李文戀，陳雙民，劉珍珍

(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

[引著格式]李文戀，陳雙民，劉珍珍. 豨簽草中總黃酮測(cè)定方法和提取工藝研究[J]. 長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版), 2017,14(24):7～10.

豨簽草中總黃酮測(cè)定方法和提取工藝研究

李文戀，陳雙民，劉珍珍

(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：優(yōu)化豨薟草總黃酮提取工藝，為豨薟草的綜合開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。方法：采用回流提取法對(duì)豨薟草中總黃酮進(jìn)行提取，單因素實(shí)驗(yàn)考察不同乙醇濃度(0%、30%、50%、75%和95%)，料液比(1∶10、1∶15、1∶20和1∶25g/mL)和提取時(shí)間(30min、1、1.5h和2h)對(duì)總黃酮提取效果的影響，并用Al(NO3)3絡(luò)合法測(cè)定豨薟草總黃酮的含量。結(jié)果：確定最佳提取工藝條件為水提，料液比 1∶15(g/mL)，提取時(shí)間1h，在此提取條件下測(cè)定豨薟草中總黃酮的含量1.71%。結(jié)論：該提取工藝經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、可行，為豨薟草進(jìn)一步研究與開發(fā)提供依據(jù)。

豨薟草；總黃酮；Al(NO3)3絡(luò)合法；提取工藝

豨簽草別名肥豬草、粘糊菜、黃花仔等，為菊科植物豨簽(Siegesbeckia orientalis L)、腺梗豨薟(Siegesbeckia pubescens Makino)或毛梗豨薟(Siegesbeckia glabrescens Makino)的干燥地上部分，收錄于2015年版《中藥藥典》[1]。豨薟草味辛、苦，性寒，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)[2]，清熱解毒，降血壓[3]等功能，臨床上主要用于治療風(fēng)濕痹痛，筋骨無力，腰膝酸軟，四肢麻木，半身不遂，風(fēng)疹濕瘡等癥。目前，從豨簽草中已經(jīng)分離得到的主要化學(xué)成分包括二萜類、倍半萜類和黃酮類等化合物[4]，其中豨薟草中二萜類、倍半萜類化合物含量測(cè)定與藥理作用已有文獻(xiàn)報(bào)道[5～9]，但關(guān)于黃酮類化合物的提取和作用研究較少。目前測(cè)定總黃酮類化合物的方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法和HPLC法[10]，而紫外分光光度法是最常用、靈敏度高、操作簡單快速的總黃酮檢測(cè)方法。紫外分光光度法包含Al(NO3)3絡(luò)合法、AlCl3法和鹽酸-鎂粉法等顯色法。柴建新、倪曉霞和何婷等[11～15]研究表明，Al(NO3)3絡(luò)合法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度相對(duì)較高。本文以蘆丁為對(duì)照品，以豨簽草總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度等因素對(duì)豨簽草總黃酮提取的影響，優(yōu)化了豨薟草中總黃酮的提取方法并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；XFB-200高速中藥粉碎機(jī)(中國吉首市中誠制藥機(jī)械廠)；AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DZTW調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；Centrifuge 5810R離心機(jī)(艾本德中國有限公司)；蘆丁(HPLC≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，乙醇等均為分析純；蒸餾水。豨薟草(生產(chǎn)批號(hào)：1505019037)購自于荊州市中醫(yī)院藥房。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1)對(duì)照品溶液的制備 精確稱取干燥恒重的蘆丁對(duì)照品12.50mg，置于50mL 量瓶中，加50% 乙醇溶液溶解并定容，搖勻，即得濃度為 0.25mg/mL 蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2)豨薟草總黃酮的提取工藝 精密稱取豨薟草藥材粉末(過40目篩)5.0g，置于250mL 圓底燒瓶中，在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%、30%、50%、75%和95%)、液料比(1∶10、1∶15、1∶20和1∶25g/mL)、提取時(shí)間(30min、1、1.5h和2h)條件下回流提取豨薟草總黃酮。同種條件下，回流提取兩次，抽濾，合并濾液，濃縮后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，得供試品溶液。

