羅軍強(qiáng)

(荊門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 荊門 448000；荊門市五三醫(yī)院外科，湖北 荊門 431821)

陳治軍，劉平非，馮雨，謝騰

(荊門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 荊門 448000)

pEGFP-N1-MeCP2上調(diào)質(zhì)粒的構(gòu)建及意義

羅軍強(qiáng)

(荊門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 荊門 448000；荊門市五三醫(yī)院外科，湖北 荊門 431821)

陳治軍，劉平非，馮雨，謝騰

(荊門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 荊門 448000)

目的：構(gòu)建MeCP2真核表達(dá)載體并在SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)。方法：采用RT-PCR、pEGFP-N1-MeCP2質(zhì)粒提取、Western blot檢測(cè)pEGFP-N1-MeCP2在在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MeCP2與pEGFP-N1空載體組分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中，48h后利用Western Blot檢測(cè)表明， 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-MeCP2的細(xì)胞在82 kDa處可見一特異性的表達(dá)帶，為MeCP2與GFP的融合蛋白，而在空載體組未見條帶；在27KDa附近，空載體組可見條帶，而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-MeCP2的細(xì)胞未見條帶，提示pEGFP-N1-MeCP2載體能夠在SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)論：構(gòu)建pEGFP-N1-MeCP2上調(diào)質(zhì)粒是進(jìn)一步研究MeCP2蛋白功能的基礎(chǔ)，也是研究MeCP2蛋白在帕金森病中作用機(jī)制的關(guān)鍵。

帕金森??；MeCP2；TH；SH-SY5Y細(xì)胞；6-OHDA

MeCP2在大多數(shù)組織中都有表達(dá)，但在大腦中表達(dá)最豐富。胞漿蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的定量研究顯示，肺和脾也是MeCP2表達(dá)豐富的組織[1]。直接定量測(cè)定成年小鼠每個(gè)細(xì)胞核中MeCP2分子，大腦神經(jīng)元有16000000個(gè)，膠質(zhì)細(xì)胞中較少，而肝細(xì)胞中少30倍[2]。小鼠神經(jīng)元中MeCP2水平出生時(shí)相對(duì)較低，出生后3個(gè)月快速增加，隨后達(dá)到平臺(tái)期[2,3]。由于出生時(shí)神經(jīng)形成已經(jīng)完成，神經(jīng)元在一個(gè)恒定數(shù)目范圍內(nèi)增加是由于MeCP2表達(dá)上調(diào)。而這個(gè)時(shí)候，這些神經(jīng)元經(jīng)歷著活躍的突觸發(fā)育。

鑒于MeCP2在大腦中可能作為大腦發(fā)育的調(diào)節(jié)因子或維持神經(jīng)元/膠質(zhì)功能的因子。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MeCP2在帕金森病細(xì)胞模型中的表達(dá)下降，鑒于MeCP2在神經(jīng)元中的作用，我們推測(cè)，MeCP2的表達(dá)下降可能參與了帕金森病的致病過程。因此，我們從人肺癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)中獲得MeCP2基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體并在SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究MeCP2的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)America Type Culture Collection(ATCC)細(xì)胞庫(kù),人肺癌細(xì)胞A549，載體pEGFP-N1，感受態(tài)大腸桿菌DH 5α，D2000 plus DNA ladder、D2000 DNA ladder(Beijing Solarbio Science & Techology Co., LTD)，DNA聚合酶(TAKARA Bioiotechnology(Dalian) Co. ,LTD)，PstI(Fermentas Inc.)，XhoI(Fermentas Inc.)T4 DNA連接酶(Fermentas Inc.)，Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies)，TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace -α(TOYOBO CO,LTD)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen Biotech(Beijing) CO.,LTD)，10mM dNTPs(Fermentas Inc.)。一抗：MeCP2大鼠抗人抗單克隆抗體購(gòu) 自美國(guó)Sigma公司，TH羊抗人抗單克隆抗體購(gòu)自購(gòu)自 Santa Cruz公司；Westem blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶美生物公司。二抗：兔抗鼠、鼠抗羊二抗均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1)pEGFP-N1-MeCP2質(zhì)粒構(gòu)建 據(jù)MeCP2基因的CDC區(qū)設(shè)計(jì)引物及酶切位點(diǎn)：設(shè)計(jì)包含Pst I 和 Xho I (Promega USA)酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增MeCP2全長(zhǎng)引物。上游引物5’ GCGCTCGAGGGTAAAAGCCGTCCGGAAAAT3’和下游引物5’CGGCTGCAGGCTAACTCTCTCGGTCACGGGC3’。其中包含下劃線的為所含酶切位點(diǎn)。利用PCR擴(kuò)增MeCP2編碼序列，反應(yīng)體系為50μL：10×PCR緩沖液5μL，dNTP 5μL、Taq酶 2.5μL、cDNA模板2μL，上下游引物(10μmol)各1.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2min、94℃ 10s、55℃ 30s、68℃ 80s，共32個(gè)循環(huán)；68℃延伸3min。68→94℃、30s→64℃、30s→72℃，4min(30次)末段延伸72℃、10min。將獲得的PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳明確擴(kuò)增大小后，利用前述切膠回收方法純化PCR產(chǎn)物。取PCR產(chǎn)物利用XhoⅠ和KpnⅠ酶雙酶切，回收大片段，加T4連接酶16℃水浴過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB選擇平板上倒置培養(yǎng)過夜。篩選2～3個(gè)菌落，搖菌后取1μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定；小量提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行雙酶切鑒定，將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因測(cè)序。

