王有森，王智亮（濰坊市人民醫(yī)院藥劑科，山東濰坊261599）

HPLC法同時(shí)測(cè)定大黃-黃連藥材中5種蒽醌類成分的含量及最優(yōu)配伍研究

王有森＊，王智亮（濰坊市人民醫(yī)院藥劑科，山東濰坊261599）

目的：建立同時(shí)測(cè)定大黃-黃連藥材中5種蒽醌類成分含量的方法，并優(yōu)選大黃-黃連藥材質(zhì)量比。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（48∶52，V/V，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。考察大黃-黃連藥材質(zhì)量比為1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2時(shí)配伍藥材中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。結(jié)果：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)樣量分別在0.652～3.081、0.704～3.422、1.280～6.197、0.633～0.324、1.326～5.954 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r≥0.999 7），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%（n＝6），平均加樣回收率為98.92%～100.37%（RSD≤2.26%，n＝6）。大黃-黃連藥材質(zhì)量比為2∶1時(shí)，5種蒽醌類成分總量最高。結(jié)論：本方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于不同配伍比大黃-黃連藥材的質(zhì)量檢定；大黃-黃連藥材的最佳質(zhì)量比為2∶1。

大黃；黃連；配伍；蒽醌類成分；高效液相色譜法

大黃黃連瀉心湯源自張仲景的《傷寒雜病論》，注有“心下痞，按之濡，其脈關(guān)上浮者，大黃黃連瀉心湯主之”[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，大黃黃連瀉心湯具有調(diào)血脂、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗消化性潰瘍等作用[2-4]。該方由大黃2兩、黃連1兩合煎而成，即大黃-黃連藥材的質(zhì)量比為2∶1，但這是否是其有效成分的最佳比例尚不得而知。因此，筆者以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定大黃-黃連藥材不同配伍下蒽醌類成分（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）的含量[5-7]，以多種成分指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)大黃黃連瀉心湯加減方，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；KQ-500GVDV型超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；BS224S型分析天平（德國(guó)Satorius公司）；MF10型粉碎機(jī)（德國(guó)IKA公司）。

1.2 藥材與試劑

大黃、黃連藥材購(gòu)自安徽亳州，經(jīng)濰坊市人民醫(yī)院藥劑科王智亮主管藥師鑒定，均符合2015年《中國(guó)藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110795-201305、110757-201302、110756-201210、110796-201101、110758-201206，純度：＞98%）；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（48∶52，V/V，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL[8-10]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備按“2.9”項(xiàng)下質(zhì)量比稱取大黃-黃連藥材共約0.2 g，精密稱定，加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備取減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，以甲醇溶解，超聲20 min，制得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為0.124 8、0.135 2、0.250 7、0.126 7、0.264 5 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚出峰處未見(jiàn)其他干擾峰；蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分離度大于2，且以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰理論板數(shù)計(jì)大于4 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品溶液5、10、15、20、25 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x，μg）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程、線性范圍見(jiàn)表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1Regression equation and linear range

由表1可知，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

量取混合對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.24%、0.86%、0.73%、1.09%、0.86%（n＝6），表明本試驗(yàn)精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.98%、0.85%、1.32%、1.16%、0.92%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取大黃、黃連適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為1.48%、1.86%、1.25%、1.19%、1.07%（n＝6），表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的大黃-黃連樣品（質(zhì)量比為2∶1），共6份，加入蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品溶液（0.124 8、0.135 2、0.250 7、0.126 7、0.264 5 mg/mL）適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品中蒽醌類成分的含量測(cè)定

制備大黃-黃連藥材質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2的樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定蒽醌類成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

大黃、黃連二藥，味苦性寒、直折火勢(shì)，是治療各種火證的主藥。黃連解毒湯、大黃湯、梔子金花湯、三補(bǔ)丸、大金花丸、清心丸、既濟(jì)解毒湯、人中黃丸、當(dāng)歸龍薈丸等瀉火之劑，其實(shí)都是在大黃黃連瀉心湯基礎(chǔ)上，據(jù)證加減而成?！督饏T要略》中提到大黃瀉心湯可“急瀉三陽(yáng)實(shí)火”，大黃中蒽醌類成分的作用就是泄下[11]，黃連中生物堿作用為抑菌[12-13]，因此本文考察重點(diǎn)為蒽醌類成分。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery test（n＝6）

