陳 敏 于文嬌 李 昕,4,5 楊巍巍,4,5 李旭冉 于 順,4,5*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541001；3.首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；4.帕金森病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053；5.國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053)

·Alpha-突觸核蛋白的致病機(jī)制·

α-突觸核蛋白通過(guò)上調(diào)內(nèi)吞蛋白R(shí)ab5B促進(jìn)海馬神經(jīng)元膜表面NMDA受體內(nèi)在化

陳 敏1,2于文嬌1,3李 昕1,3,4,5楊巍巍1,3,4,5李旭冉1,3于 順1,3,4,5*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541001；3.首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；4.帕金森病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053；5.國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053)

目的研究α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptors，NMDA)受體的調(diào)控及機(jī)制。方法在原代海馬神經(jīng)元，通過(guò)細(xì)胞外添加基因重組α-Syn和基因過(guò)表達(dá)α-Syn方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)α-Syn含量增高，基因敲減技術(shù)抑制Rab5B，Western blotting法分析NMDA 受體NR1亞單位和Rab5B表達(dá)。結(jié)果神經(jīng)元內(nèi)α-Syn含量增高可以使Rab5B表達(dá)上調(diào)，并降低膜表面NR1的水平；抑制Rab5B表達(dá)可有效反轉(zhuǎn)α-Syn所致的膜表面NR1水平下降。結(jié)論α-Syn通過(guò)上調(diào)Rab5B促進(jìn)NMDA受體的內(nèi)在化。

α-突觸核蛋白；NMDA受體；內(nèi)在化；Rab5B；海馬神經(jīng)元

α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是由140個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì)，在正常情況下主要以可溶性的單體形式存在于神經(jīng)元[1]。然而，α-Syn的代謝發(fā)生障礙，使其在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常積聚，進(jìn)而聚集成纖維而以包涵體的形式沉積在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)[2]，形成突觸核蛋白病(α-synucleinopathy)包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies,DLB)及多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy,MSA)的標(biāo)志性病理改變。研究[3-6]表明，異常表達(dá)的α-Syn參與突觸核蛋白病所共有的海馬相關(guān)記憶功能異常及認(rèn)知功能下降，而記憶與認(rèn)知障礙被認(rèn)為與海馬神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體功能異常密切相關(guān)[7-8]。但是，α-Syn在病理情況下的異常高表達(dá)是否影響海馬神經(jīng)元NMDA受體的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知下降尚未明確。

研究[9]表明，分泌到細(xì)胞外的α-Syn可以被一種被稱為Rab的GTP酶介導(dǎo)快速攝入細(xì)胞，且Rab5B被證明通過(guò)網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制促進(jìn)NMDA受體的內(nèi)在化[10]。因此，本研究將利用大鼠海馬原代神經(jīng)元，通過(guò)基因過(guò)表達(dá)及敲減技術(shù)，研究α-Syn對(duì)NMDA受體的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康出生12 h內(nèi)新生Wistar大鼠(30只，分為6組，n=5)，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-2014-004。杜恩斯組織勻漿器(Wheaton Kimble公司，美國(guó))。Neurobasal A培養(yǎng)基、B27、L-谷氨酰胺、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；胎牛血清(Berlin公司，美國(guó))；NMDA、MK-801(Sigma公司，美國(guó))；Rab5B反義寡核苷酸(百恩維公司，中國(guó))；NMDAR NR1抗體、Calnexin抗體、β-tubulin抗體(Abcam公司，美國(guó))；Rab5B抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Pierce Biotech公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 重組人源α-Syn制備與純化

將人源α-Syn cDNA分別插入表達(dá)載體pET(3a)，然后轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐西林的2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))YTA 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)后，采用離子交換層析和反向?qū)游龇兓＜兓蟮牡鞍追謩e用SDS-PAGE法和蛋白免疫印跡(Western blotting)法鑒定，BCA法測(cè)定蛋白濃度。部分純化α-Syn委托公司標(biāo)記綠色熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)。

1.2.2 海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng)

