吳思婧+曹瑞霞+吳能表

摘要：以半夏[Pinellia ternate（Thunb.） Breit]愈傷組織為材料，研究不同外源添加物對半夏愈傷組織內(nèi)GOGAT、GDH、GOT、PAL活性和總生物堿、鳥苷和腺苷含量的影響。結(jié)果表明，不同濃度的外源添加物SNP、ASA、Phe、Asp單一或兩兩復(fù)合添加，均能提高半夏愈傷組織中GOGAT、GDH、GOT、PAL的活性，增加總生物堿和鳥苷的含量。其中，1 mg/L ASA和150 mg/L Asp復(fù)合處理誘導(dǎo)GOGAT、GDH、GOT、PAL活性提高和可溶性蛋白含量增加的效果最好，此時半夏愈傷組織中總生物堿及鳥苷含量分別比對照增加131.0%、146.7%。適宜濃度的SNP、ASA、Phe、Asp可通過提高半夏愈傷組織中GOGAT、GDH、GOT、PAL活性加速無機氮的同化及轉(zhuǎn)化效率，促進總生物堿、鳥苷和腺苷的合成與積累。

關(guān)鍵詞：半夏[Pinellia ternate（Thunb.） Breit]；愈傷組織；外源添加物；次生代謝；總生物堿；鳥苷；腺苷

中圖分類號：S567.23+9.1-33 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）22-4323-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.029

Abstract： By using Pinellia ternate（Thunb.） Breit callus as materials，the effects of exogenous additives on the activities of several secondary metabolism key enzymes and the contents of total alkaloids， guanosine and adenosine were studied. The result shows，the result showed that exogenous additives enhanced the activities of GOGAT，GDH，GOT，PAL and increased the contents of total alk alkaloids and guanosine of P. ternate callus in different concentration treatments， of which 1 mg/L ASA and 150 mg/L Asp incorporated promoted the activities of GOGAT，GDH，GOT and PAL，and was best which increased soluble protein content，increased alkaloids and guanosine contents by 131.0% and 146.7% than of CK，respectively.appropriate concentration of SNP，ASA，Phe，Asp enhanced GOCAT，GDH，GOT and PAL activity in callus，which accelerated the assimilation and conversion efficiency of inorganic nitrogen and furnish more precursor of secondary metabolism. Furthermore，the contents and accumulation of alkaloids， guanosine and adenosine increased correspondingly.

Key words： Pinellia ternate（Thunb.） Breit； callus； exogenous additives； secondary metabolism； total alkaloids； guanosine； adenosine

半夏[Pinellia ternate（Thunb.）Breit]是中國傳統(tǒng)中藥材之一，藥用歷史悠久，市場需求量大。近年來，因其在鎮(zhèn)咳、止嘔、降脂、抗腫瘤、抗病毒、基因治療等方面的應(yīng)用深入[1，2]而格外受到關(guān)注，所以提高半夏中次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量對推動半夏的深度開發(fā)意義重大。

