)代中藥，2006，8(3)：45.

[2] 王建紅，王敏璋，歐陽棟，等.菟絲子黃酮對心理應(yīng)激雌性大鼠下丘腦β-EP和腺垂體FSH和LH的影響[J].中藥材，2002，25(12)：886-887.

[3] 伍曉春.超聲波提取菟絲子總黃酮的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2009，30(3)：34-37.

[4] 周蓉，王洛臨，徐文杰，等.菟絲子的酶法提取工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20(22)：33-36.

[5] 武婧，宋忠興，古川，等.星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏提取工藝研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17(9)：953-957.

[6] 彭金年，李銀保，成庚金生，等.菟絲子總黃酮不同提取方法的比較[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2010，25(2)：140-142.

[7] 林曉，練立婷，羅麗丹，等.菟絲子總黃酮超聲提取工藝的研究[J].廣州化工，2014，42(2)：57-59.

[8] 高文秀，楊艷艷，趙文卓，等.復(fù)合酶解法協(xié)同超聲波法提取山楂中總黃酮的工藝條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2014，35(2)：175-178，182.

[9] 黃秀香，賴紅芳，李植偉.復(fù)合酶輔助超聲提取穿破石中黃酮苷工藝優(yōu)化[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(5)：664-666.

ExtractionOptimizationofTotalFlavonoidsfromCuscutachinensiswithCompoundEnzymeunderUltrasonicWave

SUN Yanling，LI Zeqi，F(xiàn)ENG Guanying，ZHENG Yu*

(ThePharmaceuticalSciencesofLiaoninguniversityoftraditionalChinesemedicine，DaLianLiaoning， 116600，China)

Objective:Total flavonoids fromCuscutachinensiswere extracted with compound enzyme under ultrasonic wave aiming at improving the rate of extraction.MethodsThe pH，temperature and hydrolysis time were selected as influencing factors based on single factors，and the extraction rate of total flavonoids was selected as response value.The effects of all variables and their interactions on extraction rate of total flavonoids fromC.chinensiswere investigated through Box-Behnken experiment design method.ResultsThe optimum extraction conditions of total flavonoids were as follows：pH 4.05，temperature at 52.6 ℃，and ultrasonic time of 20.3 min.Under the optimized conditions，the maximum extraction yield of total flavonoids was 23.39 mg·g-1.ConclusionThe optimized extraction process has the advantages of less time，easy operation，the higher rate of the extraction of total flavonoids.

Total flavonoid fromCuscutachinensis; enzyme hydrolysis; ultrasonic; response surface analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.017

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510162000048)

*

鄭彧，副教授，研究方向：中藥分析、中藥炮制工藝、炮制機制；E-maiL：zhengyu1982@ aLiyun.com

2017-01-08)