劉啟勝

(大冶市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科 湖北 大冶 435100)

病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表達(dá)及意義

劉啟勝

(大冶市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科 湖北 大冶 435100)

目的：探討病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表達(dá)及意義。方法：采用Western bolt技術(shù)檢測46例病理性瘢痕組織、25例非病理性瘢痕組織和22例正常皮膚組織中凋亡相關(guān)因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3 的陽性表達(dá)率，并分析其相關(guān)性。結(jié)果：病理性瘢痕成纖維組織中Fas、caspase-3陽性表達(dá)率分別為21.74％、23.91％低于非病理性瘢痕的60.0％、72.0％和正常皮膚組織的86.36％、90.90％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；病理性瘢痕成纖維組織Bcl-2、survivin陽性表達(dá)率分別為78.26％、82.61％高于非病理性瘢痕的44.0％、48.0％和正常皮膚組織的13.64％、18.18％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮膚組織中上述指標(biāo)也存在明顯差異(P＜0.05)；Spearman相關(guān)分析顯示，F(xiàn)as蛋白與Bcl-2蛋白、survivin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.513、-0.629，P＜0.05)，與caspase-3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.691，P＜0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)與survivin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.6.16，P＜0.05)，與caspase-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.638，P＜0.05)，survivin蛋白表達(dá)與caspase-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.621，P＜0.05)。結(jié)論：病理性瘢痕成纖維組織中凋亡相關(guān)因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的異常表達(dá)，可能參與病理性瘢痕的形成。

病理性瘢痕；成纖維組織；凋亡相關(guān)因子；表達(dá)

瘢痕是創(chuàng)傷修復(fù)的必然結(jié)果，但過度修復(fù)可能造成纖維細(xì)胞功能異常，引起組織良性增生，出現(xiàn)病理性瘢痕，進(jìn)而影響局部周圍組織的正常功能。目前，病理性瘢痕的機(jī)制尚未完全明確。近年來，隨著細(xì)胞、分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞凋亡可能是病理性瘢痕的重要發(fā)病機(jī)制[1-2]。Fas是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要膜蛋白分子，也是介導(dǎo)成纖維細(xì)胞死亡的重要通道；Bcl-2家族直接影響細(xì)胞凋亡情況，Bcl-2蛋白作為Bcl-2家族中的抗細(xì)胞凋亡因子，可抑制成纖維細(xì)胞凋亡；survivin可作用于各個凋亡途徑的匯集點，抑制由caspase-3/caspase-7過度凋亡引起的細(xì)胞凋亡[3]。本研究主要分析病理性瘢痕成纖維組織細(xì)胞中相關(guān)凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3表達(dá)的陽性率，并與非病理性瘢痕和正常組織比較。

圖1 Fas在病理性瘢痕中表達(dá)(SP染色，400×)

圖2 Fas在正常組織中表達(dá)(SP染色，400×)

圖3 caspase-3在病理性瘢痕中表達(dá)(SP染色，400×)

圖4 caspase-3在非病理性瘢痕中表達(dá)(SP染色，400×)

圖5 caspase-3在正常組織中表達(dá)(SP染色，400×)

圖6 Bcl-2在病理性瘢痕中表達(dá)(SP染色，400×)

圖7 Bcl-2在正常組織中表達(dá)(SP染色，400×)

圖8 Survivin在病理性瘢痕中表達(dá)(SP染色，400×)

圖9 Survivin在非病理性瘢痕中表達(dá)(SP染色，400×)

1 資料和方法

1.1 臨床資料：標(biāo)本均來源于2015年1月-2016年1月本院整形外科行瘢痕切除的患者，均經(jīng)臨床病理證實。病理性瘢痕46例，男21例，女25例；年齡8～48歲，平均(27.16±2.86)歲；其中瘢痕疙瘩20例，增生性瘢痕26例。非病理性瘢痕均為傷后傷口界限內(nèi)生長，向外壓迫周圍組織，增殖后自行退化、攣縮而留下的纖維性組織，共選取25例，男12例，女13例；年齡7～53歲，平均(29.64±3.52)歲。正常皮膚組織為美容切除和全厚皮片移植剩余的全厚皮，共選取22例，男8例，女14例；年齡10～51歲，平均(29.41±3.94)歲。三組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。本次研究均取得患者的知情同意。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并皮膚病、結(jié)締組織病、傳染病、重要臟器官疾病者；②既往有放化療史、激光治療史者；③1年內(nèi)有局部注射藥物、瘢痕處接受外用藥物治療者。