氮代謝是植物體內(nèi)重要的代謝途徑，它不僅影響著植物的新陳代謝、資源分配、各形態(tài)發(fā)育，還影響著植物次生代謝產(chǎn)物的生成[3]。羅建平等[4]認(rèn)為，激發(fā)子能誘導(dǎo)細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生積極變化，以利于次生代謝產(chǎn)物的形成、運輸和積累；郭肖紅等[5]認(rèn)為，誘導(dǎo)子可經(jīng)過信號傳導(dǎo)途徑刺激細胞中特定的酶并改變其活力，從而影響該酶催化的代謝途徑中反應(yīng)速率和代謝通量，引起次生代謝物質(zhì)產(chǎn)量的改變；Xu等[6]發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)真菌誘導(dǎo)子誘發(fā)粉葛細胞中葛根素和體內(nèi)SA生物合成所必需的上游信號分子是NO。同時，與氮代謝密切相關(guān)的谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氨酶（GDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等關(guān)鍵酶已在農(nóng)作物、水果、林業(yè)、藥用植物等多種植物研究中受到廣泛關(guān)注[7-9]，但在植物次生代謝途徑的調(diào)控中，誘導(dǎo)子是否會引起GOGAT，GDH、GOT、PAL等氮代謝關(guān)鍵酶的變化目前的研究還不多見。試驗以半夏愈傷組織為材料，通過單一或兩兩復(fù)合添加適宜濃度的外源物苯丙氨酸（Phe）、天冬氨酸（Asp）、硝普鈉（SNP）、乙酰水楊酸（ASA）于培養(yǎng)基中，從氮代謝角度探討其對半夏愈傷組織中總生物堿、鳥苷和腺苷的調(diào)控機理，為Phe、Asp、SNP、ASA調(diào)控半夏愈傷組織中次生代謝的通路研究打下理論基礎(chǔ)，為提高半夏愈傷組織中總生物堿、鳥苷和腺苷含量提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以半夏幼嫩葉柄為外植體，參照曹瑞霞等[10]的方法誘導(dǎo)半夏愈傷組織，其繼代培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IAA。選取培養(yǎng)了5代且生長均一、旺盛的半夏愈傷組織，分別接入添加如下外源物的11種培養(yǎng)基中（11個處理），分別是0 mg/L （CK）、50 mg/L Phe （T1）、150 mg/L Asp （T2）、1 mg/L SNP （T3）、1 mg/L ASA （T4）、50 mg/L Phe+150 mg/L Asp（T5）、50 mg/L Phe+1 mg/L ASA（T6）、150 mg/L Asp+1 mg/L ASA（T7）、1 mg/L SNP+1 mg/L ASA（T8）、50 mg/L Phe+1 mg/L SNP（T9）、1 mg/L SNP+150 mg/L Asp（T10），其中T1～T4是添加單一外源物處理，T5～T10是不同外源物兩兩復(fù)合處理。每個平板中接入4塊愈傷組織，每個處理10個平板，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為黑暗、（25±1） ℃、12 h/d，30 d后取出愈傷組織進行各項指標(biāo)的測定，每個指標(biāo)重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織相對生長速率的測定 培養(yǎng)30 d后取出愈傷組織，洗去培養(yǎng)基后用吸水紙吸干水分稱其鮮重，并計算半夏愈傷的相對生長速率。

相對生長速率=（收獲鮮重-接種鮮重）/接種鮮重。

1.2.2 酶活性測定 參照Zhao等[11]的方法提取酶液，略有改動。精密稱取1 g培養(yǎng)30 d的各處理半夏愈傷組織，放于研缽中，共加8 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含2 mmol/L MgSO4、0.5 mmol/L EDTA、10 mmol/L β-巰基乙醇，pH 8.0），冰浴研磨，然后于4 ℃，10 000 r/min離心30 min，上清液用于有關(guān)酶活性的測定。其中GOGAT活性的測定參考王小純等[12]的方法，GDH活性的測定參照Loulakakis等[13]的方法，GOT活性的測定參照莫良玉等[14]的方法，PAL活性的測定參照孫健玲[15]的方法；以每分鐘增加0.01個OD值為一個酶活性單位（U）。

1.2.3 有關(guān)成分含量測定 采用考馬斯亮藍G250比色法[16]測定半夏愈傷組織中的可溶性蛋白含量，采用紫外分光光度法[17]測定半夏愈傷組織中的總生物堿含量。鳥苷和腺苷含量的測定采用HPLC分析法[10]，鳥苷保留時間約為5.5 min，腺苷保留時間約為10 min，色譜峰分離情況見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加物對半夏愈傷組織生長的影響

不同的外源添加物對半夏愈傷組織相對生長速率的影響情況見圖2。由圖2可知，在單獨添加適宜濃度外源物的處理（T1～T4）中，T2、T3、T4處理的半夏愈傷組織相對生長速率均增加，但T1處理的半夏愈傷組織相對生長速率比對照減少24%；不同外源物兩兩復(fù)合添加處理（T5～T10）對半夏愈傷組織的生長速率均具有促進作用，以T10處理（1 mg/L SNP+150 mg/L Asp）的促進效果最好，其相對生長速率達3.273，比對照增加131.0%。

