陸 躍 劉建紅 趙 暉 常佳慧 相陽陽 張秋霞*

(1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069;2北京火箭軍醫(yī)院,北京 100840)

·基礎研究·

侯氏黑散對腦缺血大鼠神經導向因子及RhoGTP酶的影響

陸 躍1劉建紅2趙 暉1常佳慧1相陽陽1張秋霞1*

(1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069;2北京火箭軍醫(yī)院,北京 100840)

目的探討侯氏黑散對腦缺血大鼠神經導向因子Netrin-1/DCC和分子開關Rac1/Cdc42/RhoA表達的影響。方法采取線栓法制備永久性大腦中動脈栓塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMACO)模型。大鼠采用數字表法隨機分為假手術組、模型組、侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組、金納多組。運用Western blotting法和RT-PCR法檢測術后7d大鼠缺血側皮質Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白和基因的表達。結果與模型組相比，侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠Netrin-1蛋白的表達明顯升高(P<0.01)，侯氏黑散中劑量組大鼠Netrin-1基因的表達升高(P<0.05)；侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠DCC、Rac1、Cdc42蛋白和基因的表達明顯升高(P<0.05)；侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠RhoA蛋白和基因的表達則明顯下降(P<0.01)。結論侯氏黑散通過對腦缺血大鼠神經導向因子Netrin-1/DCC和分子開關Rac1/Cdc42/RhoA的調節(jié)促進腦缺血后神經功能的修復。

腦缺血；侯氏黑散；Netrin-1；DCC；Rac1；Cdc42；RhoA

侯氏黑散是治療腦卒中的第一方?？计浞剿帲饕娠L藥和補虛藥兩個單元組成。此方乃張仲景基于腦卒中“內虛邪中”的病機理論所創(chuàng)制。本課題組[1]的前期研究顯示，侯氏黑散可以減少軸突再生，抑制信號通路Nogo-A/ NgR及其下游信號通路RhoA/Rock2的表達，從而減少腦缺血后軸突的損傷。軸突導向生長是神經系統(tǒng)發(fā)育和有效修復的核心[2]。因此，腦缺血后激活軸突導向信號，是促進神經修復的關鍵原因。Netrin-1是最早被發(fā)現(xiàn)的神經導向因子，在成熟的中樞神經系統(tǒng)中表達量低于胚胎期[3-4]。Netrin-1與其受體結腸癌缺失蛋白(deleted colorectal cancer,DCC)結合，并進一步啟動內源性分子開關RhoA /Rac1/Cdc42，可以促進神經修復[5-7]。本部分實驗在前期研究[1]的基礎上，進一步通過Western blotting法和RT-PCR法檢測Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白和基因表達的變化。探討侯氏黑散對腦缺血大鼠神經導向因子Netrin-1/DCC和分子開關Rac1/Cdc42/RhoA表達的影響，為侯氏黑散促進腦缺血后神經功能修復提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體質量320～350 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(京)2010-0020。本實驗通過倫理審核(倫理編號：AEEI-2016-054)。將76只大鼠采用數字表法隨機分為5組，分別為假手術組12只，模型組、侯氏黑散5.25 g/kg組、侯氏黑散10.5 g/kg組以及金納多組各16只。

1.1.2 受試藥物

侯氏黑散由菊花、人參、細辛、防風、白術、桂枝、干姜、川芎、當歸以及茯苓組成。根據張仲景在《金匱要略》[8]中所記載的侯氏黑散原方劑量比例確定藥物劑量。所有中藥飲片均采購自北京同仁堂藥店。中藥飲片用30%(體積分數)乙醇回流提取[5]。采用金納多作為陽性藥，由德國威瑪舒培博士藥廠生產，藥品批號：5260613。

1.1.3 主要試劑

Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42抗體購自美國Abcam公司；RhoA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購自欣博盛生物科技有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。RNAprepPure Tissue Kit、RNase-Free DNaseⅠ試劑盒、FastQuant RT Kit、SuperRealPreMix Plus、GeneGreen Nucleic Acid Dye、loading buffer、MarkerⅢ購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖購自法國Biowest公司；β-巰基乙醇、無水乙醇購自北京化工廠。

1.1.4 主要儀器

電子天平(美國Adrenturer公司)；酶標儀(美國Moiecular Devices公司)；臺式離心機(德國Sartorius公司)；脫色搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；渦旋混勻器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；電泳儀、電轉儀、實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；超速冷凍離心機、梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國GE Healthcare公司)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(法國Vilber公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

參照文獻[6]方法將線栓法略加改進，制備大鼠腦缺血模型。將大鼠麻醉后仰臥固定，分離并結扎右側頸總和頸外動脈，在頸內和頸外動脈分叉處作一切口，插入尼龍線(直徑0.265 mm)約18 mm，感覺有阻力時停止進線，扎緊動脈殘端，縫合皮膚。假手術組大鼠麻醉后，僅暴露頸內外動脈分支，不閉塞大腦中動脈。

