陳培琳, 陳釧杰, 周雨嘉, 沈瑾燁, 張 怡, 鄭寶東, 曾紅亮

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化蓮子心多糖的提取工藝

陳培琳1, 陳釧杰1, 周雨嘉1, 沈瑾燁2, 張 怡1, 鄭寶東1, 曾紅亮1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

為研究蓮子心多糖熱水浸提的最佳工藝，在考察浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比對多糖得率影響的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對熱水浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對提取前后蓮子心粉末和蓮子心多糖進(jìn)行環(huán)境掃描電鏡觀察和紅外光譜掃描.結(jié)果表明，蓮子心多糖最佳的熱水浸提工藝條件為：浸提溫度92 ℃、浸提時(shí)間2.6 h、液料比49∶1(mL∶g)，該條件下的多糖得率為(14.49±0.06)%.環(huán)境掃描電鏡觀察結(jié)果表明，提取前后的蓮子心粉末的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別，蓮子心多糖呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).紅外光譜掃描結(jié)果顯示，蓮子心多糖主要以呋喃環(huán)和α型糖苷鍵為主.這表明熱水浸提法能將多糖較好地從蓮子心細(xì)胞中提取出來，響應(yīng)面分析法能較好地應(yīng)用在蓮子心多糖熱水浸提工藝的研究中.

蓮子心; 多糖; 響應(yīng)面分析法; 提取工藝

蓮子心又名苦薏、名薏、蓮心和蓮薏，系睡蓮水生植物的成熟種子中間的綠色胚根(蓮心)[1]，湖南、江西、湖北、江蘇、福建和浙江等地都有產(chǎn)蓮[2].中國四大歷史名蓮包括浙江宣蓮、湖南湘蓮、江西廣昌白蓮和福建建蓮，福建建寧有“建蓮之鄉(xiāng)”的美稱.研究表明，蓮子心具有多重的營養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、生物堿、黃酮類物質(zhì)、β-谷甾醇、棕櫚酸、正辛烷酸酯以及鐵、鎂、鈣等微量元素[3-4]，具有多種生理活性，如抗?jié)?、抗血栓、?zhèn)痛，抗腹瀉、加強(qiáng)子宮收縮等[5-7].

蓮子心多糖為蓮子心的主要活性成分之一，目前，對蓮子心多糖的研究較少.Liao et al[8]探究純化后的蓮子心多糖的抗炎作用；俞遠(yuǎn)志等[9]對蓮子心多糖的提取純化、中性單糖的組成及抗氧化活性進(jìn)行了初步的探究.多糖是極性大分子物質(zhì)，不易溶于冷水，易溶于熱水，不溶于醇、醚和丙酮等有機(jī)溶劑.目前，多糖的提取方法有超聲波輔助法、微波輔助法、酸堿提取法和熱水浸提法等，超聲波輔助法和微波輔助法需要特殊的設(shè)備，大大增加了提取費(fèi)用[10-11]，且長時(shí)間的超聲波和微波都會破壞糖鏈結(jié)構(gòu)，改變其活性，且微波還會導(dǎo)致物料受熱不均[12]；酸堿提取法則容易降解多糖，不利于后續(xù)研究多糖的構(gòu)效關(guān)系[13].劉韶等[14]采用正交試驗(yàn)對蓮子心多糖水煎煮工藝進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果表明，蓮子心多糖得率為(3.19±0.17)%.目前多采用沸水提取蓮子心多糖，用沸水直接燉煮，所得多糖得率較低，能耗相對較高.尋找對多糖結(jié)構(gòu)影響較小且提取率較高的提取方法至關(guān)重要.目前尚未見采用環(huán)境掃描電鏡分析提取前后蓮子心粉末和蓮子心多糖的報(bào)道.

本試驗(yàn)采用熱水浸提法提取蓮子心多糖，在考察浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比等3個(gè)單因素對多糖得率影響的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法對熱水浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對提取前后蓮子心粉末和蓮子心多糖進(jìn)行環(huán)境掃描電鏡觀察，旨在研究蓮子心多糖熱水浸提的優(yōu)化工藝，探索熱水浸提方法對蓮子心粉末和蓮子心多糖微觀結(jié)構(gòu)的影響，研究蓮子心多糖的紅外光譜，為進(jìn)一步對蓮子心多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征和功能活性開發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

蓮子心購自福建建寧；無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑；本試驗(yàn)用水為雙蒸水.

