張 營 劉 濤 于 榮 周 明 閆 峰 羅玉敏*

(1.濰坊市中醫(yī)院腦病重癥急救科，山東濰坊 261042;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京 100053)

·神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)和臨床研究·

腦血疏對大鼠腦出血的行為學(xué)及凝血功能的影響

張 營1, 2劉 濤1于 榮1周 明1閆 峰2羅玉敏2*

(1.濰坊市中醫(yī)院腦病重癥急救科，山東濰坊 261042;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京 100053)

目的研究腦血疏對大鼠腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)的行為學(xué)及凝血功能的影響。方法21只大鼠通過注射Ⅳ型膠原酶建立ICH模型，采用數(shù)字表法隨機分為：對照組、A組和B組，A、B組分別給予高濃度和低濃度腦血疏，神經(jīng)功能評分采用Longa評分法、前肢踩空試驗和12分評分法3種方法分別在腦出血后24、48、72 h進行神經(jīng)功能評分和稱體質(zhì)量，72 h后采血進行凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)、凝血酶時間(thrombin time，TT)、國際標(biāo)準化比值(International Normalized Ratio，INR)檢測。結(jié)果體質(zhì)量比較顯示：A組和B組的24 h與72 h體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組和對照組的72 h體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Longa評分結(jié)果顯示：B組的24、48和72 h Longa評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；凝血四項指標(biāo)結(jié)果顯示：B組和對照組的PT差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A組和對照組的APTT差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組和對照組的APTT差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組和對照組的INR差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論腦血疏可以改善腦出血急性期大鼠體質(zhì)量下降以及神經(jīng)功能評分，機制與其影響凝血功能有關(guān)。

腦血疏；腦出血；神經(jīng)功能評分；凝血功能

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是臨床常見急癥，具有起病急、病情重、預(yù)后不良的特點。該病好發(fā)于中老年人，突發(fā)起病，臨床表現(xiàn)為偏癱、失語，甚至很快出現(xiàn)意識障礙，占急性腦卒中的9%～27%，是危害最嚴重的腦卒中類型，發(fā)病1年后病死率高達54%[1]。積極有效的治療方案一直是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床探討的熱點。中醫(yī)對出血性卒中的認識為“瘀血阻滯，脈道不利”，血溢腦脈之外造成瘀血停滯、腦髓受壓，血行不暢，損傷腦髓。中醫(yī)認為瘀血既為腦出血之病理基礎(chǔ)，又為腦出血之病理產(chǎn)物，是為離經(jīng)之血即為瘀，因此腦出血急性期給予活血化瘀治療取得了良好的臨床效果[2]。腦血疏主要成分是黃芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黃、川芎，具有益氣活血的功效，用于腦出血的治療，可以增加腦血流、改善微循環(huán)、促進血腫的吸收。本項研究觀察了早期應(yīng)用腦血疏對腦出血大鼠的體質(zhì)量及神經(jīng)功能的影響，并對其神經(jīng)保護機制進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1)實驗動物：SD雄性大鼠21只，體質(zhì)量280～310 g，清潔級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2008-0001。術(shù)前禁食，但自由進水12 h。

2)實驗儀器：小動物呼吸機(Harvard Apparatus 683，美國)、雙極電凝(德威，ACC100，北京天業(yè)愛博科貿(mào)有限公司)、顯微鏡(Carl Zeiss公司，美國)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus公司，美國)、血氣分析儀(Abbott，i-STAT公司，美國)、有創(chuàng)血壓監(jiān)測儀(Biopac公司，DA100C，美國)、牙科鉆(Saeshin Strong207，韓國)，精密電子天平(Adventurer，上海艾測電子科技有限公司)、大鼠手術(shù)操作臺、顯微手術(shù)器械。

3)實驗試劑：0.9%(質(zhì)量分數(shù))NaCl注射液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、多聚甲醛、恩氟烷 (河北九派制藥)、10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛(華瑞制藥)、Ⅳ型膠原酶、腦血疏(沃華醫(yī)藥)。