1.2.2 給藥及取材

假手術組、模型組灌服與給藥組同體積的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液；侯氏黑散小、中劑量組及金納多組的給藥劑量按體表面積折算，其等效劑量分別為5.25 g/kg、10.5 g/kg和2.8 g/kg。各給藥組于術后6 h給藥1次，之后每24 h給藥1次。腦缺血7d取腦組織，進行指標檢測。

1.2.3 Western blotting法檢測Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白

取各組大鼠缺血側皮質組織，冰上裂解30 min，4 ℃下10 000 r/min離心20 min，BCA法蛋白定量。每組均取6 μL蛋白樣品進行10%(質量分數) SDS-PAGE電泳，濕轉法電轉50 min，將PVDF膜放置于5%(質量分數)脫脂奶粉中室溫封閉1h，分別加入Netrin-1(兔源，1∶2 000)、DCC(兔源，1∶5 000)、Rac1(兔源，1∶15 000)、Cdc42(兔源，1∶5 000)，RhoA(兔源，1∶15 000)和GAPDH(小鼠源，1∶40 000)一抗中，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗4×5 min后，放入對應的山羊抗兔(IgG，1∶20 000)和山羊抗小鼠(HRP，1∶20 000)二抗中，室溫孵育1 h，TBST漂洗4×5 min次，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光。

1.2.4 RT-PCR檢測Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA基因

電子天平稱取25～30 mg的大鼠缺血側皮質組織，勻漿，冰上作業(yè)。使用RNAprepPure Tissue Kit從腦組織提取總RNA。用SoftMax Pro6.2.1軟件檢測樣本在260 nm和280 nm波長下的A值。使用FastQuant RT Kit從總RNA合成cDNA。引物由大連TakaRa公司合成，選擇β-actin作為內參對照。合成的引物相關情況見表1。將樣本放入BIO-RAD實時熒光定量儀，打開軟件，選擇β-actin作為內參。擴增條件為：95 ℃ 15 min變性，95 ℃ 10 s，52 ℃ 31 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。參照文獻[7]分析數據，以基因β-actin為內參對照，2-△△Ct(Ct代表循環(huán)閥值)表示Netrin-1、DCC、Rac1、Cdc42、RhoA基因相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for RT-PCR

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠Netrin-1、DCC蛋白和基因表達的比較

與假手術組相比，模型組大鼠Netrin-1、DCC蛋白的表達均顯著升高(P<0.01)。與模型組大鼠相比，侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠Netrin-1蛋白以及侯氏黑散小劑量組、侯氏黑散中劑量組大鼠DCC蛋白的表達均顯著上升(P<0.01)，金納多組大鼠DCC蛋白的表達明顯上升(P<0.05)。

與假手術組相比，模型組大鼠Netrin-1、DCC基因的表達明顯升高(P<0.05)。與模型組大鼠相比，侯氏黑散中劑量組大鼠皮質Netrin-1 基因的表達明顯上調(P<0.05)；侯氏黑散小、中劑量組以及金納多組大鼠皮質DCC基因的表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖 1)。

圖1 侯氏黑散對腦缺血大鼠皮質Netrin-1和DCC表達的影響Fig.1 Effects of HSHS on Netrin-1 and DCC signaling expression in cortex of pMCAO rats

A：Western blotting results;B：protein level；C：mRNA level;Sham:Sham group;pMCAO: pMCAO group;HSHS：Houshihensan;HSHS5.25: low dose of Houshiheisan；HSHS10.5: middle dose of Houshiheisan;Positive: Ginaton group;#P<0.05，##P<0.01vsSham group；*P<0.05，**P<0.01vspMCAO group.

2.2 各組大鼠Rac1、Cdc42、RhoA蛋白和基因表達的比較

與假手術組相比，模型組大鼠Rac1、Cdc42蛋白和基因的表達顯著降低(P<0.01)，RhoA蛋白和基因的表達顯著升高(P<0.01)。與模型組大鼠相比，侯氏黑散小、中劑量組以及金納多組大鼠Rac1、Cdc42蛋白和基因的表達顯著升高(P<0.01)，RhoA蛋白和基因的表達顯著下降(P<0.01)(圖2)。

圖2 侯氏黑散對腦缺血大鼠皮質Rac1、Cdc42和RhoA表達的影響Fig.2 Effects of HSHS on Rac1,Cdc42 and RhoA signaling expression in cortex of pMCAO rats

A：Western blotting results;B：protein level；C：mRNA level;Sham:Sham group;pMCAO: pMCAO group;HSHS5.25: low dose of Houshiheisan；HSHS10.5: middle dose of Houshiheisan;Positive: Ginaton group.##P<0.01vsSham group；**P<0.01vspMCAO group.