2.2 外源添加物對半夏愈傷組織中GOGAT活性的影響

植物的氮代謝包括無機氮的還原、同化及有機含氮化合物的轉(zhuǎn)化、合成等生化過程[14]，GS/GOGAT偶聯(lián)形成的循環(huán)是高等植物體內(nèi)氮同化的主要途徑，在無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮的過程中起關(guān)鍵作用，而GOGAT是此循環(huán)中的關(guān)鍵酶[18]；不同的外源添加物對半夏愈傷組織中GOGAT活性的影響情況見圖3。由圖3可知，單獨添加Phe、Asp、SNP、ASA（T1-T4） 均有利于半夏愈傷組織中GOGAT活性的提高，分別比對照增加了57.1%、20.8%、78.0%、62.7%；將Phe、Asp、SNP、ASA兩兩復(fù)合加入半夏愈傷組織培養(yǎng)基中（T5-T10），則T5、T6、T7、T9處理增加了GOGAT的活性，且T7比對照增加了111.1%。

2.3 外源添加物對半夏愈傷組織中GDH活性的影響

在植物體內(nèi)的GDH可催化谷氨酸脫氨，生成的NH4+進入GS/GOGAT循環(huán)再利用，因此GDH有輔助GS/GOGAT循環(huán)的作用[19，20]，在植物的新陳代謝中占有非常重要的地位；不同的外源添加物對半夏愈傷組織中GDH活性的影響情況見圖4。由圖4可知，單獨添加Phe、Asp、SNP、ASA（T1～T4）的處理均能誘導(dǎo)GDH活性增加，以T3處理的增加最明顯，比對照增加了77.4%；當(dāng)Phe、Asp、SNP、ASA兩兩復(fù)合添加后，T5～T10處理均可使半夏愈傷組織中的GDH活性提高。綜合比較T1～T10處理后發(fā)現(xiàn)，T7和T9處理最有利于半夏愈傷組織中GDH活性的提高，分別比對照增加87.4%、83.8%。

2.4 外源添加物對半夏愈傷組織中GOT活性的影響

GOT是一種轉(zhuǎn)氨酶，在植物的氮代謝過程中占有非常重要的地位。GS/GOGAT途徑和GDH/GOGAT途徑合成的谷氨酸在GOT作用下，可將氨基可逆地轉(zhuǎn)移到草酰乙酸的羰基上形成天冬氨酸和α-酮戊二酸，天冬氨酸是半夏總生物堿和鳥苷、腺苷合成的底物，其活性受底物谷氨酸含量的影響；不同的外源添加物對半夏愈傷組織中GOT活性的影響情況見圖5。由圖5可知，在T1～T4處理中，T4處理的GOT活性升高最多，比對照增加52.0%，T3、T1、T2處理次之，分別比對照增加了42.4%、40.0%、39.2%。對于T5～T10處理而言，T5，T6，T7，T8，T9處理均促進了GOT活性的提高，且T7處理（1 mg/L ASA+150 mg/L Asp）的效果最好，比對照增加106.3%；但T10處理比對照降低了50.0%。

2.5 外源添加物對半夏愈傷組織中PAL活性的影響

PAL是連接植物初生代謝與次生代謝的重要酶，可將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸，進一步生成苯甲醛，再在天冬氨酸、甘氨酸協(xié)同作用下合成麻黃堿。其活性易受到病原菌感染、低溫、光照、機械損傷、毒素及昆蟲取食等多種外界因素的影響[21]；不同的外源添加物對半夏愈傷組織中PAL活性的影響情況見圖6。由圖6可知，在T1～T4處理中，T1、T3處理的活性較高，分別是對照的126.9%，128.9%。當(dāng)Phe，Asp，SNP，ASA兩兩復(fù)合添加到半夏愈傷組織培養(yǎng)基處理（T5～T10）后，除T10處理抑制PAL活性外，其他各處理均提高了PAL活性，其中T7處理增加幅度最大，比對照增加63.9%。