將出生12 h內(nèi)新生Wistar大鼠分離得到的海馬組織置于預(yù)冷解剖液中，剪碎加入0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶消化40 min后終止消化；拋光滴管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液；用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后按2×105個(gè)/cm2的密度接種至多聚-L-賴氨酸預(yù)處理35 mm培養(yǎng)皿或75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃，含5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待神經(jīng)元貼壁后改用Neurobasal A培養(yǎng)，后每隔3 d換半液。海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng)至9 d時(shí)，向培養(yǎng)基中加入表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒(lentivirus-green fluorescent protein,LV-GFP)或過(guò)表達(dá)α-Syn的慢病毒(LV-GFP-α-Syn)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng)至12 d時(shí)，分別向培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的PBS、溶菌酶(lysozyme)、純化的α-Syn或FITC-α-Syn(終濃度為10 μmol/L)，孵育24 h。

1.2.3 Rab5B反義寡核苷酸的制備

Rab5B反義寡核苷酸(antisense sequence，AS)及擾亂順序的寡核苷酸(scramble sequence，SS)其序列分別是：5′-GCTGTGCTTCTGCTAGTCATTTCAAGAGA ATGACTAGCAGAAGCACAGCTTTTTTCTCGAGG-3′和5′-GATCCCTCGAGAAAAAAGCTGTGCTTCTGCTAGT CATTCTCTTGAAATGACTAGCAGAAGCACAGC-3′。

1.2.4 細(xì)胞總蛋白及膜蛋白提取

向收集好的細(xì)胞里加入全細(xì)胞裂解液(或細(xì)胞膜裂解液)，充分懸浮細(xì)胞沉淀，冰上靜置裂解30 min，離心30 min(4 ℃，12 000 g)，上清即全細(xì)胞蛋白(或膜蛋白)，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5 Western blotting分析

采用7.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，經(jīng)半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜；PVDF膜與NMDAR NR1抗體(1∶1 000)、α-Syn抗體(3D5,1∶5 000)、Rab5B抗體(1∶1 000)、抗GFP單克隆抗體 (1∶1 000)、calnexin抗體(1：1 000)或抗β-tubulin抗體(1∶5 000)，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫反應(yīng)1 h，ECL試劑盒檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 α-Syn下調(diào)海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜NMDARNR1濃度

Western blotting分析結(jié)果顯示，各組細(xì)胞總蛋白中的NMDAR NR1水平無(wú)差異；在PBS、對(duì)照蛋白Lysozyme及LV-GFP處理組，細(xì)胞膜上NMDAR NR1亞基水平較高；而用外加α-Syn和FITC-α-Syn及LV-GFP-α-Syn轉(zhuǎn)染處理的神經(jīng)元，細(xì)胞膜組分內(nèi)的NR1水平顯著下降(n=5,P<0.05)(圖1)。

2.2 α-Syn通過(guò)上調(diào)Rab5B促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜NMDARNR1內(nèi)在化

Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，α-Syn處理細(xì)胞(外加人重組α-Syn組、FITC-α-Syn及LV-GFP-α-Syn)中的Rab5B蛋白表達(dá)水平增高顯著(n=5,P<0.05)(圖2)。利用Rab5 siRNA抑制Rab5B表達(dá)后，Rab5B表達(dá)水平下降，同時(shí)α-Syn所致的膜表面NR1降低效應(yīng)被反轉(zhuǎn)(圖3)。

圖2 α-Syn上調(diào)Rab5B蛋白的表達(dá)Fig.2 α-Syn up-regulates the expression of Rab5B protein

圖3 抑制Rab5B蛋白表達(dá)可反轉(zhuǎn)α-Syn降低的神經(jīng)元膜表面NR1的效應(yīng)Fig.3 Inhibition of Rab5B expression reverses the effect of α-Syn on internalization of surface NR1