3 討論

侯氏黑散出自東漢·張仲景的《金匱要略》[8]，主治“大風四肢煩重，心中惡寒不足”。對于卒中的病因病機，唐宋以前的醫(yī)家認為是風邪外犯，主“內虛邪中”之說。分析侯氏黑散，本方主要由風藥和補虛藥兩部分藥物組成。風藥具有搜剔風邪治其標的作用，補虛藥可以溫振中陽治其本，侯氏黑散符合“內虛邪中”的病因病機理論。唐宋以降，百家爭鳴，醫(yī)家多從“內風”角度出發(fā)，提出了“心火暴盛”、“正氣自虛”、“陰虛痰熱”、“氣虛血瘀”、“肝陽上亢”等諸多卒中病的病因病機學說[9-10]。與此同時，基于“外風”之說創(chuàng)制的侯氏黑散等方劑逐漸被醫(yī)家摒棄。

清代葉天士[11]提出卒中源于“肝陽偏亢，內風時起”，民國·張錫純等基于此提出“肝陽化風”。馬萌[9]認為卒中的本質是氣機病，肝陽上亢，肝升太過，肺降不及，腑氣不降，大便不暢。考侯氏黑散，菊花質輕而用量獨重，占全方總重量的四成，是本方的主藥。《雷公炮制藥性解》[10]“丹溪云：菊花屬金，而有土于水，大能補陰。宜入肺肝等經，……得此補陰，則水盛而火自熄矣。”清代葉天士《本草經解》[11]謂菊花“味苦清火，火抑金勝，發(fā)花于秋，其稟秋金之氣獨全，故為制風木之上藥也?！逼甙妗吨兴帉W》[12]教材中記載菊花“歸肝、肺經。功效：疏散風熱，平抑肝陽，清肝明目，清熱解毒?！笨傊?，菊花可以清熱平肝，潛陽熄風。肝平肺降，則津液得布，腑氣得通。侯氏黑散重用菊花，又假礬石、牡蠣之力，具有平肝熄風的作用，不悖于唐宋以后的“內風”說。

風藥一詞，首見于金代張元素的《醫(yī)學啟源》。其弟子李東垣提出了“高顛之上，惟風可到”的理論，進一步深化了對風藥的認識[12]。清代徐大椿《神農本草經百種錄》[13]“凡藥之質輕而氣盛者，皆屬風藥”，首次提出了風藥的概念，將菊花、桂枝等藥納入風藥范疇?！侗静菰傩隆氛J為桂枝可“溫中行血”，《藥品化義》則謂其可“除肢節(jié)間痰凝血滯”[14]?，F(xiàn)代多認為卒中病的主要病理產物之一是瘀血，桂枝等風藥可溫散瘀血亦可驅內風[15]。當代研究[16-17]基于臨床實踐提出了“風藥增效”[16]、“風藥活血”[17]等理論。現(xiàn)代藥理研究顯示侯氏黑散可以提高腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表達，調控軸突生長抑制因子(Nogo-A)的表達[5]，激活內源性神經生長因子(nerve growth factor,NGF)，控制星形膠質細胞的異常激活[18]，抑制淀粉樣前體蛋白質(amyloid presurosor protein,APP)沉積[19]，調節(jié)腦缺血后炎性反應[20]，從而保護腦缺血后神經功能。

銀杏葉制劑有廣泛的腦保護作用，其作用機制主要有清除自由基，擴張血管，增加腦血流量，改善腦缺血、缺氧，減輕腦水腫，拮抗血小板活化因子，影響神經介質和改善學習記憶等[21]。本課題所使用的陽性藥物金納多為第4代銀杏制劑，目前在臨床上被廣泛應用于治療腦缺血[22]。

軸突導向生長是神經系統(tǒng)發(fā)育和有效修復的核心，腦缺血后軸突導向生長因子表達下降是導致軸突再生障礙的關鍵原因[2]。本研究通過侯氏黑散小、中計量組以及陽性藥物組與模型組相對比，探究經方侯氏黑散對腦缺血大鼠皮質軸突導向生長因子Netrin-1/DCC和分子開關Rac1/Cdc42/RhoA的影響。

Netrin-1是最早被發(fā)現(xiàn)的神經導向因子，其廣泛存在于體內多個部位，胚胎時期其主要存在于脊髓、延髓、中腦等部位的底板處，成熟期在中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)和周圍組織中也有存在，但總體表達量低于胚胎期[3]。DCC是Netrin-1的吸引性受體，兩者結合可精準地調控軸突生長錐的生長方向，通過吸引作用來調節(jié)靶向生長[23-24]。黃歡[25]發(fā)現(xiàn)，Netrin-1與其受體結合后還可以促進軸突及其分支形成和生長、引導和促進血管的生成以及維持細胞存活。提示腦缺血后激活內源性Netrin-1/DCC可以促進軸突再生和導向生長，有利于神經功能恢復。