3)吸收波長測(cè)定 取配制好的對(duì)照品溶液5mL和豨薟草供試品溶液1mL分別置于25mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻放置6min；然后加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，搖勻放置6min；再加4% NaOH溶液10.0mL，加水稀釋至刻度線，搖勻，避光放置45min后，在400～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定其最大吸收波長

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于25mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻放置6min；然后加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，搖勻放置6min；再加4% NaOH溶液10.0mL，加水稀釋至刻度線，搖勻，避光放置45min后，以0號(hào)溶液為空白分別測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在其最大吸收波長510nm處的吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5)豨薟草總黃酮的含量測(cè)定 精密稱取6份5.0 g豨薟草藥材粉末，按“豨薟草總黃酮提取的工藝”項(xiàng)下操作，精密移取1.0mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度值，并代入回歸方程計(jì)算豨薟草樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果

2.1 最大吸收波長的確定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和豨薟草樣品溶液顯色后在400 ～ 600nm掃描測(cè)定。結(jié)果表明：豨薟草提取液與蘆丁對(duì)照品溶液在510nm波長處有最大吸收值。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1)線性范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線 以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到回歸方程為：y= 12.982x-0.0013(r= 0.9997)，線性范圍為0～0.06mg/mL。此法試劑配制簡單、操作簡便快捷、反應(yīng)靈敏，適合于豨薟草總黃酮含量的定量分析。

2)精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液4mL置于25mL量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下的方法操作，對(duì)該試樣進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，吸光度分別為0.527、0.528、0.528、0.527、0.526、0.527，平均吸光度為0.527，RSD為0.14%，表明儀器精密度良好。

3)重復(fù)性試驗(yàn) 取同批藥材樣品，準(zhǔn)確稱定5. 0g，按“豨薟草總黃酮的提取工藝”項(xiàng)下相同制備方法平行制備6份，分別精密移取1.0mL置于25mL量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)方法操作，分別測(cè)定吸光度值為0.435、0.441、0.451、0.445、0.447、0.438，平均吸光度為0.443，RSD為1.34%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

4)穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取豨薟草供試液1mL置25mL量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)方法操作，每隔10min對(duì)該試樣進(jìn)行測(cè)定一次，吸收度分別為0.448、0.454、0.453、0.459、0.452、0.447，平均值為0.452，RSD為0.96，表明供試品溶液在1h內(nèi)穩(wěn)定。

5)回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的豨薟草，加入對(duì)照品，按照“豨薟草總黃酮的提取工藝”項(xiàng)方法配制供試品溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得回收率，結(jié)果如表1所示。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.3 豨薟草總黃酮的含量測(cè)定

1)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)豨薟草總黃酮的提取效果 精密稱取6份5.0g豨薟草藥材粉末，按料液比1∶15(g/mL)分別加入水，30%，50%，75%和95%乙醇，浸泡30min后，回流提取1h。重復(fù)提取兩次，合并濾液，濃縮后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度值，結(jié)果如圖2所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，豨薟草總黃酮的含量緩慢減少，雖75%乙醇提取黃酮含量有所增加，但總體都不如水提取的黃酮含量多，因此確定了水為豨薟草總黃酮提取的最佳溶劑。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)豨薟草總黃酮提取的影響 圖3 料液比對(duì)豨薟草總黃酮提取的影響

圖4 回流提取時(shí)間對(duì)豨薟草總黃酮提取的影響

2)料液比對(duì)豨薟草總黃酮的提取效果 精密稱取4份5.0g豨薟草藥材粉末，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)加入水，浸泡30min后，回流提取1h。重復(fù)提取兩次，合并濾液，濃縮后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度值，結(jié)果如圖3所示。隨著料液比的增加，豨薟草總黃酮的含量先增多后減少，在料液比為1∶15時(shí)，豨薟草總黃酮含量最多，因此確定了料液比1∶15為豨薟草總黃酮提取的最佳比例。

3)提取時(shí)間對(duì)豨薟草總黃酮的提取效果 精密稱取6份5.0 g 豨薟草藥材粉末，按料液比1∶15(g/mL)加入水，浸泡30min后，分別回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3h。重復(fù)提取兩次，合并濾液，濃縮后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度值，結(jié)果如圖4所示?；亓魈崛?.5h時(shí)，豨薟草總黃酮含量最低。回流提取1、2、2.5h時(shí)，豨薟草總黃酮量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮到節(jié)約時(shí)間，提高效率，確定1h為最佳提取時(shí)間。