1.2 實驗方法

1)大鼠ICH模型：大鼠稱體質(zhì)量后，在4%～5%(體積分數(shù))恩氟烷、30%(體積分數(shù))O2/70%(體積分數(shù))N2O下誘導(dǎo)麻醉。約5 min后將其尾部抬起無任何張力且隨重力自然落下表示誘導(dǎo)麻醉成功。將大鼠固定于操作臺上，手術(shù)顯微鏡放大倍數(shù)調(diào)節(jié)至16倍，進行氣管插管。插管成功后迅速連接動物呼吸機，在1%～2%(體積分數(shù))恩氟烷、30%(體積分數(shù))O2/70%(體積分數(shù))N2O下維持麻醉。俯臥位固定于動物頭顱立體定向儀上，頭皮縱向剪開，取前囟為原點，向右3 mm，向后1 mm，深度5 mm為注射點(尾狀核)，磨鉆磨開顱骨，進針后緩慢注射0.2U Ⅳ型膠原酶溶于1 mL的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液，留針10 min緩慢退針，骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮[3]。

2)動物分組：21只大鼠采用數(shù)字表法隨機分為3組(每組7只)，A組：高劑量組；B組：低劑量組；C組：對照組。實驗組給予腦血疏口服液灌胃，其成分包括黃芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黃、川芎，其中高劑量組比低劑量組的濃度高20倍，低劑量組的濃度是人的用量的10倍，均給予大鼠1.5 mL 每天2次灌胃。對照組給予蒸餾水1.5 mL 每天2次灌胃。均在腦出血模型建立后大鼠蘇醒即刻及24 h和48 h后連續(xù)3 d灌胃[4]。

3)動物稱體質(zhì)量：入組21只大鼠分別在術(shù)前及術(shù)后24、48、72 h稱體質(zhì)量。

4)神經(jīng)功能評分：(1)Longa 評分法[5]：評分標(biāo)準采用Longa等推薦的5分法，并稍作改變，對大鼠神經(jīng)功能進行評分：0分：正常；1分：腦缺血對側(cè)的前肢不能伸展；2分：腦缺血對側(cè)的前肢屈曲；3分：實驗動物向缺血對側(cè)輕度轉(zhuǎn)圈；4分：實驗動物明顯向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈；5分：實驗動物爬行時倒向缺血對側(cè)。(2)前肢踩空試驗[6]：主要檢測實驗動物的視覺、觸覺以及前肢對感覺及運動的整合能力。整個空格的面積為10×110 cm2，由許多正方形小網(wǎng)格組成(面積9 cm2)，小網(wǎng)格網(wǎng)絲的直徑為1.0 mm，放置在離地面1米的高度。在實驗中，讓大鼠在1 min內(nèi)，由空格的一端爬向另一端。如果爬行中，動物的前肢掉入網(wǎng)格里，記為一次前肢踩空，主要是因為腦組織缺血損傷導(dǎo)致運動功能失調(diào)。總共計數(shù)1 min內(nèi)實驗動物腦缺血對側(cè)前肢出現(xiàn)的踩空錯誤數(shù)。(3)Belayev等[7]的12分評分法：①姿勢反射測驗，即提尾懸空試驗：無明顯神經(jīng)功能缺失為0分，梗死對側(cè)肢體屈曲為1分，側(cè)推試驗陽性為2分。②肢體放置試驗：?視覺亞實驗，即前方刺激——實驗者將動物握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方10 cm處向桌面緩慢斜線靠近(此時桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反應(yīng)為前肢即刻抓向桌面，損傷大鼠則表現(xiàn)為肢體反應(yīng)延遲。0分：動物肢體放置反應(yīng)正常；1分：反應(yīng)延遲但不超過2 s；2分：反應(yīng)延遲且超過2s。側(cè)方刺激，此時桌子位于動物側(cè)方，其余實驗方法及評分標(biāo)準同前方刺激。?觸覺亞實驗，將動物雙眼遮住，并使其前爪懸空，此時大鼠應(yīng)該既看不見，也不能用胡須觸及桌面，用其前爪背側(cè)輕觸桌面，刺激深度僅達皮膚和毛發(fā)，動物反應(yīng)及評分同視覺亞實驗，觸覺刺激同樣分前方及側(cè)方刺激。?本體覺亞實驗，操作及評分同觸覺亞實驗，僅刺激深度不同，本體覺亞實驗給予前爪較大壓力，刺激深達肌肉及關(guān)節(jié)。該亞實驗只有前方刺激。動物前肢放置實驗總分范圍為0～10分，功能損傷越重，得分越高。

