陳強(qiáng)，段青（德州市中醫(yī)院神經(jīng)外科，山東德州253000）

欖香烯乳聯(lián)合更昔洛韋對C6腦腫瘤干細(xì)胞侵襲能力及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響

陳強(qiáng)＊，段青（德州市中醫(yī)院神經(jīng)外科，山東德州253000）

目的：研究欖香烯乳聯(lián)合更昔洛韋對C6腦腫瘤干細(xì)胞（BTSCs）侵襲能力及組織金屬蛋白酶抑制物1（TIMP-1）mRNA表達(dá)的影響。方法：從大鼠C6惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中分離培養(yǎng)傳代3次的細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測其中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nestin蛋白表達(dá)情況。將20只大鼠隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、更昔洛韋組（ig，216 mg/kg）、欖香烯乳組（尾iv，36 mg/kg）和聯(lián)用組（ig更昔洛韋216 mg/kg+尾iv欖香烯乳36 mg/kg），每組5只，每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d。于末次給藥后2 h采集各組大鼠血液并分離血清，分別與C6 BTSCs在體外培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)24 h。采用Boyden侵襲試驗(yàn)檢測C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲能力，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法測定C6 BTSCs的TIMP-1 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：傳代3次后的細(xì)胞中CD133、Nestin蛋白有明顯表達(dá)，表明其為BTSCs。與空白對照組比較，更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯(lián)用組C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲率均明顯下降、TIMP-1 mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，聯(lián)用組C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲率明顯下降、TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：欖香烯乳聯(lián)合更昔洛韋可明顯抑制C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)TIMP-1的生成有關(guān)，且聯(lián)用效果強(qiáng)于單用。

C6惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株；腦腫瘤干細(xì)胞；欖香烯乳注射液；更昔洛韋分散片；細(xì)胞侵襲；組織金屬蛋白酶抑制物1

腦腫瘤干細(xì)胞（Brain tumor stem cells，BTSCs）是從腦腫瘤（尤其是惡性腦腫瘤）中分離的具有“干細(xì)胞”特征的種子細(xì)胞[1]。不同于干細(xì)胞的是，BTSCs的增殖與自我更新能力更強(qiáng)，離體培養(yǎng)時(shí)傳代次數(shù)也更多，因此被認(rèn)為是引發(fā)腦腫瘤并維持其浸潤性生長、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要細(xì)胞源[2]。目前，對于腦腫瘤的治療主要依靠化療、放療及手術(shù)等手段。有研究表明，含烷化劑的藥物聯(lián)合化療方案治療后患者2年內(nèi)生存率低于30%，中位生存時(shí)間也不足15個(gè)月；放療雖然可以提高治療效果，但其受到放療劑量的限制，且某些腫瘤細(xì)胞對放療敏感性低；手術(shù)并無法對腫瘤進(jìn)行徹底有效的根治，加上腦腫瘤復(fù)發(fā)率極高，因此眾多療法在腦腫瘤方面的臨床療效仍不能令人滿意[3]。近年來，神經(jīng)細(xì)胞學(xué)及電子顯微技術(shù)的重大進(jìn)步，極大地豐富了國內(nèi)外學(xué)者對腦腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識，自2002年最早發(fā)現(xiàn)并成功分離BTSCs后，國內(nèi)外學(xué)者便致力于對BTSCs進(jìn)行研究。隨著中醫(yī)藥在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，雙氫青蒿素、喜樹堿、山豆根等中藥成分已被證實(shí)具有明顯的抗癌作用[4]。欖香烯為中藥溫郁金中的主要活性成分，研究證實(shí)其細(xì)胞毒性小、不易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象、無骨髓抑制，且由于欖香烯分子量較小，極易透過血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）[5]，近年來已成為主治腫瘤的處方藥物[6]。更昔洛韋為目前臨床常用的廣譜抗病毒藥，可在多個(gè)靶點(diǎn)抑制病毒DNA進(jìn)行復(fù)制，抗病毒活性極強(qiáng)，加之其分子量不大，同樣也極易透過BBB[7]。有研究表明，莪術(shù)、白花蛇舌草等中藥復(fù)方提取物與更昔洛韋聯(lián)合應(yīng)用對于腫瘤血管的生成抑制效果顯著[8]。本研究將欖香烯乳與更昔洛韋聯(lián)合應(yīng)用，觀察其對BTSCs侵襲能力以及組織金屬蛋白酶抑制物1（TIMP-1）mRNA表達(dá)的影響，初步探討欖香烯乳聯(lián)合更昔洛韋是否可以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及其分子調(diào)控機(jī)制，以期為臨床抗腦腫瘤治療提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

