喬琳，文星艷，竇克非，尹棟，宋衛(wèi)華，張禪那，孫凱，惠汝太，王虹劍

冠心病研究

CDKN2B-AS1基因多態(tài)性與女性早發(fā)冠心病的相關(guān)性研究

喬琳，文星艷，竇克非，尹棟，宋衛(wèi)華，張禪那，孫凱，惠汝太，王虹劍

目的：探討CDKN2B-AS1 基因位點(diǎn)rs4977574單核苷酸多態(tài)性（SNP）與女性早發(fā)冠心病的相關(guān)性。 方法：采用病例對(duì)照研究，連續(xù)入選女性早發(fā)（＜65歲發(fā)?。┕谛牟』颊?26例（病例組）和同期冠狀動(dòng)脈造影陰性、年齡匹配的女性患者79例（對(duì)照組），采用小測(cè)序法（SNaPshot技術(shù)）檢測(cè)CDKN2B-AS1基因位點(diǎn)rs4977574多態(tài)性，同時(shí)測(cè)定血漿中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、血尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）及糖化血紅蛋白（HbA1c）水平，評(píng)估rs4977574多態(tài)性與上述生物標(biāo)志物的相關(guān)性。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，病例組血TG、UA、FPG、HbA1c水平明顯升高（P＜0.05），校正年齡、體重指數(shù)、相關(guān)病史及危險(xiǎn)因素后，高HbA1c（HbA1c＞6.2%）明顯增加女性早發(fā)冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（OR=3.35，95%CI：1.41～8.00，P=0.006）； rs4977574基因型及等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中分布有顯著差異（P＜0.05），病例組等位基因G頻率明顯高于對(duì)照組（OR=1.24，95%CI：1.05～1.48，P=0.019）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，rs4977574多態(tài)性與高HbA1c相關(guān)；與AA基因型受試者相比，（GG+GA）基因型受試者中高HbA1c的發(fā)生率明顯增加（OR=2.08，95%CI：1.11～3.89，P=0.022）。 結(jié)論：CDKN2B-AS1基因SNP位點(diǎn)rs4977574多態(tài)性與女性早發(fā)冠心病相關(guān)，并與高HbA1c相關(guān)。

冠狀動(dòng)脈疾??；基因；女（雌）性

臨床上將女性冠心病發(fā)病時(shí)年齡不超過65歲，稱為早發(fā)冠心病[1]。目前針對(duì)女性早發(fā)冠心病的研究相對(duì)較少，其相關(guān)危險(xiǎn)因素及發(fā)病機(jī)制尚不明確。遺傳易感性是冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，研究易感基因多態(tài)性與女性早發(fā)冠心病的相關(guān)性，對(duì)于揭示女性早發(fā)冠心病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，9p21染色體與冠心病發(fā)病的遺傳機(jī)制緊密相關(guān)[2]。其中，9p21.3區(qū)域中CDKN2B-AS1 基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)rs4977574與冠心病的相關(guān)性在歐洲人群中已經(jīng)得到證實(shí)[3]，但在國內(nèi)少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討CDKN2B-AS1 基因多態(tài)性與女性早發(fā)冠心病及其臨床特點(diǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

研究對(duì)象：2014-01至2015-12期間連續(xù)入選因胸痛在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院住院并接受擇期冠狀動(dòng)脈造影的女性患者305例?；颊吣挲g均＜65歲，其中早發(fā)冠心病患者226例（病例組），入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)左主干狹窄＞30%或其他3支（前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈）及其主要分支中至少1支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%；另有79例經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)血管無病變（對(duì)照組）。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性疾病、嚴(yán)重腎功能衰竭、肝功能障礙、嚴(yán)重瓣膜病、心肌病、血液病、妊娠和急性感染。所有研究對(duì)象均于入院后詳細(xì)記錄一般特征、心血管病相關(guān)危險(xiǎn)因素及疾病史。經(jīng)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本項(xiàng)研究。

實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)測(cè)定：所有研究對(duì)象于冠狀動(dòng)脈造影前空腹（8小時(shí)以上）采集外周靜脈血?？偰懝檀迹═C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）等血液生化指標(biāo)用血生化分子分析儀AUS5400（奧林巴斯，日本）進(jìn)行測(cè)定。其中高TG定義為TG水平＞1.76 mmol/L，高UA定義為血UA水平＞416.5μmol/L，高FPG定義為FPG水平＞6.1 mmol/L，高HbA1c定義為HbA1c水平＞6.2%。