1.3 方法：所有標(biāo)本離體后均用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，4～6μm厚切；常規(guī)脫蠟后置于蒸餾水新鮮配置的3％H2O2中，室溫孵育15min，消除標(biāo)本中內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾清洗3次，2min/次，PBS浸泡2次，5min/次；抗原修復(fù)后，蒸餾水洗5次，1min/次，PBS沖洗2次，3min/次；滴加二抗同種動物血清封閉血液，室溫下孵育10min；滴加一抗工作液，4℃恒溫下過夜，0.01ml PBS沖洗3次，5min/次；分別滴加即用型生物素標(biāo)記二抗、滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白工作液后孵育，0.01ml PBS沖洗3次，5min/次；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗后，1％鹽酸酒精分化，流水沖洗；二甲苯透明，中性樹膠封固；PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定[4-5]：Fas主要定位于成纖維細(xì)胞膜，Bcl-2、survivin、caspase-3主要定位于成纖維細(xì)胞漿，鏡下觀察切片著色強(qiáng)度及面積進(jìn)行評分。著色強(qiáng)度：0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性著色面積：0分，無著色；1分，著色面積＜1/3；2分，著色面積為1/3～2/3；3分，著色面積＞2/3。2項之和≥3分為陽性。1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用雙變量Spearman檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組標(biāo)本組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的表達(dá)：Fas在正常組織中的成纖維細(xì)胞膜內(nèi)呈棕黃色，caspase-3在正常皮膚組織成纖維細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色，非病理性組織和病理性瘢痕組織中少量表達(dá)(見圖1～5)；Bcl-2、survivin在病理性瘢痕組織成纖維細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色，非病理性瘢痕組織和正常皮膚組織中少量表達(dá)(見圖6～10)。

2.2 三組標(biāo)本組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的陽性表達(dá)率：病理性瘢痕成纖維組織中Fas、caspase-3陽性表達(dá)率分別為21.74％、23.91％低于非病理性瘢痕的60.0％、72.0％和正常皮膚組織的86.36％、90.90％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；Bcl-2、survivin陽性表達(dá)率分別為78.26％、82.61％高于非病理性瘢痕的44.0％、48.0％和正常皮膚組織的13.64％、18.18％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮膚組織中上述指標(biāo)也存在明顯差異(P＜0.05)。見表1。

2.3 病理性瘢痕組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的相關(guān)性分析：Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)as蛋白與Bcl-2蛋白、survivin蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.513、-0.629，P＜0.05)，與caspase-3蛋白呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.691，P＜0.05)；Bcl-2蛋白與survivin蛋白呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.616，P＜0.05)，與caspase-3呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.638，P＜0.05)，survivin蛋白與caspase-3蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.621，P＜0.05)。

3 討論

病理性瘢痕是發(fā)生于創(chuàng)傷、感染后的一種纖維代謝疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。隨著臨床對病理性瘢痕組織相關(guān)生物細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究的增多，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增生和凋亡失衡可能是病理性瘢痕的重要病理基礎(chǔ)。王暑光等[6]指出，成纖維細(xì)胞凋亡不足可能在病理性瘢痕的發(fā)生中起重要作用。

Fas屬于一種跨膜蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中起信號傳遞作用，可表達(dá)于成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as與其受體結(jié)合后可最終形成死亡誘導(dǎo)信號，并激活Caspase的一系列凋亡蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前，臨床研究已證實，F(xiàn)asL-FasR系統(tǒng)可參與細(xì)胞增殖和調(diào)控[7]。楊愛琴等[8]發(fā)現(xiàn)尖銳濕疣患者病變皮損部位Fas呈低表達(dá)。