5)凝血四項指標(biāo)檢測:各組大鼠分別在腦出血后72 h，10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛腹腔麻醉，心臟取血后送檢，化驗?zāi)捻椫笜?biāo)，凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原時間(fibrinogen，F(xiàn)ib)、凝血酶時間(thrombin time，TT)、國際標(biāo)準化比值(International Normalized Ratio，INR)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腦血疏對腦出血大鼠體質(zhì)量的影響

各組大鼠在術(shù)后24 h體質(zhì)量均有下降趨勢。同實驗組不同時間點比較：高劑量組與低劑量組的72 h體質(zhì)量均較24 h增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時間點不同實驗組比較：72 h 低劑量組的大鼠體質(zhì)量較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 體質(zhì)量測量結(jié)果Fig.1 The results of the weight

*P<0.05vsgroup A in 24 h;ΔP<0.05vsgroup B in 24 h;▲P<0.05 Bvsgroup C in 72 h;C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

2.2 腦血疏對腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響

各組大鼠分別在腦出血術(shù)后24、48、72 h進行神經(jīng)功能評分。結(jié)果顯示，各組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺陷癥狀，大多數(shù)表現(xiàn)為不同程度前肢屈曲，行走路徑向左側(cè)偏斜。

2.2.1 Longa法評分結(jié)果

同時間點不同組間大鼠Longa評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同時間點同組間比較，低劑量組的48 h和72 h評分均低于24 h(P<0.05)，見圖2。

圖2 Longa評分結(jié)果Fig.2 Results of Longa Scores

*P<0.05vsgroup B in 24 h;C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

2.2.2 前肢踩空試驗評分結(jié)果

不同時間點同組間比較以及同時間點不同組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3 前肢踩空試驗評分結(jié)果Fig.3 Scores of the forelimb test

C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

2.2.3 Belayev 12分評分結(jié)果

不同時間點同組間比較，隨著時間的增加，Belayev 12分評分結(jié)果有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；同時間點不同組間比較，實驗組較對照組有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

2.3 凝血四項結(jié)果

實驗組PT與對照組比較均有降低趨勢，其中低劑量組與對照組比較下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組APTT較對照組比較均有降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組Fib、TT與對照組比較均有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；實驗組INR較對照組比較均有降低趨勢，其中低劑量組與對照組比較下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖4 Belayev 12分評分結(jié)果Fig.4 Results of the Belayev 12 scores

C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=7 in each group.

圖5 凝血指標(biāo)變化Fig.5 Results of the coagulation

PT：prothrombin time；APTT：activated partial thromboplastin time；Fib:fibrinogen;TT:thrombin time;INR:International Normalized Ratio;*P<0.05vsgroup C;C: control group;A: the high concentration group;B: the low concentration group;n=6 in group C,n=7 in group A,n=5 in group B.

3 討論

高血壓性腦出血是腦出血中最常見的類型，其病理基礎(chǔ)是長期高血壓使細小動脈玻璃樣變性和纖維素性壞死，血管順應(yīng)性降低、強度減弱，血壓驟然升高時血管易破裂出血。血腫的占位效應(yīng)可直接壓迫鄰近的腦組織導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損，如偏癱、失語、感覺障礙、意識障礙等；腦出血后血腫的壓迫效應(yīng)誘發(fā)了血腫周圍缺血區(qū)的形成。同時，血腫及其分解代謝產(chǎn)物的神經(jīng)毒性作用又導(dǎo)致腦損傷的進一步加重，如破壞血-腦脊液屏障、參與炎性反應(yīng)、誘導(dǎo)細胞凋亡、導(dǎo)致腦血管痙攣、誘發(fā)癲癇[8]。研究[9]顯示，腦出血后神經(jīng)功能惡化的主要原因是血凝塊所釋放的凝血酶是引起腦出血后腦水腫的關(guān)鍵因素，凝血酶是腦出血后病理生理變化的重要物質(zhì)[10-11]。