G16型高速離心機(jī)（北京白洋醫(yī)用離心機(jī)有限公司，離心半徑：5.60 cm）；Prism?7000型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；CX23型熒光顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]；4XCTV型光倍顯微鏡（萊州萊華試驗(yàn)儀器廠）；U-1810DS型紫外分光光度儀[屹譜儀器制造（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

欖香烯乳注射液（大連華立金港藥業(yè)有限公司，批號：H10960114，規(guī)格：20 mL∶0.1 g）；更昔洛韋分散片（湖北東信藥業(yè)有限公司，批號：H20110082，規(guī)格：每片0.25 g）；兔抗人干細(xì)胞標(biāo)志物CD133一抗、兔抗大鼠肝細(xì)胞標(biāo)志物Nestin一抗和Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）；Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白G（IgG）、Alexa Fluor 610標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（美國Molecular Probes公司）；多聚甲醛、結(jié)晶紫、Hoechst 33342染色液（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）；Gibco?胎牛血清（FBS，美國Thermo Fisher公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（上海博升生物科技有限公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）；堿性成纖維生長因子、表皮生長因子（美國Sigma公司）；B-27添加劑（美國Invitrogen公司）；RT-PCR試劑（威斯騰生物醫(yī)藥科技有限公司）；Trizol試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 細(xì)胞與動(dòng)物

大鼠C6惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（上海細(xì)胞所）。SD大鼠，♂，體質(zhì)量240～260 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)合格證號：SCXK（京）2011-0011，使用許可證號：SYXK（魯）2011-0034。本實(shí)驗(yàn)在我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并同意的情況下進(jìn)行。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

先用普通培養(yǎng)基（含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基）對C6惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞在37℃、相對濕度95%、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)，按照3×103個(gè)/cm2的密度在無血清培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度均為20 ng/mL的堿性成纖維生長因子與表皮生長因子、質(zhì)量濃度為20 μg/mL的B-27添加劑）中再繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d換液1次；6 d時(shí)消化制備成單細(xì)胞懸液，并以相同的密度接種在24孔板中。傳代3次后作為C6 BTSCs進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞中CD133、Nestin蛋白的表達(dá)

為了證實(shí)“2.1”項(xiàng)下傳代3次后的細(xì)胞已經(jīng)是BTSCs，筆者將分離得到的細(xì)胞倒去培養(yǎng)基后用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗滌3次。加封閉液進(jìn)行封閉，1 h后加兔抗人CD133一抗于濕盒中，4℃條件下孵育過夜。然后繼續(xù)加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗人IgG、Alexa Fluor 610標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗于37℃條件下孵育1 h。最后再加Hoechst 33342染色液，10 min后用PBS洗滌3次并用蓋玻片進(jìn)行封固，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察細(xì)胞中CD133、Nestin蛋白表達(dá)情況。

2.3 分組、給藥及含藥血清制備

將20只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯(lián)用組，每組5只。更昔洛韋組大鼠ig給予以生理鹽水溶解稀釋的更昔洛韋分散片，給藥劑量為216 mg/kg；欖香烯乳組大鼠尾iv給予欖香烯乳注射液，給藥劑量為36 mg/kg，藥物劑量均參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》大鼠與人臨床等效劑量表設(shè)定；聯(lián)用組大鼠先ig給予更昔洛韋216 mg/kg進(jìn)行抗病毒治療，間隔0.5 h后，尾iv給予欖香烯乳36 mg/kg；空白對照組大鼠給予等量生理鹽水。各組大鼠每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d，于末次給藥2 h后采集大鼠血液并分離血清。

2.4 C6 BTSCs與給藥血清的體外培養(yǎng)

用無血清培養(yǎng)基對C6 BTSCs進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)分別加入10%的空白對照組、更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯(lián)用組大鼠的分離血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.5 Boyden侵襲試驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲率