儀器與設(shè)備有RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海開邁科學(xué)儀器有限公司)、FW100型高速植物粉碎機(jī)(尚族機(jī)電有限公司)、AR224CN精密分析天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司]、TDZ4-WS型臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、XL30 ESEM-TMP環(huán)境掃描電鏡(荷蘭Philips-FEI公司)、HH-4型恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、數(shù)顯電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)、傅里葉紅外光譜(美國尼高力公司)和鹵素快速水分測定儀(深圳市冠亞電子科技有限公司).

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 在50 ℃恒溫干燥箱中，將新鮮的蓮子心進(jìn)行烘干處理，用植物粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，得到蓮子心粉末樣品.取一定量的蓮子心粉末，采用鹵素快速水分測定儀測定水分含量，測得蓮子心粉末的水分含量小于3%.

1.2.2 提取工藝流程 取一定量的蓮子心粉末樣品，加入一定比例的雙蒸水在一定的溫度下浸提，于4 000 r·min-1離心20 min后取上清液.上清液中加入4倍體積的無水乙醇沉降20 h，于4 000 r·min-1離心20 min ，將沉淀用雙蒸水溶解減壓濃縮后冷凍干燥，稱重.

1.2.3 多糖得率的測定 多糖得率/%=多糖質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100.式中，多糖質(zhì)量：經(jīng)乙醇醇析，雙蒸水溶解減壓濃縮冷凍干燥稱重得到；樣品質(zhì)量：用于提取的蓮子心粉末的質(zhì)量.

1.2.4 單因素試驗(yàn) 取5.00 g試驗(yàn)樣品，以蓮子心多糖得率為指標(biāo)，研究浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比(文中均為mL∶g)對多糖得率的影響.分別選取浸提溫度為50、60、70、80、90、100 ℃，浸提時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1進(jìn)行單因素試驗(yàn)(平行試驗(yàn)3次).

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過二次回歸分析的方法研究浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比對多糖得率的影響.

1.2.6 環(huán)境掃描電鏡觀察 取一定量的提取前后的蓮子心粉末和蓮子心多糖于樣品臺上，置真空噴鍍儀內(nèi)鍍導(dǎo)電層鉑，厚度10 nm，采用掃描電鏡觀察，電子槍加速電壓為15 keV.

1.2.7 紅外光譜掃描 取一定量的蓮子心多糖粉末研磨后，按1∶(100～200)的比例加入干燥后的溴化鉀繼續(xù)研磨，研磨均勻后，將粉末裝入壓片磨具中壓成薄片，于紅外光譜下掃描，掃描波長4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1.

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert 8.0.6和Spss 13.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸提溫度對蓮子心多糖得率的影響 稱取5.00 g蓮子心粉末，加入150 mL雙蒸水，分別在50、60、70、80、90和100 ℃下浸提1 h.結(jié)果(圖1)顯示，浸提溫度為50～90 ℃時(shí)，蓮子心多糖得率隨著浸提溫度的升高而增大，溫度升高到90 ℃后隨著溫度的升高而減小.這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子運(yùn)動速率加快，提取液的粘度降低，多糖的溶解度升高，因此得率升高；當(dāng)溫度升高到90 ℃后，由于多糖被氧化及分子結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致多糖得率降低[15-16].因此，最適的浸提溫度為90 ℃.

2.1.2 浸提時(shí)間對蓮子心多糖得率的影響 稱取5.00 g蓮子心粉末，加入150 mL雙蒸水，在浸提溫度為90 ℃的條件下，分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h.結(jié)果(圖2)顯示：浸提0.5～2.5 h時(shí)，蓮子心多糖得率隨著浸提時(shí)間的增加而增大；浸提2.5～3.5 h時(shí)，多糖得率隨著浸提時(shí)間的增加而下降.這可能是因?yàn)殡S著浸提時(shí)間的增加，蓮子心被破壞的細(xì)胞數(shù)量增加，釋放出的多糖增加，當(dāng)浸提時(shí)間增加到2.5 h后，釋放出的多糖被水解，從而導(dǎo)致多糖得率下降[17-18].因此，浸提時(shí)間選擇2.5 h.

