段佩玲，夏河山

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451460)

健骨IV號(hào)對(duì)骨組織修復(fù)相關(guān)因子的調(diào)控作用

段佩玲，夏河山

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451460)

目的：明確專利藥物健骨Ⅳ號(hào)對(duì)骨組織修復(fù)相關(guān)因子的調(diào)控作用。方法：液氮冷凍成功建造30個(gè)大鼠股骨頭壞死模型，將它們隨機(jī)分成3組,即正常手術(shù)組、模型組、加藥組。定期對(duì)各組大鼠進(jìn)行X線片觀察；手術(shù)4周后分別提取總RNA,進(jìn)行成骨轉(zhuǎn)化因子Cbfa1、OSX兩對(duì)基因的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增。結(jié)果：加藥組在X線片和Cbfa1、OSX兩對(duì)成骨調(diào)控因子mRNA表達(dá)等改變均較正常手術(shù)組和模型組明顯。結(jié)論：從骨質(zhì)生成的角度明確健骨Ⅳ號(hào)對(duì)成骨轉(zhuǎn)化因子的調(diào)控作用，為健骨Ⅳ號(hào)治療股骨頭壞死的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

健骨IV號(hào)；Cbfa1；OSX；骨組織；修復(fù)

股骨頭壞死，又稱股骨頭缺血性壞死，為常見的骨關(guān)節(jié)病之一，大多因風(fēng)濕病、血液病、潛水病、燒傷等疾患引起，先破壞鄰近關(guān)節(jié)面組織的血液供應(yīng)，進(jìn)而造成壞死。近年來，隨著生活方式的改變以及外傷、飲酒、激素類藥物大量應(yīng)用等原因，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?，F(xiàn)在治療股骨頭壞死的方法越來越多，傳統(tǒng)的物理療法和組織工程新技術(shù)各有利弊。相對(duì)各種保髖手術(shù)和關(guān)節(jié)置換術(shù)等方法，中藥通過活血化瘀、益氣通絡(luò)重建血供、促進(jìn)骨的修復(fù)等方面具有不可取代的優(yōu)勢(shì)。中藥治療股骨頭壞死主要是通過調(diào)節(jié)全身氣血運(yùn)行、補(bǔ)益肝腎，達(dá)到祛瘀生新、修復(fù)壞死的目的。

在骨科疾病的治療上，骨的修復(fù)與功能重建是判斷療效的關(guān)鍵指標(biāo)之一。已有研究表明：Cbfa1和其下游OSX基因是骨礦化的重要轉(zhuǎn)錄因子，具有明確的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和成骨效應(yīng)。Cbfa1的超表達(dá)可以使成骨細(xì)胞和非成骨細(xì)胞系的骨鈣素表達(dá)上調(diào)，Cbfa1基因的表達(dá)可以作為檢驗(yàn)成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志。OSX是一種具有鋅指基序結(jié)構(gòu)域、成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中所必需的轉(zhuǎn)錄因子。OSX可能是Cbfa1的下游基因,在OSX基因敲除小鼠與 Cbfa1基因敲除小鼠的表現(xiàn)型相似, 膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨過程均受阻。本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察專利藥物健骨Ⅳ號(hào)對(duì)骨組織中Cbfa1和OSX成骨轉(zhuǎn)錄因子的影響，明確健骨Ⅳ號(hào)對(duì)成骨轉(zhuǎn)化因子的調(diào)控作用，為健骨Ⅳ號(hào)治療股骨頭壞死的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠30只[購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2005-0001]，雌雄各半，體重200±20g。隨機(jī)分成3組：A組為正常手術(shù)組，B組為模型組，C組為加藥組。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：BIO IMAGING SYSTEM凝膠成像系統(tǒng)，OMNI TH組織均質(zhì)儀，低溫離心機(jī)(Centri￣fuge5415R)頭端打磨光滑的鋼絲(直徑約3mm)1根，液氮罐。

試劑：Trizol(14111)InvitrogenCorporationTa酶(CW0608)，dNTPsigmaRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒v04082010-2.1)，瓊脂糖(Agarose)(1103733)，Basingstoke,Ham￣pshire,England，2xTaq MasterMix(含染料04022010-2.1)，6×buffar(RD101-01)，Marker(D526A v2010.02)，溴化乙啶(EB)(1239-45-8Sigma)，絡(luò)合碘消毒液(有效碘含量為4500～5500 mg/L)，注射用青霉素鈉針，0.9%生理鹽水，醫(yī)用10%水合氯醛，10%二乙胺四乙酸鈉(Sigma)，多聚甲醛(自配)，石蠟等。

1.3 模型建造

大鼠→1%戊巴比妥鈉麻醉→股骨外側(cè)入路,切開皮膚皮下組織(均采用左側(cè)造模)→暴露股骨頭，保護(hù)周圍組織→快速液氮(-80℃)冷凍，20s/次，10次→溫生理鹽水復(fù)溫→明膠封口，逐層縫合→分組實(shí)驗(yàn)→觀察4周內(nèi)的變化(1周、2周、3周、4周)。

C組大鼠每日按40 mg/kg注射健骨Ⅳ號(hào)，均為左髖部肌肉注射。

2周后拍攝X線片可見軟骨下“新月征”，4周后可觀察到股骨頭關(guān)節(jié)面現(xiàn)明顯皺縮，有股骨頭碎裂及髓關(guān)節(jié)脫位現(xiàn)象。