2.6 外源添加物對半夏愈傷組織中可溶性蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)有機物代謝強弱的主要生理指標(biāo)[22]，其中可溶性蛋白大多數(shù)是參與各種代謝的酶類及底物，所以可溶性蛋白含量可作為反映植物總代謝的一個重要指標(biāo)；不同的外源添加物對半夏愈傷組織中可溶性蛋白含量的影響情況見圖7。由圖7可知，半夏愈傷組織中的可溶性蛋白含量均有增加，其中T7處理比對照提高107.9%，增幅最大。

2.7 外源添加物對半夏愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物含量的影響

不同的外源添加物對半夏愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物含量的影響情況見表1。從表1可見。T7處理的半夏愈傷組織中總生物堿和鳥苷的含量與對照相比增加幅度大，最高含量分別比對照提高了131.0%、146.7%，腺苷含量卻大大低于對照；其中T10處理則抑制了半夏愈傷組織中的總生物堿和腺苷的積累，分別比對照降低了1.8%、71.4%，鳥苷含量則高于對照1倍。

3 小結(jié)與討論

3.1 前體物Asp和Phe對半夏愈傷組織中氮代謝和次生代謝物合成的影響

試驗中添加Asp和Phe對半夏愈傷組織內(nèi)GOGAT、GDH、GOT、PAL活性及可溶性蛋白、總生物堿、鳥苷、腺苷含量均產(chǎn)生了影響。有研究指出，氨基酸進入植物體內(nèi)后，可通過轉(zhuǎn)氨基、脫氨基作用及其他過程加以同化[23]。向半夏愈傷組織培養(yǎng)基中分別添加適宜濃度的Phe（T1）、Asp（T2）后，發(fā)現(xiàn)半夏愈傷組織的GOGAT、GDH、GOT活性明顯高于對照，說明半夏可能通過調(diào)節(jié)這些酶來適應(yīng)氨基酸環(huán)境。當(dāng)半夏吸收氨基酸態(tài)氮之后，一方面通過GOT轉(zhuǎn)氨酶形成其他氨基酸、合成蛋白質(zhì)及核酸等含氮類化合物；另一方面通過GDH脫氨基形成NAD（P）H，為體內(nèi)的生命活動及次生代謝提供能量。GOT轉(zhuǎn)氨酶作用和GDH脫氨基作用均形成α-酮戊二酸，而α-酮戊二酸為多種碳氮代謝提供碳架結(jié)構(gòu)[24]，還可參與三羧酸循環(huán)提供能量[25]。PAL是一種誘導(dǎo)酶，試驗中PAL活性多數(shù)處理顯著高于對照，可能是Phe、Asp刺激了半夏愈傷組織中PAL酶基因的表達，增加了PAL的數(shù)量及活性。而且添加了Phe（T1）、Asp（T2）處理的半夏愈傷組織中可溶性蛋白含量要高于對照，說明Phe、Asp的添加增加了半夏愈傷組織內(nèi)的酶數(shù)量及游離氨基酸含量，提高了半夏新陳代謝效率。