DNA提取及基因SNP檢測(cè)：采集生化指標(biāo)檢測(cè)用血同時(shí)，使用EDTA抗凝真空采血管采集4ml外周血，應(yīng)用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA，-80℃保存。SNP檢測(cè)采用分型技術(shù)（SNaPshot技術(shù)，也稱小測(cè)序），首先將包含目的SNP位點(diǎn)的基因片段擴(kuò)增，然后通過延伸反應(yīng)將SNP位點(diǎn)堿基再次擴(kuò)增（二次擴(kuò)增）。延伸反應(yīng)中引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)峰的顏色得知摻入的堿基種類，從而確定樣本基因型。擴(kuò)增反應(yīng)：以DNA為模板擴(kuò)增含有SNP位點(diǎn)的DNA片段，使用引物為F：GGGTTATGGGAAATGCCATG，R：TTGCTGAAGGGACTCAATGAGAG，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）總反應(yīng)體系10 μl，包含2.5倍標(biāo)準(zhǔn)緩沖液Ⅳ 4 μl，10～20 ng/μl DNA 液 2 μl，5 μmol引物 1.5μl，5U/ μl卡帕熱啟動(dòng) DNA 聚合酶 0.15 μl，蒸餾水補(bǔ)齊至 10 μl，反應(yīng)條件為 95℃、5 min；95℃、30 s，53℃、30 s，72℃、30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢：取2 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物純化：于15 μl PCR產(chǎn)物中加入5 μl蝦堿性磷酸酶和2 μl核酸外切酶Ⅰ，純化程序?yàn)?7℃、1.0 h，75℃、20 min。延伸反應(yīng)（二次擴(kuò)增）：使用引物為F：GGGTACATCAAATGCATTCTATAGC，總反應(yīng)體系5 μl，包含純化后擴(kuò)增產(chǎn)物 1.2 μl，0.2 μmol/L 引物混合物2 μl，熒光混合物0.5 μl，10倍標(biāo)準(zhǔn)緩沖液I 0.4 μl，蒸餾水補(bǔ)齊至 5 μl，反應(yīng)條件為 96℃、10 s，53℃、5 s，60℃、30 s，30個(gè)循環(huán)。延伸產(chǎn)物純化：取延伸反應(yīng)產(chǎn)物10 μl，加入1 μl小牛腸堿性磷酸酶，純化程序?yàn)?7℃、1.0 h，75℃、15 min。DNA測(cè)序儀測(cè)序：96孔板中每孔加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5：8.5）9 μl，延伸反應(yīng)純化產(chǎn)物 1.0 μl，總體積10 μl，95℃變性5 min，迅速冰冷4 min，于ABI 3730XL型DNA序列檢測(cè)儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、各組間基因型頻率分布和等位基因頻率分布比較使用χ2檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析應(yīng)用多元Logistic回歸，把年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史作為校正因素引入分析。雙側(cè)P值＜0.05視作差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組受試者的一般臨床特征比較（表1）：本研究共入選研究對(duì)象305例，其中病例組226例，對(duì)照組79例。兩組在年齡、體重指數(shù)、TC、LDL-C及HDL-C等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。與對(duì)照組相比，病例組高血壓病、高脂血癥及糖尿病的患病率明顯增高，血壓、TG、UA、FPG及HbA1c水平亦明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表1 兩組受試者的一般臨床特征比較

表1 兩組受試者的一般臨床特征比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

生物標(biāo)志物與女性早發(fā)冠心病的相關(guān)性分析（表2）：校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數(shù)、早發(fā)冠心病家族史、吸煙史和飲酒史后，高 HbA1c（OR=3.35，95%CI：1.41～8.00，P=0.006） 和 高 FPG（OR=3.49，95%CI：1.38～8.84，P=0.008）明顯增加女性早發(fā)冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

表2 生物標(biāo)志物與女性早發(fā)冠心病的相關(guān)性分析[例(%)]