Bcl-2即B細(xì)胞淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2基因，首次由Tsujimoto在t(14,18)染色體異位的濾泡性淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，該基因表達(dá)可抑制多種組織細(xì)胞凋亡，是重要的抗細(xì)胞凋亡因子。隨著臨床對Bcl-2抗凋亡機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、鈣離子跨膜流動及caspase活化等發(fā)揮抗凋亡作用。陳釗等[9]指出，瘢痕疙瘩成纖維組織中Bcl-2陽性表達(dá)升高。

survivin迄今為止是凋亡抑制蛋白家族中的一員，在胚胎或胎兒組織、器官中呈高表達(dá)，但成人分化成熟的終末組織無表達(dá)。survivin作為一種抗細(xì)胞凋亡因子，主要通過與caspase家族相互作用抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為：針對caspase-8經(jīng)細(xì)胞死亡刺激因子(如：Fas等)啟動的外源性細(xì)胞凋亡，survivin可直接或間接影響caspase-3/caspase-7活性，阻斷其水解微管結(jié)構(gòu)蛋白；針對caspase-9啟動的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，可通過阻斷細(xì)胞凋亡信號的傳導(dǎo)，間接抑制caspase-3/caspase-7活性[10]。

caspase家族在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)異常增多會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。caspase-3是caspase家族中最重要的成員之一，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要效應(yīng)因子之一。吳焱秋[11]指出，caspase-3可介導(dǎo)多數(shù)細(xì)胞凋亡因子引起的細(xì)胞凋亡。臨床研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3激活的途徑主要通過凋亡刺激因子(Fas、TNFR等)與受體結(jié)合，誘導(dǎo)上游的caspase-8被激活，或線粒體釋放細(xì)胞色素C誘導(dǎo)的下游caspase-9被激活，進(jìn)而導(dǎo)致下游的caspase-3被激活，參與細(xì)胞凋亡。萬遠(yuǎn)芳等[12]報道，皮膚紅斑狼瘡患者皮損組織中caspase-3的活性明顯高于正常皮膚組織，可能參與皮膚紅斑狼瘡發(fā)病。

本研究中，病理性瘢痕成纖維組織中Fas、caspase-3陽性表達(dá)率低于非病理性瘢痕和正常皮膚組織，Bcl-2、survivin陽性表達(dá)率明顯高于非病理性瘢痕和正常皮膚組織(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮膚組織中上述指標(biāo)也存在明顯差異(P＜0.05)，說明成纖維細(xì)胞抗凋亡因子Bcl-2、survivin高表達(dá)，F(xiàn)as、caspase-3低表達(dá)可能參與病理性瘢痕形成過程。付昱等[13]研究指出，黃芪總苷可通過抑制survivin、 Bcl-2，避免成纖維細(xì)胞過度增殖，從而起到治療瘢痕疙瘩的效果，認(rèn)為凋亡相關(guān)因子survivin、Bcl-2過度表達(dá)可能參與病理性瘢痕形成。張?zhí)K文等[14]進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α刺激基因(TSG-6)可通過促進(jìn)凋亡相關(guān)因子caspase-3高表達(dá)達(dá)到誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡的目的。另外，Spearman相關(guān)分析顯示，F(xiàn)as蛋白與Bcl-2蛋白、survivin蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，與caspase-3蛋白呈正相關(guān)(P＜0.05)；Bcl-2蛋白與survivin蛋白呈正相關(guān)，與caspase-3蛋白呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；survivin蛋白與caspase-3蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，說明病理性瘢痕組織凋亡因子異常表達(dá)可能存在相互作用的關(guān)系，但具體作用機(jī)制尚有待研究。

綜上，病理性瘢痕成纖維組織中，Bcl-2、survivin表

表1 三組標(biāo)本組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3陽性表達(dá)率 [例(％)]

(本文未完，)達(dá)呈高陽性率，F(xiàn)as、caspase-3表達(dá)呈低陽性率，且凋亡因子Bcl-2、survivin、Fas、caspase-3異常表達(dá)存在相關(guān)性，可能是病理性瘢痕重要的發(fā)病機(jī)制。有待深入研究凋亡相關(guān)因子的作用機(jī)制，進(jìn)一步探討病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治病理性瘢痕提供新思路。

[1]李周娜,陳香儒,金哲虎.4-羥苯基維胺在不同載體中對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡影響[J].中華皮膚科雜志,2017,50(3):195-198.

[2]張金麗,曹雯娟,熊喜峰,等.穗花杉雙黃酮調(diào)控人瘢痕成纖維細(xì)胞活性及凋亡的研究[J].中國美容整形外科雜志,2016,27(3):173-176.

[3]Sam S,Sam MR,Esmaeillou M,et al.Effective Targeting Survivin,Caspase-3 and MicroRNA-16-1 Expression by Methyl-3-pentyl-6-methoxyprodigiosene Triggers Apoptosis in Colorectal Cancer Stem-Like Cells[J].Pathol Oncol Res,2016,22(4):715-716.