用100 μL Matrigel基質(zhì)膠將Transwell小室上室的底膜包被，分別在2個(gè)下室中添加200 μL的趨化液，將包被Matrigel基質(zhì)膠底膜的上室套入其中一個(gè)下室，并以沒有鋪Matrigel基質(zhì)膠的上室作為對照組。調(diào)整并配制細(xì)胞密度為2.5×108個(gè)/L的含藥血清C6 BTSCs單細(xì)胞懸浮液，取200 μL分別加入2個(gè)上室中，37℃條件下培養(yǎng)20 h后，取出上室，棄去殘留細(xì)胞及Matrigel基質(zhì)膠，并加入300 μL的70%甲醇進(jìn)行固定，0.5 h后用PBS洗滌3次。加300 μL的蘇木精染液進(jìn)行染色，10 min后用雙蒸水漂洗3次，蓋玻片封膜，使用光倍顯微鏡放大400倍觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲率（%）[試驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)/對照組（無Matrigel基質(zhì)膠）穿膜細(xì)胞數(shù)×100%]。試驗(yàn)重復(fù)5次。

2.6 RT-PCR法檢測細(xì)胞中TIMP-1 mRNA表達(dá)

按照Trizol試劑盒說明書用氯仿提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性15 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min終止反應(yīng)。用紫外分光光度儀測定吸光度。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，以TIMP-1與內(nèi)參吸光度的比值表示TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 PCR反應(yīng)擴(kuò)增引物序列Tab 1Primer sequence of PCR reaction amplification

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 免疫熒光染色圖（×400）Fig 1Immunofluorescence staining（×400）

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞中CD133與Nestin蛋白表達(dá)

經(jīng)免疫熒光染色后，CD133表達(dá)呈強(qiáng)綠色熒光，Nestin呈強(qiáng)紅色熒光。傳代3次后的細(xì)胞中CD133、Nestin蛋白有明顯表達(dá)，表明細(xì)胞確為C6 BTSCs。免疫熒光染色圖見圖1。

3.2 細(xì)胞侵襲率

與空白對照組比較，更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯(lián)用組C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲率均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，聯(lián)用組C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲率結(jié)果見表2。

表2各組C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲率和TIMP-1 mRNA表達(dá)情況比較（±s，n＝5）

Tab 2Comparison of invasive rate of C6 BTSCs and TIMP-1 mRNA expression in each group（±s，n＝5）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.ganciclovir group and Elemene emulsion injection group，#P＜0.05

3.3 細(xì)胞中TIMP-1 mRNA表達(dá)

與空白對照組比較，更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯(lián)用組C6 BTSCs中TIMP-1 mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，聯(lián)用組C6 BTSCs中TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組C6 BTSCs中TIMP-1 mRNA表達(dá)結(jié)果見表2。

4 討論

腦腫瘤（尤其是惡性膠質(zhì)瘤）是臨床致死率比較高的腫瘤之一。目前常用的臨床療法包括手術(shù)、放療、化療、加壓氧療以及基因靶向療法等，但由于惡性膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長，造成其與正常腦組織的界限并不能完全區(qū)分，因此給手術(shù)切除治療造成極大的困難，即使憑借神經(jīng)細(xì)胞學(xué)及影像學(xué)等高度發(fā)展的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，手術(shù)治療也無法徹底完整切除腫瘤組織；放療、化療等療法對骨髓、消化道等的副作用大，某些腫瘤細(xì)胞對此也并不敏感，造成如今腦腫瘤臨床效果均不佳，加之復(fù)發(fā)率較高，給患者的生理與心理造成極大的消極影響[9]。腦腫瘤的高復(fù)發(fā)率主要依賴于膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以迅速增殖，并且具有較強(qiáng)的浸潤性及耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤早期某些膠質(zhì)瘤細(xì)胞已經(jīng)沿血管外間隙、白質(zhì)束及室管膜等進(jìn)行浸潤[10]。而有研究表明，BTSCs具有類似“神經(jīng)干細(xì)胞”的生物學(xué)特征，可以在體內(nèi)分化成神經(jīng)元，進(jìn)而表達(dá)CD133與Nestin等表面標(biāo)記物[11]。因此，成功分離獲得BTSCs并以此為靶標(biāo)找到有效治療方法，對于膠質(zhì)瘤的治療與預(yù)后將有重要的臨床意義。