兩組受試者rs4977574基因型和等位基因頻率分布：兩組經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。病例組rs4977574的GG、GA、AA3種基因型分布與對(duì)照組比較（30.5% vs 22.8%；50.4% vs 44.3%；19.0% vs 32.9%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036）；病例組等位基因G頻率明顯高于對(duì)照組（55.8% vs 44.9%，P＜0.05）。

rs4977574基因多態(tài)性與女性早發(fā)冠心病的相關(guān)性分析：校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數(shù)、早發(fā)冠心病家族史、吸煙史、飲酒史等潛在混雜因素后，（GG+GA）基因型受試者相對(duì)于AA基因型受試者發(fā)生早發(fā)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)升高（OR=1.87，95%CI：1.03～3.39，P=0.040）；攜帶等位基因G的受試者發(fā)生早發(fā)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加（OR=1.24，95%CI：1.05～1.48，P=0.019）。

rs4977574多態(tài)性與生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析（表3）：進(jìn)一步分析rs4977574多態(tài)性與TG、UA、FPG及HbA1c等生物標(biāo)志物之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，rs4977574多態(tài)性與高HbA1c顯著相關(guān)。在全部研究對(duì)象中，（GG+GA）基因型（236例）和AA基因型（69例）的HbA1c水平分別為（6.48±1.38）% 和（6.30±1.44）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數(shù)、早發(fā)冠心病家族史、吸煙史、飲酒史后，（GG+GA）基因型受試者出現(xiàn)高HbA1c的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高（OR=2.08，95%CI：1.11～3.89，P=0.022）。

表3 rs4977574多態(tài)性與生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析

表3 rs4977574多態(tài)性與生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析

注：HbA1c：糖化血紅蛋白；FPG：空腹血糖；UA：血尿酸；TG：甘油三酯。-：無。校正因素：年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數(shù)、早發(fā)冠心病家族史、吸煙史、飲酒史

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2B-AS1基因位點(diǎn)rs4977574多態(tài)性與女性早發(fā)冠心病相關(guān)，攜帶等位基因G的女性更易發(fā)生早發(fā)冠心??；另外，SNP位點(diǎn)rs4977574多態(tài)性與血糖水平相關(guān)，（GG+GA）基因型受試者中高HbA1c的發(fā)生率明顯增加。因?yàn)楦逪bA1c和高FPG可增加女性早發(fā)冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，我們推測(cè)rs4977574多態(tài)性可能通過影響血糖代謝而與女性早發(fā)冠心病易感性相關(guān)。

本研究目標(biāo)基因CDKN2B-AS1位于9p21.3染色體上，該基因全長(zhǎng)126.3kb，可轉(zhuǎn)錄成一段長(zhǎng)約3834bp的與INK4b-ARF-INK4a基因座呈轉(zhuǎn)錄反義方向的RNA，即ANRIL。相關(guān)研究表明，含有風(fēng)險(xiǎn)SNP位點(diǎn)的外周血單核巨噬細(xì)胞內(nèi)CDKN2BAS1 基因表達(dá)水平升高，并可發(fā)生細(xì)胞增殖、黏附增加等能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成的生物學(xué)行為[4]。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2B-AS1基因多態(tài)性（rs4977574）可能參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展。Rivera等[5]和Pechlivanis等[6]針對(duì)加拿大和部分歐洲人群開展的研究顯示，SNP位點(diǎn)rs4977574與冠心病的嚴(yán)重程度以及糖尿病相關(guān)。在中國人群中，rs4977574與心肌梗死密切相關(guān)[7]。黃毅[8]對(duì)浙江寧波漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs4977574與冠心病顯著相關(guān)，且在該地區(qū)65歲以下女性人群中表現(xiàn)出了高致病風(fēng)險(xiǎn)（基因型P=0.01, 等位基因P=0.01, OR=1.70）。這與本研究結(jié)果相似。然而，rs4977574參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化特別是女性早發(fā)冠心病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不清楚。周香等[9]對(duì)早發(fā)冠心病與晚發(fā)冠心病危險(xiǎn)因素的研究顯示，血糖代謝異常（OR=1.98）增加早發(fā)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。既往關(guān)于女性早發(fā)冠心病的研究表明，高HbA1c水平是發(fā)病的危險(xiǎn)因素（OR=4.341）[10]。另有研究推測(cè)，糖尿病、高脂血癥可通過引起外周血白細(xì)胞端?？s短而與早發(fā)冠心病相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs4977574多態(tài)性與HbA1c水平相關(guān)，推測(cè)rs4977574多態(tài)性可能參與血糖代謝的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，受風(fēng)險(xiǎn)SNP位點(diǎn)的影響，CDKN2B-AS1 基因的某些特定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可調(diào)節(jié)ADIPORl、VAMP3、C11ORF10等基因的表達(dá)，而上述基因在血糖、血脂等代謝活動(dòng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12]。由此我們推測(cè)，rs4977574可能通過相關(guān)信號(hào)通路影響血糖代謝而參與女性早發(fā)冠心病的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，CDKN2B-AS1基因rs4977574多態(tài)性與女性早發(fā)冠心病相關(guān)，等位基因G是女性早發(fā)冠心病的易感基因，SNP位點(diǎn)rs4977574多態(tài)性與血糖水平相關(guān)，攜帶等位基因G的患者更易出現(xiàn)血糖水平升高。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究采取連續(xù)入選的方式入選住院進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影的女性患者，研究對(duì)象較少，樣本量相對(duì)有限，有可能使結(jié)果的外推有一定局限性；其次，本研究入選病例大多為居住在北方地區(qū)的漢族人群，不能排除地域分布、種族差異對(duì)基因多態(tài)性造成的影響；第三，本研究為橫斷面研究，只能探討基因多態(tài)性和疾病的相關(guān)性而不能推出因果關(guān)系。