[4]Hyun HB,Lee WS,Go SI,et al.The fl avonoid morin from Moraceae induces apoptosis by modulation of Bcl-2 family members and Fas receptor in HCT 116 cells[J].Int J Oncol,2015,46(6):2670-2678.

[5]Lebelt A,Rutkowski R,Och W,et al.Survivin,caspase-3 and MIB-1 expression in astrocytic tumors of various grades[J].Adv Med Sci,2016,61(2):237-243.

[6]王暑光,王靜成,孫鈺,等.絲裂霉素C調(diào)控miR-200b啟動子甲基化誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2017,33(6):876-879.

[7]蔡澤明,趙瑩,張斌,等.早期斑禿皮損處炎癥細(xì)胞因子及凋亡因子的異常表達(dá)[J].中華皮膚科雜志,2015,48(2):128-131.

[8]楊愛琴,卞坤鵬,翟偉,等.尖銳濕疣患者疣體病變皮損組織中Fas、FasL及Foxp3表達(dá)與HPV DNA載量的相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2017,27(6):1366-1369.

[9]陳釗,李小靜,王暉.構(gòu)建腫瘤壞死因子α刺激基因6慢病毒表達(dá)及干擾載體及對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國組織工程研究,2016,20(29):4319-4327.

[10]馬莎,林俊,晉松,等.shRNA抑制survivin基因表達(dá)對臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2015,44(35):4922-4924.

[11]吳焱秋,柴家科,張海龍,等.燒傷后大鼠不同骨骼肌凋亡相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化[J].中國美容醫(yī)學(xué),2014,23(8):633-636.

[12]萬遠(yuǎn)芳,陶春蓉,龔娟,等.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體在皮膚紅斑狼瘡患者外周血單個核細(xì)胞、皮損組織與血清中表達(dá)的研究[J].臨床皮膚科雜志,2017,46(3):174-178.

[13]付昱,張良,陳娜,等.黃芪總苷液對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖凋亡的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2017,46(6):746-748.

[14]張?zhí)K文,李小靜,陳釗,等.TSG-6對人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2016,51(1):102-105.

The Expression and Signi fi cance of Apoptotic Factors Fas,Bcl-2,Survivin and Caspase-3 Protein in Pathological Scar Fibroblasts

LIU Qi-sheng
(Department of Clinical Laboratory,Daye Hospital of Traditional Chinese Medicine,Daye 435100,Hubei,China)

Objective To investigate the expression and significance of apoptotic factors Fas,Bcl-2,survivin and caspase-3 protein in pathological scar fi broblasts.Methods The positive expression rates of apoptosis-associated factors Fas,Bcl-2,survivin and Caspase-3 protein in 46 cases of pathological scar tissues,25 cases of non-pathological scar tissues and 22 cases of normal skin tissues were detected by Western bolt,and the correlation was analyzed.Results The positive expression rates of Fas and caspase-3 in pathological scar fi broblasts (21.74％,23.91％) were lower than those in the non-pathological scar (60.0％,72.0％) or those in normal skin tissues (86.36％,90.90％) (P＜0.05),while the positive expression rates of Bcl-2 and survivin in pathological scar fi broblasts (78.26％,82.61％) were signi fi cantly higher than those in non-pathological scars (44.0％,48.0％)or those in normal skin tissues (13.64％,18.18％) (P＜0.05). There were signi fi cant differences in above-mentioned indexes between non-pathological scars and normal skin tissues (P＜0.05). Spearman correlation analysis showed that Fsa protein was negatively related to Bcl-2 protein and survivin protein (r=-0.513,-0.629,P＜0.05),and positively correlated with caspase-3 protein (r=0.691,P＜0.05). Bcl-2 protein was positively correlated survivin protein (r=0.6.16,P＜0.05),and negatively correlated with caspase-3 protein (r=-0.638,P＜0.05). The survivin protein was negatively correlated with caspase-3 protein(r=-0.621,P＜0.05).Conclusion The abnormal expression of apoptosis related factors Fas,Bcl-2,survivin and caspase-3 in pathological scar fi broblasts may be involved in the occurrence of pathological scar.

pathological scar; fi broblast; apoptosis associated factor; expression

R619+.6

A

1008-6455(2017)11-0063-03

2017-08-14

2017-09-08

編輯/朱婉蓉