2)pEGFP-N1-MeCP2質(zhì)粒真核細(xì)胞表達(dá)的western blot檢測(cè)鑒定 SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-MeCP2質(zhì)粒，提取總蛋白western blot表達(dá)鑒定。操作過程：蛋白樣品提?。坏鞍诐舛葴y(cè)定；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜，封閉；結(jié)合一抗，置于4℃搖床過夜；結(jié)合二抗，將抗體稀釋液加入PVDF膜后置于搖床室溫震搖1h；洗膜4次，每次5min,后利用PBS洗膜三次去除殘存的Tween-20，利用ECL發(fā)光液暗室曝光顯色并分析蛋白表達(dá)強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增MeCP2 cDNA片段

通過PCR擴(kuò)增的方法成功獲得了MeCP2 cDNA片段，PCR的產(chǎn)物在l%瓊脂糖凝膠上的分析，特異性片段的大小為1531bp。見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

1)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果 用PstI和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MeCP2得到與預(yù)期大小相符的外源基因插入片段，結(jié)果與PCR產(chǎn)物的大小1531bp比對(duì)相吻合，說明克隆成功。見圖2。

圖1 MeCP2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖 圖2 pEGFP-N1-MeCP2 質(zhì)粒酶切鑒定圖

2)測(cè)序鑒定結(jié)果 將重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MeCP2送去進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)與MeCP2的序列一致，說明插入的片段是正確的，克隆成功。

2.3 pEGFP-N1-MeCP2的表達(dá)鑒定結(jié)果

將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MeCP2與pEGFP-N1空載體組分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中，48h后利用Western Blot檢測(cè)表明， 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-MeCP2的細(xì)胞在82 kDa處可見一特異性的表達(dá)帶，為MeCP2與GFP的融合蛋白，而在空載體組未見條帶；在27KDa附近，空載體組可見條帶，而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-MeCP2的細(xì)胞未見條帶，提示pEGFP-N1-MeCP2載體能夠在SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)。見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MeCP2與pEGFP-N1空載體組分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)鑒定

3 討論

自從第一次發(fā)現(xiàn)MeCP2調(diào)節(jié)腦中特定區(qū)域基因的表達(dá)，包括正面的和負(fù)面的作用，以及獨(dú)立活性依賴的調(diào)節(jié)[4,5]。目前，研究越來越多的集中于MeCP2的目標(biāo)基因。發(fā)生于神經(jīng)科學(xué)上MeCP2基因的缺失和過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與MeCP2相關(guān)的基因是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)。BDNF是一個(gè)生長(zhǎng)因子，與神經(jīng)元再生、神經(jīng)元成熟、神經(jīng)元功能維持及神經(jīng)元存活、鈣離子穩(wěn)態(tài)、及突觸可塑性方面發(fā)揮著重要作用，以及在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)功能障礙中發(fā)揮重要作用[6]。

目前，腦內(nèi)MeCP2與BDNF的機(jī)制尚不清楚[7,8]，但是MeCP2表達(dá)的高低卻與BDNF緊密相關(guān)[9]。體外培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中，過表達(dá)MeCP2提高了BDNF表達(dá)[10]，然而，因突變致MeCP2基因失去功能的小鼠，腦內(nèi)BDNF表達(dá)降低[9]。MeCP2基因突變的小鼠，腦內(nèi)BDNF恢復(fù)正常水平時(shí)，許多Rett綜合征類似的生理學(xué)和行為缺陷癥狀得到了改善[11,12]。在培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MeCP2與BDNF第三啟動(dòng)子結(jié)合抑制BDNF轉(zhuǎn)錄[4,13]。MeCP2基因突變的小鼠與野生型相比，BDNF蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均下降了70%[14]。BDNF表達(dá)下降被認(rèn)為造成了Rett綜合征的病理過程。更重要的是，這些發(fā)現(xiàn)提示有些基因的活性受MeCP2調(diào)控。膜的去極化導(dǎo)致了MeCP2的磷酸化，引起目標(biāo)基因啟動(dòng)子的釋放，從而引起轉(zhuǎn)錄激活[4]。MeCP2基因敲除的小鼠，神經(jīng)元活性受影響，研究MeCP2基因表達(dá)下降和其他基因表達(dá)提高之間的關(guān)系很困難。雖然MeCP2被廣泛的認(rèn)為是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，最近的研究顯示，他可以與活性基因結(jié)合而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[14～16]。