4)最佳提取條件下豨薟草總黃酮的含量測(cè)定 精密稱取6份5.0g豨薟草藥材粉末，按料液比1∶15(g/mL)加入水，浸泡30min后，回流提取1h。重復(fù)提取兩次，合并濾液，濃縮后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度值，結(jié)果如表2所示。豨薟草中總黃酮的含量為1.71%。

表2 最佳提取條件下豨薟草總黃酮的含量

3 結(jié)論

豨簽草中主要化學(xué)成分包括二萜類、倍半萜類和黃酮類等化合物，其中關(guān)于總黃酮類化合物的提取和含量測(cè)定未見文獻(xiàn)報(bào)道。Al(NO3)3絡(luò)合法適用于豨薟草中總黃酮含量的測(cè)定，回收率95.9%～100.7%，平均回收率為 98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 1.7%，精密度高，重現(xiàn)性好，操作簡便快速，可為控制該藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

豨薟草中總黃酮的適宜提取工藝條件為：液料比 15∶1、水提、提取時(shí)間 1h，此條件下總黃酮得率為 1.71%。

[1]王瑞,師彥平,王慶忠等. 中藥豨薟草的化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志,2014,39(24):4811～4815.

[2] 張琴. 豨薟草的臨床應(yīng)用[J]. 中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè)),2012,14(6):218.

[3] 于靜,付淑蓮,張芳英. 豨薟草藥理活性與臨床應(yīng)用研究概況[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,32(12):1486～1488.

[4] 于炳偉,金范學(xué).豨薟草的化學(xué)成分及藥理作用[J].醫(yī)學(xué)美學(xué)美容(中旬刊),2015,24(6):702.

[5] 閆東旭,王運(yùn)君,段瓊等. RP-HPLC同時(shí)測(cè)定豨薟草中奇壬醇與豨薟精醇的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志,2010,45(12):945～948.

[6] 劉贊,侴桂新,王崢濤. 高效液相色譜法測(cè)定酒豨薟草中奇壬醇的含量[J]. 中國中藥雜志,2010,35(6):729～731.

[7] 滕天立,徐世芳,陳峰陽,等. 中藥豨薟草的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2015,32(2):250～260.

[8] 王志.干姜和中藥豨薟草的化學(xué)成分研究[D].合肥：安徽大學(xué),2012.

[9] 姚雅琦,王詩卓,黃敏,等. HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定豨薟草中綠原酸和黃芩苷的含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,32(1):36～39.

[10] 付桂明,萬茵,周建斌. 杜仲葉醇提液中黃酮測(cè)定方法的比較研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2006,6(1):224～229.

[11] 何婷,劉宏炳,田樹革,等. 維藥唇香草總黃酮含量測(cè)定顯色反應(yīng)體系探討[J]. 新疆中醫(yī)藥,2017,35(1):17～19.

[12] 倪曉霞,王慶芬,魏浩澤,等. 紫外分光光度法測(cè)定蒲地灌腸液中總黃酮含量[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2017,23(2):57～59.

[13] 柴建新,萬茵,付桂明,等. 杜仲葉總黃酮含量測(cè)定方法優(yōu)化[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2013,13(4):225～230.

[14] 汪金玉,陳地靈,莊滿賢,等.廣藿香中總黃酮含量測(cè)定方法的建立[C].全國第9屆天然藥物資源學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.2010:490～491.

[15] 邢佰穎,陳新梅,秦樂,等. 兩種顯色法測(cè)定昆侖雪菊總黃酮含量的比較研究[J]. 化工時(shí)刊,2016,30(12):23～25.

2017-06-08

長江大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(20150102)。

李文戀(1996-)，女，主要從事中西醫(yī)臨床專業(yè)學(xué)習(xí)；通信作者：劉珍珍,51zhenzhen@163.com。

R917；R284

A

1673-1409(2017)24-0007-04

[編輯] 劉陽