2 討論

本研究利用原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元研究了α-Syn對(duì)海馬神經(jīng)元膜表面NMDARs的影響。除了通過(guò)基因轉(zhuǎn)染方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)α-Syn過(guò)表達(dá)外，筆者還利用α-Syn可以迅速通過(guò)細(xì)胞膜的特性，通過(guò)細(xì)胞外添加α-Syn造成細(xì)胞內(nèi)α-Syn含量的增加。這種方法已在本課題組以往的研究中[11]得到論證。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在α-Syn基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)元還是細(xì)胞外添加α-Syn處理的神經(jīng)元，膜表面NR1的水平都發(fā)生明顯的下調(diào)，而細(xì)胞總NR1不變，由此推測(cè)，NR1發(fā)生了內(nèi)在化。鑒于NR1是構(gòu)成功能性NMDARs的必須亞單位[8]，其在膜表面的減少意味著功能性NMDARs的減少。已知，Rab5B是一種調(diào)節(jié)內(nèi)吞機(jī)制的蛋白質(zhì)，以往在多巴胺神經(jīng)細(xì)胞證明該蛋白參與了α-Syn對(duì)NMDA受體內(nèi)在化的調(diào)控[12]。因此，在本研究進(jìn)一步觀察了Rab5B在α-Syn調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元內(nèi)在化過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示，海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)α-Syn含量增加伴隨Rab5B表達(dá)的增加，而抑制Rab5B的表達(dá)則顯著緩解過(guò)α-Syn所致的細(xì)胞膜表面NR1下調(diào)。這些結(jié)果提示Rab5B參與了α-Syn對(duì)海馬神經(jīng)神經(jīng)元膜表面NMDA受體內(nèi)在化的調(diào)控。

NMDA受體豐富表達(dá)于海馬神經(jīng)元，通過(guò)介導(dǎo)海馬神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電位形成而參與學(xué)習(xí)和記憶活動(dòng)，該受體在海馬神經(jīng)元膜表面減少將影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶功能[8]。研究[13-14]顯示，在阿爾茨海默病、PD和DLB患者以及模型動(dòng)物的海馬神經(jīng)元膜表面的NMDA受體的密度降低，且這一改變與認(rèn)知功能下降具有相關(guān)性。本研究探究了突觸核蛋白病的關(guān)鍵致病蛋白α-Syn與NMDA受體內(nèi)在化的相關(guān)機(jī)制，對(duì)揭示PD及DLB等與α-Syn相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)知功能障礙的機(jī)制提供了線索。

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α-SynucleinpromotesNMDAreceptorinternalizationbyupregulationofendocytosisproteinRab5B

Chen Min1,2,Yu Wenjiao1,3,Li Xin1,3,4,5,Yang Weiwei1,3,4,5,Li Xuran1,3,Yu Shun1,3,4,5*

(1.DepartmentofNeurobiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofGeriatrics,Beijing100053,China;2.LaboratoryofNeuroscience,AffliliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,GuangxiZhuangAutomousRegion,China;3.ClinicalCenterforParkinson’sDisease,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;4.BeijingKeyLaboratoryforParkinson’sDiseaseandKeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseases,MinistryofEducation,Beijing100053,China;5.NationalClinicalResearchCenterforGeriatricDisorders,Beijing100053,China)

ObjectiveTo investigate the effect of α-synuclein (α-Syn) on surface N-methyl-D-aspartic acid receptors (NMDARs) in cultured rat hippocampal neurons.MethodsIncreased intracellular α-Syn was realized by extracellular addition of recombinant human α-Syn to the culture medium or transfection of human α-Syn gene to the neurons.Western blotting analysis was applied to observe the effects of α-Syn on levels of NMDA receptor NR1 subunit and Rab5B under conditions with or without Rab5B knockdown.ResultsIntracellular elevation of α-Syn decreased the surface expression of NMDA NR1 and cytoplasmic levels of Rab5B;Inhibition of Rab5B expression reversed the effects of α-Syn.ConclusionThe accumulation of α-Syn in hippocampal neurons can promote the internalization of surface NMDARs through an endocytic mechanism that requires participation of Rab5B.

α-synuclein;NMDA receptor;internalization;Rab5B;hippocampal neurons

國(guó)家自然科學(xué)基金(81371200,81071014,81401042)，北京市醫(yī)院管理局“使命”計(jì)劃專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(SML20150803)，北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)資助(Z161100005116011，Z171100000117013)，北京市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(PXM2017_026283_000002)，廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFAA118197)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81371200,81071014,81401042),Beijing Municipal Administration of Hospitals’ Mission Plan (SML20150803),Beijing Municipal Science &Technology Commission (Z161100005116011，Z171100000117013),Beijing Municipal Commission of Health and Family Planning (PXM2017_026283_000002),Natural Science Foundation of Guangxi (2014GXNSFAA118197).

*Corresponding author，E-mail：yushun103@163.com

時(shí)間：2017-12-13 20∶53

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2053.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.017]

Q 189

2017-10-23)

編輯 慕 萌