3.2 誘導(dǎo)子SNP和ASA對半夏愈傷組織中氮代謝和次生代謝產(chǎn)物合成的影響

一氧化氮（NO）作為一個重要的信號分子參與植物體內(nèi)多種生理過程的調(diào)節(jié)。SNP調(diào)控植物氮代謝的研究已有報道，如張少穎等[26]發(fā)現(xiàn)外源NO浸種能促進玉米（Zea mays L.）幼苗葉片NR活性的提高；焦娟[27]研究表明，添加SNP可緩解NO3-脅迫中NR、GS、GDH等酶活性的降低。試驗發(fā)現(xiàn)，向半夏愈傷組織培養(yǎng)基中添加SNP后，其體內(nèi)GOGAT、GDH、GOT等酶活性顯著高于對照，可能是NO提高了細胞中NR活性[28]、將植物吸收的NO3-還原成NH4+、細胞中NH4+的增多又促使GOGAT和GDH以及GOT等活性增加、加速無機氮向有機氮同化及轉(zhuǎn)化造成的。另一方面，NO可誘導(dǎo)PAL基因表達，提高PAL活性[29]，適宜濃度SNP的添加顯著提高了半夏愈傷組織中PAL活性，這與胡向陽等[30]的結(jié)果一致。由此可知，SNP可能通過提高植物氮代謝及次生代謝相關(guān)酶活性來提高半夏愈傷組織中總生物堿、鳥苷和腺苷的含量。郝崗平等[31]在研究銀杏（Ginkgo biloba L.）懸浮細胞的黃酮類物質(zhì)生成時發(fā)現(xiàn)，NO可能通過觸發(fā)銀杏懸浮細胞的防衛(wèi)反應(yīng)，激活細胞中黃酮類物質(zhì)的生物合成途徑。但對于NO是否在半夏愈傷組織中觸發(fā)其防衛(wèi)反應(yīng)，通過氮、碳代謝共同作用引起次生代謝物含量的提高，還有待于下一步試驗證實。

ASA是SA的衍生物，在植物體內(nèi)可調(diào)節(jié)多種生理過程[32，33]。有研究表明，外源添加物ASA可提高植物體內(nèi)SA水平，并通過SA的生理效應(yīng)實現(xiàn)其生理功能[34]。試驗發(fā)現(xiàn)，添加適宜濃度的ASA提高了半夏愈傷組織中GOGAT、GDH、GOT活性及可溶性蛋白含量，可能是因為SA誘導(dǎo)了半夏中NR的mRNA積累、促使NR活性的提高所致[35]；也有可能是SA同時提高了氮還原動力NR活性及氮同化動力泵GS活性，加之轉(zhuǎn)氨酶活性[36]，從而加速了無機氮的吸收、同化及轉(zhuǎn)運，合成游離氨基酸及可溶性蛋白，并產(chǎn)生能量，這些物質(zhì)均為半夏愈傷組織中總生物堿、鳥苷及腺苷合成提供了底物及能量。試驗結(jié)果表明，ASA的添加提高了半夏愈傷組織中PAL活性，可能是SA誘導(dǎo)了PAL基因的表達緣故[37]。研究發(fā)現(xiàn)，添加誘導(dǎo)子ASA后，GOGAT、GDH、GOT、PAL活性與總生物堿、鳥苷、腺苷含量呈一定的正相關(guān)，說明ASA可能通過提高氮代謝及次生代謝相關(guān)酶的活性，直接或間接提供半夏愈傷組織中總生物堿、鳥苷和腺苷合成所需的底物及能量，從而來提高半夏愈傷組織中總生物堿、鳥苷和腺苷的含量。

3.3 外源物復(fù)合添加對半夏愈傷組織中氮代謝和次生代謝產(chǎn)物合成的影響

當(dāng)Phe、Asp、SNP、ASA兩兩復(fù)合加入時，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子與前體物復(fù)合添加均提高了半夏體內(nèi)GOGAT、GDH、GOT、PAL活性及可溶性蛋白含量，其中以ASA與Asp復(fù)合（T7）的效果最好，可能是前體物的加入為半夏氮代謝及次生代謝提供了底物，而誘導(dǎo)子進一步提高了GOGAT、GDH、GOT等氮代謝酶及PAL活性，加速了無機氮的同化及轉(zhuǎn)化，為半夏愈傷組織中總生物堿、鳥苷及腺苷積累提供了更多的底物及能量。SNP與ASA復(fù)合卻抑制了各酶的活性及次生代謝物的合成，可能是因為二者濃度不合適或者沒有協(xié)同作用，也可能是加入的時間不合適，其原因有待下一步比較。

總之，適宜濃度的SNP、ASA、Phe、Asp可通過提高半夏愈傷組織中的GOGAT、GDH、GOT、PAL活性，加速無機氮的同化及轉(zhuǎn)化效率來促進總生物堿、鳥苷和腺苷的合成與積累。

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