本研究結果顯示，模型組大鼠缺血側皮質Netrin-1、DCC蛋白和基因表達明顯上調，腦缺血激活了Netrin-1、DCC的表達，提示機體自身對腦缺血后神經結構和功能損傷有一定的修復作用。本研究各用藥組的結果顯示，侯氏黑散中劑量組、金納多組大鼠Netrin-1蛋白的表達明顯升高(P<0.01)，侯氏黑散中劑量組大鼠Netrin-1基因的表達升高(P<0.05)；侯氏黑散小、中劑量組以及金納多組大鼠皮層DCC 蛋白和基因的表達較模型組明顯上調(P<0.05)。提示侯氏黑散可以加強機體對腦缺血后神經結構和功能損傷的修復作用，且侯氏黑散中劑量組效果優(yōu)于侯氏黑散小劑量組以及陽性藥物組。

Netrin-1所引起的軸突導向生長作用不僅需要與其受體DCC結合，還需要通過影響Rho族GTP酶(Rho GTPases)啟動細胞內信號轉導機制，促使軸突內細胞骨架的重排[26]。Rac1、Cdc42和RhoA是Rho GTPases家族中研究最多、作用機制最清楚的3個分子開關[27-28]。Rac1、Cdc42是吸引性分子開關，受Netrin-1等吸引性導向信號調控。Rac1通過促進細胞邊緣層板狀偽足絲狀偽足的形成推動細胞遷移，Cdc42參與細胞極性建立，指導細胞運動方向，兩者協(xié)同作用可以調節(jié)肌調蛋白促進軸突生長和穩(wěn)定[4]。RhoA是斥向性分子開關，受Nogo-A等多種排斥信號的調控，其活化可以促進應力纖維和黏著斑的形成，導致軸突的回縮以及生長錐的塌陷[29]。Rac1、Cdc42和RhoA共同作用促使細胞骨架重排，引起神經元的導向遷移，軸突導向生長和神經環(huán)路的重塑，干擾神經元Rho GTPases的活性明顯影響神經元突起的生長、側枝形成以及定向生長[30-31]。因此，調控Rac1、Cdc42和RhoA的表達是促進中樞神經損傷修復的關鍵環(huán)節(jié)[32]。本研究結果顯示，侯氏黑散可以上調Rac1、Cdc42的表達，同時下調RhoA的表達，且侯氏黑散中劑量組效果最優(yōu)。結果提示，侯氏黑散可明顯上調Rac1、Cdc42的表達，下調RhoA的表達，從而激活分子開關，有助于腦缺血后神經纖維的修復和再生。

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InfluenceofHoushiheisanontheexpressionofaxonguidancefactorandRhoGTPases

Lu Yue1,Liu Jianhong2,Zhao Hui1,Chang Jiahui1,Xiang Yangyang1,Zhang Qiuxia1*

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.TheGeneralHospitalofThePLARocketArmy,Beijing100840,China)

ObjectiveTo investigate the influence of Houshiheisan on the expression of axon guidance factor Netrin-1/DCC and molecular switch Rac1/Cdc42/RhoA in cerebral ischemia injury rats.MethodsThe permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO) model was made by the intraluminal suture method.Rats were randomly divided into sham group,model group,low dose of Houshiheisan group,middle dose of Houshiheisan group and Ginaton group.Western blotting and RT-PCR were employed to detect the expression of Netrin-1,DCC,Rac1,Cdc42 and RhoA in ischemic cerebral cortex of rats 7 days after operation.ResultsCompared with the model group,in the middle dose of Houshiheisan group and Ginaton groups,the expression of Netrin-1 protein was elevated significantly(P<0.01),middle dose of Houshiheisan group,the expression of Netrin-1 in mRNA was significantly increased(P<0.05);in the low dose of Houshiheisan,middle dose of Houshiheisan and Ginaton groups,the expression of DCC,Rac1 and Cdc42 protein and mRNA (P<0.05,P<0.01)was significantly increased;but the expression of RhoA protein and mRNA was decreased significantly (P<0.01).ConclusionThe findings demonstrated that Houshiheisan could accelerate the recovery of neurological impairment after celebral ischemia by regulating the expression of axon guidance factors like Netrin-1/DCC and molecular switch Rac1/Cdc42/RhoA.

cerebral ischemia;Houshiheisan;Netrin-1;DCC;Rac1;Cdc42;RhoA

國家自然科學基金(81373526)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81373526).

*Corresponding authors，E-mail：zqx26@163.com,jhliuluan@sina.com

時間：2017-12-13 20∶53

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2053.016.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.022]

R289.5

2017-10-16)

編輯 慕 萌