圖1 浸提溫度對蓮子心多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of lotus plumula

圖3 液料比對蓮子心多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid/material ratio on the yield of lotus plumula

2.1.3 液料比對蓮子心多糖得率的影響 稱取5.00 g蓮子心粉末，分別加入50、100、150、200、250、300和350 mL雙蒸水，在浸提溫度為90 ℃的條件下浸提2.5 h.結(jié)果(圖3)顯示：液料比為(10～50)∶1時(shí)，蓮子心多糖得率隨著液料比的增大而提高；液料比為(50～70)∶1時(shí)，多糖得率隨著液料比的增大而下降.這可能是因?yàn)橐毫媳葹?50～70)∶1時(shí)，隨著液料比的增大，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的濃度差不斷增大，導(dǎo)致多糖的傳質(zhì)驅(qū)動力增大；當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，由于溶劑滲透到細(xì)胞內(nèi)部的擴(kuò)散距離增大，導(dǎo)致時(shí)間延長，多糖得率下降[19-20].因此，液料比選擇50∶1.

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取浸提溫度(A)、浸提時(shí)間(B)和液料比(C)為自變量，以多糖得率(Y)為衡量指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平，進(jìn)行響

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)蓮子心多糖提取試驗(yàn)的因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface design for polysaccharide extraction from lotus plumula

應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，各試驗(yàn)因素和水平見表1.

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2.表2中，1～12號為析因試驗(yàn)點(diǎn)，13～19號為中心試驗(yàn)點(diǎn).

2.3 模型的建立以及顯著性分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析浸提溫度、浸提時(shí)間和液料比3個(gè)因素對多糖得率的影響，建立二次多元回歸模型為：

Y=14.414 3+0.517 5A+0.261 2B-0.093 8C+0.395 0AB+0.185 0AC-0.157 5BC-1.565 9A2-1.413 4B2-0.603 4C2

表2 蓮子心多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and polysaccharide yield from lotus plumula

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果1)Table 3 Variance analysis of quadratic regression model

2.4 響應(yīng)面的交互作用

由表3可知，各因素對蓮子心多糖得率的影響程度大小為：A>B>C.A、B和C二次項(xiàng)系數(shù)均小于零，拋物面開口向下且有極大值點(diǎn)[22].

由圖4可知：響應(yīng)面坡度較陡，說明浸提溫度和浸提時(shí)間對多糖得率的影響較大；響應(yīng)面的等高線呈橢圓形，當(dāng)液料比為50∶1，浸提溫度為87～97 ℃，浸提時(shí)間為2.25～2.75 h時(shí)，多糖得率較高，說明二者的交互作用顯著.由圖5和6可知，響應(yīng)面坡度平緩，說明浸提溫度與液料比的交互作用、浸提時(shí)間與液料比的交互作用不顯著.從圖4～6可知，各圖形直觀地反映了各因素的交互作用對多糖得率的影響，這與方差分析的結(jié)果一致.

圖4 浸提溫度與浸提時(shí)間的交互作用對蓮子心多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface and contour plot of extraction tempeture and time on the yield of lotus plumula

圖5 浸提溫度與液料比的交互作用對蓮子心多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plot of extraction tempeture and liquid/material ratio on the yield of lotus plumula

圖6 浸提時(shí)間與液料比的交互作用對蓮子心多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour plot of extraction time and liquid/material ratio on the yield of lotus plumula

2.5 提取工藝的確定

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析可得蓮子心多糖熱水浸提的最佳工藝條件為：浸提溫度91.77 ℃、浸提時(shí)間2.56 h、液料比49.33∶1，在此條件下，回歸模型預(yù)測的多糖得率為14.48%.結(jié)合實(shí)際操作條件的需要，將最佳工藝條件優(yōu)化為：浸提溫度92 ℃、浸提時(shí)間2.6 h、液料比49∶1.在該條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，多糖得率分別為14.43%、14.55%和14.49%，平均值為(14.49±0.06)%，與理論預(yù)測值基本一致，說明優(yōu)化的工藝可行性強(qiáng)，可以用來預(yù)測蓮子心多糖的得率.