因此，我們計(jì)劃在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，在不同種族的人群中進(jìn)行驗(yàn)證，并完成病例隨訪，以明確CDKN2B-AS1 基因多態(tài)性、相關(guān)生物標(biāo)志物與女性早發(fā)冠心病患者遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系，為女性早發(fā)冠心病的發(fā)現(xiàn)和治療提供更多的理論依據(jù)。

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Correlation Study Between CDKN2B-AS1 Gene Polymorphism and Female Premature Coronary Artery Disease Occurrence

QIAO Lin, WEN Xing-yan, DOU Ke-fei, YIN Dong, SONG Wei-hua, ZHANG Chan-na, SUN Kai, HUI Ru-tai, WANG Hong-jian.
Department of Cardiology, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037),China

WANG Hong-jian, Email: wanghongjianfw@hotmail.com

Objective:To explore the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) rs4977574 in CDKN2B-AS1 gene and female premature coronary artery disease (pCAD) occurrence.

Methods: Our research included 2 groups: pCAD group, n=226 consecutive patients≤65 years of age and Control group,n=79 subjects with matched age,without CAD. The genotype of CDKN2B-AS1 SNP rs4977574 was detected by SNaPshot.Blood levels of total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), triglycerides (TG), uric acid (UA), fasting plasma glucose (FPG) and glycosylated hemoglobin (HbA1c) were examined; relationships between rs4977574 polymorphism and the above parameters were assessed.

Results: Compared to Control group, pCAD group had increased blood levels of TG, UA, FPG and HbA1c, P＜0.05.With adjusted age, body mass index (BMI), relevant disease history and risk factors, elevated HbA1c (HbA1c＞6.2%)obviously increased the risk of female pCAD occurrence (OR=3.35, 95%CI 1.41-8.00, P=0.006). The genotype and allele frequency of rs4977574 were different between pCAD group and Control group, P＜0.05. Compared to Control group, pCAD group had the higher frequency of G allele(OR=1.24, 95%CI 1.05-1.48, P=0.019); further analysis found that rs4977574 polymorphism was related to high HbA1c. Compared to AA genotype, GG+GA genotype had the increased incidence of high HbA1c(OR=2.08, 95%CI 1.11-3.89, P=0.022).

Conclusion: CDKN2B-AS1 SNP rs4977574 was related to female pCAD occurrence and it was also related to high HbA1c.

Coronary artery disease; Gene; Female

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81300156）；協(xié)和青年基金和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（3332015103）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院 心內(nèi)科

喬琳 碩士研究生 研究方向：女性早發(fā)冠心病 Email:1262796884@qq.com 通訊作者：王虹劍 Email: wanghongjianfw@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2017）12-1154-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.12.003

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:1154.)

2017-05-04）

（編輯：朱柳媛）