凝血酶原時間(PT)測定是檢測外源性凝血途徑，用于檢測外源性凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和相關(guān)因子的抑制物實驗[12]；活化部分凝血活酶時間(APTT)測定反映了Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等內(nèi)源性凝血途徑因子的活性，是內(nèi)源性凝血途徑常用的篩選方法；纖維蛋白原(Fib)由α、β、γ三條多肽鏈以二硫鍵相連組成，在凝血酶的作用下α、β鏈釋放出兩條多肽生成纖維蛋白單體，單體聚合形成纖維蛋白多聚體，在鈣離子和活化的Ⅷ因子的作用下單體以共價鍵相連形成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白凝塊[13]。凝血酶時間(TT)是檢測凝血、抗凝及纖維蛋白溶解系統(tǒng)的實驗。

中醫(yī)研究[14]顯示，活血化瘀可以降低顱內(nèi)壓、促進血腫吸收，可以改善微循環(huán)，使側(cè)支循環(huán)開放，毛細血管增生，出血部位周圍的血管壓力下降，有利于防止再出血。黃芪是腦血疏的主要成分，具有抗脂質(zhì)氧化和消除自由基的作用，并能夠增強纖維蛋白溶解活性[14]。水蛭是活血化瘀方案中常用的藥物，也是腦血疏的主要成分，其含有多種生物活性成分，具有抗凝、抗炎、腦保護等多種作用，研究[15]表明其提取物含有的游離氨基酸可能是抗凝作用的有效成分，其活性成分作用于凝血過程，抑制凝血酶從而達到抗凝的作用。研究[16]證實，腦出血后血腫釋放的大量凝血酶在繼發(fā)性腦損傷中起著重要作用，而水蛭活性成分所含有的凝血酶抑制成分可能具有阻止凝血酶誘發(fā)的腦水腫形成的作用。腦血疏主要成分是黃芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黃、川芎，具有益氣活血的功效，用于腦出血的治療，可以增加腦血流、改善微循環(huán)、促進血腫的吸收。

在本項研究中，筆者對腦出血急性期大鼠應(yīng)用腦血疏治療。結(jié)果顯示：1)各組大鼠在術(shù)后24 h體質(zhì)量均有下降趨勢，與腦出血損傷有關(guān)；72 h后應(yīng)用低劑量腦血疏組大鼠體質(zhì)量較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示應(yīng)用腦血疏能夠改善大鼠腦出血術(shù)后體質(zhì)量下降趨勢。2)大鼠腦出血術(shù)后均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺陷癥狀，應(yīng)用低劑量腦血疏組術(shù)后48 h和72 h Longa評分均低術(shù)后24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；同時間點不同組間比較，實驗組較對照組有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；提示腦血疏可改善大鼠腦出血術(shù)后神經(jīng)功能評分。在本項研究中，筆者應(yīng)用3種神經(jīng)功能評分方法進行研究，其中只有Longa評分獲得了陽性結(jié)果，可能與有的大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)能力較強以及實驗入組大鼠數(shù)目偏少有關(guān)，必要時需要增加實驗動物數(shù)目進一步研究。3)凝血四項結(jié)果顯示：實驗組與對照組比較，PT、APTT、TT、INR下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示腦血疏可以激活內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)，起到促凝的作用，從而防止血腫進一步擴大；同時，實驗組與對照組比較Fib下降，提示腦血疏影響纖維蛋白溶解系統(tǒng)，其數(shù)值下降提示血液低凝或纖溶亢進，起到抗凝作用，從而改善微循環(huán)、促進血腫吸收。實驗組與對照組比較，F(xiàn)ib有下降趨勢，目前尚無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮與實驗入組動物數(shù)量偏少有關(guān)，有待于進一步研究。

該項研究顯示腦出血急性期應(yīng)用腦血疏(低劑量組)可改善大鼠腦出血術(shù)后體質(zhì)量下降和神經(jīng)功能評分，起到神經(jīng)保護的作用；其凝血指標(biāo)的變化提示促凝及纖溶同時存在。由此筆者推測腦出血急性期應(yīng)用腦血疏治療能夠改善大鼠體質(zhì)量下降以及神經(jīng)功能評分，可能通過影響急性期凝血機制，并且與止血、活血均有關(guān)，但仍需進一步研究。

[1] Kim J Y，Bae H J.Spontaneous intracerebral hemorrhage: Management [J].J Stroke，2017，19(1): 28-39.