2.6 環(huán)境掃描電鏡觀察

a、b、c分別為1 000、2 000、5 000倍鏡下提取前的蓮子心粉末；A、B、C分別為1 000、2 000、5 000倍鏡下提取后的蓮子心粉末.圖7 提取前后蓮子心粉末的環(huán)境掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope of lotus plumula power

采用環(huán)境掃描電鏡觀察提取前后的蓮子心粉末和蓮子心多糖的微觀形貌結(jié)構(gòu)(圖7、8).

從圖7可以觀察到，熱水浸提前，即未經(jīng)任何處理的蓮子心粉末組織呈現(xiàn)出完整的塊狀和顆粒狀，顆粒飽滿，無折痕和裂痕，形狀不規(guī)則，較為復(fù)雜[23].熱水浸提后，蓮子心粉末在1 000倍鏡下可以觀察到細(xì)胞不規(guī)則的收縮，其原因可能是：(1)提取時(shí)由于細(xì)胞內(nèi)外的濃度差引起的細(xì)胞吸水及在加熱的條件下細(xì)胞表面受熱發(fā)生扭曲的共同作用，細(xì)胞漲破，細(xì)胞的內(nèi)容物被釋放出來，出現(xiàn)不規(guī)則褶皺，使細(xì)胞發(fā)生潰陷[24]；(2)植物細(xì)胞壁是一種植物細(xì)胞初生壁，由纖維素、半纖維素、果膠以及一些蛋白質(zhì)等以不同的比例結(jié)合在一起構(gòu)成的，部分細(xì)胞還具有的次生壁以及在相鄰兩個(gè)植物細(xì)胞之間起連接作用的胞間層[25]，O—糖苷鍵是由部分鑲嵌著的包間層上可能為蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)殘基上的羥基與纖維素，半纖維素和果膠大量碳水化合物結(jié)合而成[26]，在長時(shí)間的水和熱的作用下，O—糖苷鍵斷裂，使細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞的內(nèi)容物釋放出來；(3)在細(xì)胞壁的中間層，起支撐與連接作用的成分可能是蛋白質(zhì)[27]，在較高溫度和水的作用下，蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而發(fā)生扭曲變構(gòu)，彼此靠近凝集，細(xì)胞壁破裂，從而將細(xì)胞的內(nèi)容物釋放出來；(4)在較高的溫度下破壞了細(xì)胞膜的完整性，致使細(xì)胞膜內(nèi)的有效成分被溶劑提取[28].在2 000和5 000倍鏡下可以更清楚地觀察到細(xì)胞皺縮的程度及細(xì)胞壁保持的狀態(tài)，細(xì)胞壁沒有出現(xiàn)裂痕.

A、B、C分別為100、2000、5000倍鏡下的蓮子心多糖.圖8 蓮子心多糖的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscope of lotus plumula

圖8顯示：在100倍鏡下可以粗略地觀察到多糖呈塊狀結(jié)構(gòu)；在2 000倍鏡下可以明顯看到多糖呈連綿的山峰狀和蜂窩狀.產(chǎn)生連綿的山峰狀的原因可能是由于多糖分子存在一定的聚集體，從而導(dǎo)致其規(guī)整性不強(qiáng)；而呈現(xiàn)蜂窩狀的原因可能是因?yàn)槎嗵欠肿渔滈g形成細(xì)微網(wǎng)絡(luò)的多孔結(jié)構(gòu)，且蜂窩狀表面較緊密、平整，有較多的暗紋出現(xiàn)，表明多糖分子存在聚集體，此狀態(tài)可能是由于提取時(shí)在大量的水和長時(shí)間熱的作用下，大量多糖分子或分子基團(tuán)聚集成不同式樣的束所形成的.此外，多糖分子間存在大量不規(guī)則的交叉網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明多糖分子存在分支結(jié)構(gòu)且分子間的相互作用較強(qiáng)[29].而在5 000倍鏡下，雖然能更清楚看到連綿的山峰狀和蜂窩狀結(jié)構(gòu)，但連綿的山峰狀結(jié)構(gòu)中有少量裂痕出現(xiàn)，說明多糖聚集體之間相互存在排斥力，分子間的作用力不夠強(qiáng).