表3 含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3Result of content determination（n＝3，mg/g）

供試品溶液的制備中比較了超聲和回流提取法，結(jié)果超聲提取效果明顯且操作簡(jiǎn)單、方便，用時(shí)較短，故采用超聲提取法。超聲提取法是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，通過(guò)破壞植物藥材的細(xì)胞，使溶劑滲透到藥材細(xì)胞中，可縮短提取時(shí)間、提高提取率，多用于小型生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)。超聲提取與藥材實(shí)際運(yùn)用中的煎煮提取都是屬于物理提取，但超聲提取較煎煮提取藥材有效成分含量多，由于各指標(biāo)成分在超聲或煎煮中提取條件一致，因此各成分含量比例一致[14-16]。筆者為了讓各藥對(duì)中各指標(biāo)成分在短時(shí)間內(nèi)含量結(jié)果差異更明顯，因此采用超聲提取法，這也是試驗(yàn)中采取的通用方法。筆者在預(yù)試驗(yàn)中考察了不同超聲時(shí)間下，不同百分比甲醇、乙醇的超聲效果，結(jié)果表明各指標(biāo)成分在甲醇中超聲40 min提取率較高。

2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中大黃和三黃片等含大黃的制劑中蒽醌類成分含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)均為254 nm[17]，實(shí)驗(yàn)對(duì)5種成分進(jìn)行200～400 nm全波長(zhǎng)掃描，測(cè)得最大吸收峰均為（250±5）nm，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

由含量測(cè)定結(jié)果可知，當(dāng)大黃-黃連藥材質(zhì)量比為1∶1時(shí)，蒽醌類成分含量最低；隨著黃連的比例降低，蒽醌類成分逐漸增加。這可能是由于大黃-黃連配伍時(shí)，黃連主要成分生物堿與酸性的蒽醌類發(fā)生沉淀作用，使得大黃蒽醌類成分減少。由于該方中大黃和黃連均為主要組成，因此不宜過(guò)多減少黃連比例，故本試驗(yàn)未考察大黃-黃連質(zhì)量比超過(guò)3∶1的配比[18-20]。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，可用于大黃-黃連不同配伍下蒽醌類成分的含量測(cè)定。在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)增加大黃配比，可增加蒽醌類成分含量。

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Simultaneous Content Determination of 5 Anthraquinones of Rhei Radix-coptidis Rhizoma by HPLC and Study on the Optimal Compatibility

WANG Yousen，WANG Zhiliang（Dept.of Pharmacy，Weifang People’s Hospital，Shandong Weifang 261599，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous content determination 5 anthraquinones of rhei radix-coptidis rhizoma，and optimize its best mass ratio.METHODS：HPLC was performed on the column of Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）with mobile phase of acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate（48∶52，V/V，adding sodium dodecyl sulfate 0.4 g per 100 mL，pH value was adjusted to 4.0）；detection wavelength was 254 nm；flow rate was 1 mL/min；column temperature was 25℃；and injection volume was 10 μL.When mass ratio of rhei radix-coptidis rhizoma was 1∶1，1∶2，2∶1，2∶3，3∶2，the contents of aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and emodin ether were investigated.RESULTS：The aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and emodin ether showed good linear relationship with peak area in the range of 0.652-3.081，0.704-3.422，1.280-6.197，0.633-0.324，1.326-5.954 μg（r≥0.999 7）；RSDs of precision，stability，reproducibility tests were lower than 2.0%（n＝6）；and average recovery was 98.92%-100.37%（RSD≤2.26%，n＝6）.When mass ratio was 2∶1，the total contents of 5 ingredients were the highest.CONCLUSIONS：The method has good precision，stability，reproducibility，and can be used for the quality verification of rhei radix-coptidis rhizoma under different compatibilities.The best mass ratio of rhei radixcoptidis rhizoma is 2∶1.

Rhei radix；Coptidis rhizoma；Compatibility；Anthraquinones；HPLC

R943.1

A

1001-0408（2017）34-4818-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.17

＊主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0536-8234981。E-mail：wfwys666@163.com

2017-08-22

2017-10-07）

（編輯：劉明偉）