[2] 張根明，周莉，崔方圓，等.出血性中風(fēng)病因病機新認識[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2013,11 (1): 87-88.

[3] 閆峰，吉訓(xùn)明，羅玉敏.多種實驗動物腦出血模型的制作[J].實驗動物科學(xué),2009,2 (26): 38-40.

[4] 謝道珍，頊寶玉.腦血疏口服液治療出血性中風(fēng)的研究[J].醫(yī)學(xué)研究通訊,2004,8 (33): 26，20.

[5] Zhao Z Q,Corvera J S,Halkos M E,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: Comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2): H579-588.

[6] Kharbanda R K,Nielsen T T,Redington A N.Translation of remote ischaemic preconditioning into clinical practice[J].Lancet,2009,31,374(9700): 1557-1565.

[7] Belayev L,Alonso O F,Busto R,et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture neurological and pathological evaluation of an improved model[J].Stroke,1996,27(9): 1616-1622.

[8] Brouwers H B,Falcone G J,McNamara K A,et al.CTA spotsign predicts hematoma expansion in patients with delayed presentation after intracerebral hemorrhage [J].Neurocrit Care,2012,17(3):421-428.

[9] 鄭國慶，黃漢津，王小同.腦出血后凝血酶的作用與抗凝酶治療[J].外國醫(yī)學(xué): 腦血管病分冊,2005,13(3): 199-202.

[10] 胡瑞，張曉云,晏雪,等.腦出血后炎性反應(yīng)機制的研究進展[J].中國腦血管病雜志，2015，12(7)：370-374.

[11] 何志義.microRNA與腦出血后腦水腫機制研究進展[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，43(11)：961-964.

[12] 費鮮明，陳艷，吳萬飛．仙鶴草水體物體對血小板聚集、凝血功能及血液流變學(xué)的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18(1): 10-13.

[13] 蔣力群，霍宇,楊捷.扶芳藤醇提取液對小鼠凝血四項的影響[J].中國醫(yī)藥指南，2016，10(14): 41-42.

[14] 顧燕岳，馬速.腦血疏口服液治療腦出血32例[J].河南中醫(yī)，2010,30(10): 982-983.

[15] 王蒙萌，楊永波.水蛭的化學(xué)成分及藥理作用[J].黑龍江中醫(yī)藥，2008(2): 47-48.

[16] 瞿新艷.水蛭的抗凝作用研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,19(13): 1582-1583.

EffectsofNaoxueshuonthebehaviorandcoagulationintheintracerebralhemorrhageinrats

Zhang Ying1,2,Liu Tao1,Yu Rong1,Zhou Ming1,Yan Feng2，Luo Yumin2*

(1.EncephalopathyDepartment,WeifangTraditionalChineseMedicineHospital，Weifang261042，ShandongProvince,China;2.CerebrovascularDiseasesResearchInstitute,XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100053,China)

ObjectiveTo study the protective effect of Naoxueshu in the intracerebral hemorrhage in rats and its effects on the coagulation.MethodsTotally 21 rats were injected with type Ⅳ collagenase were randomly divided into 3 groups,group A,group B and the control group.Group A and B were respectively given high and low concentration of Naoxueshu.We recorded the weight and assessed neurological function before sacrificing the rats at 24 hours,48 hours,and 72 hours,and tested the coagulation parameters finally.ResultsThe weight significantly increased at 24 h compared with that at the 72 h in group A and B (P<0.05).Compared with the control group,the weights significantly increased in group B at 72 h (P<0.05).The neurological function scores in group B were significantly decreased at 24 h，48 h and 72 h (P<0.05).Compared with the control group,the activated partial thromboplastin time (APTT) and International Normalized Ratio (INR) significantly decreased in group B (P<0.05).ConclusionNaoxueshu could improve the weights and the neurological defects in the acute phase of intracerebral hemorrhage in rats,the mechanism maybe associated with its coagulation function.

Naoxueshu;intracerebral hemorrhage;neurological function scores;blood coagulation

*Corresponding author，E-mail：yumin111@ccmu.edu.cn

時間：2017-12-13 21∶25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2125.058.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.013]

R743.34

2017-10-01)

編輯 陳瑞芳