溫郁金是中藥中行氣活血化瘀的藥物。中醫(yī)認(rèn)為，血瘀是腫瘤形成的重要原因之一，瘀血是腫瘤的病理產(chǎn)物。欖香烯乳注射液是中藥溫郁金主要抗癌成分欖香烯的注射劑，欖香烯是一種小分子化合物，分子量為204.36。已有大量文獻(xiàn)表明，欖香烯可以透過BBB，臨床治療腦惡性膠質(zhì)瘤有效率可以達(dá)到70%以上；且其毒性甚微，對骨髓幾乎無毒副作用，不易產(chǎn)生耐藥，既可以殺傷腫瘤組織，又能保證正常器官不被傷害，因而是臨床化療的理想藥物[5]。更昔洛韋作為一種廣譜性抗病毒藥，可通過病毒腺激酶對DNA聚合酶進(jìn)行競爭性抑制，被病毒所誘生的蛋白酶磷酸化后可直接滲入病毒DNA鏈阻止其延長；由于更昔洛韋分子量也較小，因此極易透過BBB。目前，已有研究表明欖香烯乳注射液對惡性腦腫瘤患者療效滿意[6]，但聯(lián)合更昔洛韋對C6 BTSCs的細(xì)胞侵襲能力及TIMP-1 mRNA的表達(dá)影響如何目前尚未見報(bào)道。本研究通過培養(yǎng)大鼠C6 BTSCs，觀察欖香烯乳聯(lián)合更昔洛韋對其侵襲能力以及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響，初步探討聯(lián)用后是否可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及分子調(diào)控機(jī)制，以期為欖香烯乳臨床抗腦腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

CD133與Nestin是具有增殖及多向分化能力的神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，首先從原代腫瘤組織中成功分離并純化出BTSCs，并用免疫細(xì)胞化學(xué)法對CD133及Nestin進(jìn)行了檢測，以確定傳代細(xì)胞的干細(xì)胞特征。

Boyden侵襲試驗(yàn)是模擬腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力的可靠模型，多用于侵襲機(jī)制的研究，該模型中的Matrigel膠質(zhì)膠與人類基底膜的基本成分相似，因而含有層黏蛋白、Ⅳ型膠原等成分。在惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞必須通過形態(tài)的改變及分泌蛋白酶使細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrixc，ECM）降解從而穿透基底膜，方可進(jìn)入血管、淋巴進(jìn)行轉(zhuǎn)移[12]。本研究采用Boyden侵襲小室技術(shù)，測定了C6 BTSCs在空白對照、更昔洛韋、欖香烯乳、聯(lián)用藥4種血清干預(yù)下侵襲基底膜情況，結(jié)果表明欖香烯乳與更昔洛韋聯(lián)用可以顯著抑制C6 BTSCs的體外侵襲能力。

目前，國內(nèi)外學(xué)者的研究表明，ECM纖維所生成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對腫瘤細(xì)胞的生成、浸潤與轉(zhuǎn)移具有阻礙作用[13]?；|(zhì)金屬蛋白酶家族中的基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloprotein，MMP-9）則是調(diào)節(jié)ECM代謝的最主要限速酶，可以降解ECM及基底膜，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。TIMP-1是MMP-9的高特異性抑制劑，通過與酶原MMP-9以非共價(jià)的方式結(jié)合，可延緩或阻礙后者向激活型MMP-9的轉(zhuǎn)化，從而抑制MMP-9參與降解ECM，達(dá)到減緩腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的目的[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯乳注射液與更昔洛韋聯(lián)用可以通過促進(jìn)TIMP-1 mRNA的表達(dá)，從而抑制MMP-9對ECM的降解，最終起到抑制C6 BTSCs侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，為欖香烯乳與更昔洛韋聯(lián)用于抗BTSCs的侵襲轉(zhuǎn)移提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]劉昊，楊海城.腦腫瘤干細(xì)胞相關(guān)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2014，20（19）：3508-3509.

[2]Mendoza FHD，Rodriguez EA.Cancer stem cells inbraintumors[M].Berlin：SpringerNetherlands，2014：229-243.

[3]吳艷林，蔡政，張明智，等.雙氫青蒿素抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制[J].中國組織工程研究，2016，20（6）：765-770.

[4]劉建民，黃良文，胡鵬，等.活血化瘀中藥對C6腦腫瘤干細(xì)胞侵襲能力及TIMP1 mRNA表達(dá)的影響[J].新中醫(yī)，2013，45（8）：192-194.