2.7 紅外光譜掃描

蓮子心多糖紅外光譜(圖9)顯示，掃描波長為4 000～400 cm-1時(shí)都有多糖的特征峰.3 431 cm-1處有糖分子內(nèi)或分子間—OH的振動峰；2 928 cm-1處有—CH2—中C—H的伸縮振動峰和彎曲振動峰，存在一定的甲基和亞甲基結(jié)構(gòu)；1 650 cm-1處有COO—的非對稱伸縮振動峰；1 543 cm-1處有C—C骨架振動峰；1 448 cm-1處有COO—的對稱伸縮振動峰；1 390 cm-1處有C—H的彎曲振動峰；1 010～1 100 cm-1處有1 083和1 048 cm-1兩個(gè)吸收峰，為呋喃環(huán)；845 cm-1有吸收峰.表明蓮子心多糖主要以α型糖苷鍵為主.

圖9 蓮子心多糖的紅外光譜Fig.9 FT-IR spectra of lotus plumula

3 結(jié)論

蓮子心多糖最佳的熱水浸提工藝條件為：浸提溫度92 ℃、浸提時(shí)間2.6 h、液料比49∶1，該條件下的多糖得率為(14.49±0.06)%，相比劉韶等[14]采用水煎煮法提取蓮子心多糖，得率提高了354%.

環(huán)境掃描電鏡觀察顯示：提取前后的蓮子心細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別，表明熱水浸提法能較好地將多糖從蓮子心細(xì)胞中浸提出來，得到的多糖呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；多糖存在結(jié)構(gòu)聚集行為.紅外光譜掃描顯示，蓮子心多糖主要以呋喃環(huán)和α型糖苷鍵為主.從多糖得率和微觀結(jié)構(gòu)兩個(gè)方面探索提取方法對蓮子心多糖的影響，可為蓮子心多糖構(gòu)效關(guān)系的研究提供參考.

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Optimizationofextractiontechnologyofpolysaccharidesfromlotusplumulabyresponsesurfacemethodology

CHEN Peilin1, CHEN Chuanjie1, ZHOU Yujia1, SHEN Jinye2, ZHANG Yi1, ZHENG Baodong1, ZENG Hongliang1

(1.College of Food Science; 2.College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

In order to investigate hot water extraction technology for extracting polysaccharides from lotus plumula, effects of extraction temperature, time, ratio of water volumn to raw material weight (liquid/material ratio) on the yield of polysaccharides were evaluated by response surface methodology. Moreover, microstructure of lotus powder before or after extraction were examined by environmental scanning electron microscope and lotus plumula was detected by infrared spectrum scanning. The results showed that the optimum extraction condition was to extract lotus plumula at 92 ℃ for 2.6 h under liquid/material ratio of 50∶1 (mL∶g). Under this condition, the yield of polysaccharides was up to (14.49±0.06)%, which was consistent with the predicted theoretical value. Environmental scanning electron microscope showed that lotus powder was very different from it before extraction. Also polysaccharide molecules aggregated and formed a porous network structure along with the extraction. Infrared spectrum scanning showed that polysaccharide of lotus seed was mainly composed of furan ring and alpha glycosidic bond, proving that polysaccharide was fully released from cell membrane after a long period of water immersion and thermal effect. Furthermore, response surface methodology was a potential method for optimizing extraction technology of lotus plumula.

lotus plumula; polysaccharides; response surface methodology; extraction technology

2017-07-31

2017-10-18

福建省科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(KRC16002A)；福建省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(閩教科[2012]03號)；福建農(nóng)林大學(xué)杰出青年科研人才計(jì)劃項(xiàng)目(XJQ201714)；福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)展基金項(xiàng)目(KFA17197A).

陳培琳(1994-)，男，碩士研究生.研究方向：食品營養(yǎng)與化學(xué).Email：634856574@qq.com.通訊作者曾紅亮(1986-)，男，碩士生導(dǎo)師.研究方向：食品營養(yǎng)與化學(xué).Email：zhlfst@163.com.

TS255.1

A

1671-5470(2017)06-0708-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.06.018

(責(zé)任編輯:施曉棠)