1.4 骨RNA提取

1.5 cDNA反轉(zhuǎn)錄步驟：

總體積為20 ul。RT Mix5x為4 ul，Primer Mix為2 ul，RNA Template為xul，HiNi-MMLV Mix為1 ul， Nase-Free water為yul。震蕩混勻，短暫離心。反應(yīng)條件：①37℃，40 min；②70℃,10 min。反應(yīng)結(jié)束短暫離心，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃以下長(zhǎng)期保存。

1.6 PCR反應(yīng)

擴(kuò)增體系50 ul。ddH2O為36 ul，Taq酶(5 U/μl)為1 ul，10Xbuffer為5 ul，dNTP(10mM)為1 ul，Mg2+(2.5 mM)為3 ul，引物(10um)為各1 ul 共2 ul，2 ul cDNA模板。

PCR引物及反應(yīng)條件見表1。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

1.7 電泳分析

灰度掃描后，軟件分析測(cè)定其光密度。

凈密度值=(平均密度-背景密度)×面積

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 X線光片觀察

分別于術(shù)后第1周、第2周、第3周、第4周用醫(yī)用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g劑量腹腔內(nèi)注射麻醉后，采用鉬靶X線機(jī)拍自然位X線片(參數(shù)：24 kV,40 mA)，了解股骨頭骨質(zhì)情況及關(guān)節(jié)面情況。15天后對(duì)X線光片進(jìn)行觀察，各組均出現(xiàn)新月征，以此確定模型成功。4周后觀察模型對(duì)照組左側(cè)股骨頭軟骨下骨紋理越發(fā)稀疏，壞死更為明顯。藥物組有6只大鼠骨紋理明顯增多，新月征范圍明顯減少。與模型組比較，藥物組股骨頭壞死程度較輕,說明健骨Ⅳ號(hào)有助于股骨頭壞死部位的修復(fù)。

2.2 Cbfa1和OSX

分別對(duì)3組大鼠的Cbfa1和OSX進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)比，加藥組的兩對(duì)基因mRNA表達(dá)與正常組、模型組比較均有明顯提高(P<0.05)，28天的檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞四組基因的mRNA表達(dá)(n=6)

SampleCbfa1OSXHIF-1αVEGF正常手術(shù)組1.22±0.441.30±0.561.08±0.211.16±0.6模型組2.56±1.06*2.81±1.44*1.34±0.651.67±0.81加藥組4.08±1.23*4.22±1.57*3.78±1.23*3.62±1.53*

注：*P<0.05正常對(duì)照組

3 討論

在中醫(yī)藥治療股骨頭壞死的中藥組方上常選用活血化瘀、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨為主的藥物，如丹參、當(dāng)歸、川芍等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，這些藥物多具有改善局部血液循環(huán)、增加血容量、改善微循環(huán)的作用，其中有些還有增加細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性，提高超氧化物歧化酶的活性，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)因子的作用。中醫(yī)藥治療大多無創(chuàng)傷、毒副作用少，能夠有效地減輕患者疼痛癥狀、阻斷病程進(jìn)一步發(fā)展。因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜、生物利用度低、起效慢等，所以影響了其療效的評(píng)價(jià)和進(jìn)一步的機(jī)制研究。

本研究依據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，探索研究國(guó)家發(fā)明專利中藥藥物健骨Ⅳ號(hào)對(duì)成骨分化相關(guān)因子Cbfa1、OSX的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)健骨Ⅳ號(hào)能提高Cbfa1、OSX兩對(duì)成骨調(diào)控因子mRNA表達(dá)量，在一定程度上改善了股骨頭的血供。這與健骨Ⅳ號(hào)“活血”“補(bǔ)腎”的客觀實(shí)質(zhì)相互關(guān)聯(lián)。在細(xì)胞-分子水平明確了成骨分化與血管生成之間調(diào)控基因的相關(guān)性，為“祛瘀生新，填精生髓”提供了客觀 依據(jù)，豐富了股骨頭壞死的“血瘀論”，最大限度地發(fā)揮了中醫(yī)藥在股骨頭壞死治療中的作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步明確健骨Ⅳ號(hào)的作用機(jī)制，為尋找安全、高效、低廉與康復(fù)期短的股骨頭壞死治療新藥物提供理論依據(jù)。

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RegulationofJianguNo.ⅣRelatedFactorofBoneTissueRepair

DUAN Peiling, XIA Heshan

(Zhengzhou Railway Vocational and Technical College, Zhengzhou 451460, China)

Objective: To define the regulation of the specific patent medicine Jiangu No. IV to factors of bone tissue repair. Method: Built rat models of femoral head necrosis successfully by liquid nitrogen refrigeration. They were randomly divided into 3 groups: normal operation group, model group, operation of drug group. Observed them regularly by X-ray film. 4 weeks later, extracted total RNA respectively from the bone tissue of femoral head for PCR amplification of the osteoblast conversion factors Cbfa1and OSX. Results: mRNA expression of Cbfa1 and OSX in operation of drug group increase obviously. Conclusion：The regulation of Jiangu No. IV on osteoblast conversion factors was clear and definite from the angle of bone formation. That would provide theoretical basis for the clinical application of Jiangu No. IV.

Jiangu No.Ⅳ; Cbfa1; OSX

2017 - 06- 24

河南省科學(xué)技術(shù)廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(102102210088)

段佩玲(1972—)，女，河南鄭州人，鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，碩士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。

R96

A

1008-6811(2017)03-0023-03

方 艷]