[5]徐雪香，莊志明.欖香烯乳的藥理作用與臨床應(yīng)用近展[J].海峽藥學(xué)，2001，13（2）：7-8.

[6]陳俊，繆亦峰，鐘皎，等.欖香烯乳注射液聯(lián)合放療治療惡性腦膠質(zhì)瘤的臨床觀察[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15（11）：1017-1019.

[7]呂婷婷，高景云，魯曉晴，等.中藥聯(lián)合更昔洛韋對HCMV陽性腦腫瘤干細(xì)胞移植瘤的作用[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，52（6）：634-638.

[8]秦鐵城，文海斌，陳珮，等.莪術(shù)提取物誘導(dǎo)人腦惡性膠質(zhì)瘤CHG-5細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（27）：2980-2983.

[9]許森林.高侵襲性腫瘤細(xì)胞的干性特征及臨床意義研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2011.

[10]仇波，杜江，張東勇，等.人腦膠質(zhì)瘤組織培養(yǎng)的干細(xì)胞樣細(xì)胞具有體外高侵襲能力[J].中國腫瘤生物治療雜志，2012，19（2）：128-132.

[11]齊玲，金宏，丁麗娟，等.CD133免疫磁珠分選腦腫瘤干細(xì)胞及其生物學(xué)特性[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，37（3）：441-444.

[12]沈培亮，劉兆國，王旭，等.腫瘤ECM纖維生成與腫瘤轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（11）：1485-1488.

[13]胡梅艷，孫曉紅.細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶與惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].腫瘤藥學(xué)，2016，6（1）：26-30.

[14]Okada R，Naito M，Hattori Y，et al.Matrix metalloproteinase 9 gene polymorphisms are associated with a multiple family history of gastric cancer[J].Gastric Cancer，2017，20（2）：246-253.

Effect of Elemene Emulsion Injection Combined with Ganciclovir on Invasive Ability and TIMP-1 mRNA Expression in C6 Brain Tumor Stem Cells

CHEN Qiang，DUAN Qing（Dept.of Neurosurgery，Dezhou City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong Dezhou 253000，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Elemene emulsion combined with ganciclovir on invasive ability and TIMP-1 mRNA expression in C6 brain tumor stem cells.METHODS：Cells with 3 generations were isolated and cultured from rats’C6 malignant glioma cell lines，and immunocytochemistry was adopted to detect the protein expressions of stem cell markers CD133，Nestin.20 rats were randomly divided into blank control group（normal saline），ganciclovir group（intragastrically administrated，216 mg/kg），Elemene emulsion injection group（intravenously injected in tail，36 mg/kg）and combination group（intragastrically administrated 216 mg/kg of ganciclovir+intravenously injected 36 mg/kg of Elemene emulsion injection in tail），5 in each group，once every day，for 10 d.After 2 h of last administration，the blood of rats in each group was collected，serum was isolated and co-cultured 24 h with C6 BTSCs in in vitro culture medium.Boyden invasion test was used to detect the invasive ability of C6 BTSCs，and real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）method was used to determine the TIMP-1 mRNA expression of C6 BTSCs.RESULTS：Cells with 3 generations had obvious protein expressions in CD133 and Nestin，indicating they were BTSCs.Compared with blank control group，the cell invasion rates of C6 BTSCs in ganciclovir group，Elemene emulsion injection group and combination group were obviously decreased，TIMP-1 mRNA expression was obviously enhanced，with statistical significances（P＜0.05）.Compared with ganciclovir group and Elemene emulsion injection group，the cell invasion rate of C6 BTSCs in combination group was obviously decreased，TIMP-1 mRNA expression was obviously enhanced，with statistical significances（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Elemene emulsion injection combined with ganciclovir can obviously inhibit the cell invasion of C6 BTSCs，the mechanism may be associated with promoting the TIMP-1 generation，and combination use shows better effect than single use.

C6 malignant glioma cell lines；Brain tumor stem cells；Elemene emulsion injection；Ganciclovir dispersible tablets；Cell invasion；Tissue inhibitor of metalloproteinase 1

R965；R361+.3

A

1001-0408（2017）34-4826-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.19

＊副主任醫(yī)師。研究方向：神經(jīng)外科。電話：0534-2725036。E-mail：pansirr@126.com

2017-04-21

2017-07-20）

（編輯：鄒麗娟）