經(jīng)證實(shí)，MeCP2可以抑制Dlx5、 Dlx6、Fxyd1、Reln和Gtl2的表達(dá)[17,18]。無MeCP2表達(dá)的小鼠，前額葉Dlx5、 Dlx6的轉(zhuǎn)錄作用明顯加強(qiáng)[17]。在無MeCP2基因表達(dá)的小鼠和Rett綜合征患者，前額葉Fxyd1表達(dá)明顯較高[19]。在無MeCP2基因表達(dá)的小鼠和Rett綜合征患者，BDNF、GABRB3和UBE3A的表達(dá)下降[20]。這些基因在調(diào)控神經(jīng)發(fā)育階段的樹突結(jié)構(gòu)和GABA能神經(jīng)元功能方面發(fā)揮著重要作用。Dlx5和GABRB3是GABA能神經(jīng)元發(fā)揮作用所必須的，前者調(diào)節(jié)合成GABA，后者則與GABA受體亞單位結(jié)合[20,21]。這些在額葉表達(dá)的基因與GABA能神經(jīng)元的相互作用，證實(shí)了Rett綜合征患者額葉GABA能神經(jīng)元信號(hào)通路的功能紊亂[22]。然而，涉及到樹突形態(tài)學(xué)改變的基因可以解釋Rett綜合征和無MeCP2基因表達(dá)小鼠樹突修飾的原因。

Skirmantas Kriaucionis(2006)研究發(fā)現(xiàn)[23]，無MeCP2表達(dá)的小鼠腦組織中Uqcrc1過表達(dá)，Uqcrc1可以顯著增加線粒體呼吸容量以及減少呼吸效率，過表達(dá)的Uqcrc1可導(dǎo)致N2A細(xì)胞(小鼠神經(jīng)元細(xì)胞)線粒體呼吸功能的異常；他們通過電子顯微鏡(透射電鏡)觀察野生型和無MeCP2表達(dá)的小鼠腦組織沒有發(fā)現(xiàn)線粒體總體結(jié)構(gòu)的異常。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示MeCP2與Uqcrc1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，無MeCP2表達(dá)的小鼠，Uqcrc1表達(dá)提高以及導(dǎo)致神經(jīng)學(xué)上的癥狀。在酶作用底物提供呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ或呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ，含有Uqcrc1蛋白的呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ導(dǎo)致了異常的線粒體呼吸功能。Blue native electrophoresis 檢測(cè)顯示：MeCP2突變的小鼠，呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性正常，提示呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ沒有提高異常的線粒體呼吸功能；這些研究顯示，呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ是增強(qiáng)線粒體呼吸功能的原因。在細(xì)胞系中，過表達(dá)的Uqcrc1與上游的呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ酶作用底物促使線粒體呼吸速率提高。在Pavel(2009)的實(shí)驗(yàn)中[24]，MeCP2基因突變的小鼠，超微結(jié)構(gòu)顯示軸突和樹突異常，以及異常擴(kuò)展的線粒體和脊膜。JC Russell(2007)[25]首次發(fā)現(xiàn)，首次發(fā)現(xiàn)，在低氧和興奮性毒性誘導(dǎo)干預(yù)的小腦顆粒神經(jīng)元，MeCP2功能下降。完全MeCP2基因敲除小腦顆粒神經(jīng)元較野生型死亡過程發(fā)生較早；在缺少M(fèi)eCP2蛋白表達(dá)的CGC細(xì)胞與野生型的相比，神經(jīng)元死亡明顯較多，其過程是缺少M(fèi)eCP2蛋白引起線粒體功能紊亂，線粒體釋放caspase和AIF，從而啟動(dòng)神經(jīng)元的凋亡。鑒于MeCP2基因滅活抑制基因的表達(dá)及其所致的轉(zhuǎn)錄紊亂，過表達(dá)的死亡復(fù)合體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性增加，使得神經(jīng)元更容易受損以致死亡。

綜上所述，MeCP2蛋白在神經(jīng)元中有著很重要的生物學(xué)作用，并且與Rett綜合癥等相關(guān)疾病有著密切的聯(lián)系；我們已經(jīng)證實(shí)，MeCP2可能參與了帕金森病的發(fā)病過程。為了進(jìn)一步研究MeCP2蛋白在帕金森病中的作用機(jī)制，本研究克隆得到了MeCP2的全長(zhǎng)編碼序列，并通過Western Blot檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究其功能打下基礎(chǔ)。

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2017-09-26

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014CFB09)；湖北省荊門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013S01)；湖北省荊門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015S01)；荊門市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(YFZD2016045)。

羅軍強(qiáng)(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)退行性疾病的診療工作；通信作者：謝騰，44255018@qq.com。

[引著格式]羅軍強(qiáng)，陳治軍，劉平非，等. pEGFP-N1-MeCP2上調(diào)質(zhì)粒的構(gòu)建及意義[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版), 2017,14(24):48～52.

R34

A

1673-1409(2017)24-0048-05

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