魏江存，陳勇，謝臻，李耀華，唐春麗，闕祖亮，庾延和，張昕，龐丹清（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧53000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧5300）

10批不同產(chǎn)地六棱菊中咖啡酸的工藝優(yōu)化與含量測(cè)定Δ

魏江存1＊，陳勇1#，謝臻1，李耀華1，唐春麗2，闕祖亮1，庾延和1，張昕1，龐丹清1（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧530020；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧530022）

目的：優(yōu)化六棱菊中咖啡酸提取工藝，并建立其含量測(cè)定方法。方法：以回流提取法提取六棱菊中咖啡酸。以提取含量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及提取時(shí)間對(duì)咖啡酸提取的影響，優(yōu)化提取工藝條件。采用高效液相色譜法，以咖啡酸為對(duì)照品，在320 nm波長(zhǎng)下測(cè)定10批不同產(chǎn)地六棱菊藥材中的咖啡酸含量。結(jié)果：優(yōu)化的提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、料液比為1∶40、提取時(shí)間為3 h。以此條件對(duì)咖啡酸進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，六棱菊中咖啡酸平均含量為0.521 1 mg/g（RSD＝1.18%，n＝3）。10批不同產(chǎn)地六棱菊藥材中咖啡酸含量在0.375 2～0.776 6 mg/g之間，含量差異較大。結(jié)論：六棱菊藥材中咖啡酸含量與產(chǎn)地和采收季節(jié)等有關(guān)。本試驗(yàn)優(yōu)選工藝提取咖啡酸重復(fù)性較好；建立的咖啡酸含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可行。

六棱菊；含量測(cè)定；咖啡酸；高效液相色譜法

六棱菊[Laggera alata（D.Don）Sch.Bip.ex Oliv]系菊科六棱菊屬植物，全草入藥，性苦、辛，微溫，有祛風(fēng)、除濕、解毒之功效，在民間作為抗菌消炎、清熱解毒的良藥，主要分布于我國(guó)東部、東南部至西南部，北至安徽和湖北[1]。因六棱菊新鮮的枝葉揉搓后散發(fā)特殊的臭味，民間稱之為“臭靈丹”[2]，以“臭靈丹”為主的許多復(fù)方制劑在臨床上應(yīng)用也取得較好的療效[3-5]。目前，六棱菊多應(yīng)用于急性扁桃體炎[6]、感冒[7]、病毒感染[8]等的治療。

六棱菊主要含倍半萜類、黃酮類、酚酸類等化學(xué)成分[2，9-12]，具有治療急慢性炎癥、抗腫瘤、抗病毒和抗微生物活性等功效[2]。其中，咖啡酸屬于酚酸類化合物，在金銀花、野菊花和蒲公英等植物中廣泛分布?？Х人峋哂卸喾N藥理作用[13]，主要包括保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)免疫、降脂、降糖、利膽止血等。以咖啡酸作為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，可以為六棱菊藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，然而國(guó)內(nèi)外未見對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)不僅建立了六棱菊中咖啡酸的含量測(cè)定方法，還同時(shí)測(cè)定了廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地六棱菊中咖啡酸的含量，并比較不同產(chǎn)地藥材中咖啡酸含量差異，為六棱菊藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695高效液相色譜儀，包括2489紫外檢測(cè)器、四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower3工作站（美國(guó)Waters公司）；Simplicity純水系統(tǒng)（密理博中國(guó)有限公司）；Practum224-1CN分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；0.45 μm微孔濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑與藥材

咖啡酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1110885-200102，純度：＞98.0%）；乙腈為色譜純，甲醇和磷酸為分析純，試驗(yàn)用水為純水。所有六棱菊藥材樣品均經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院田輝教授鑒定為菊科六棱菊屬植物六棱菊[Laggera alata（D.Don）Sch.Bip.ex Oliv]的全草。六棱菊樣品信息見表1。

表1 廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊樣品信息Tab 1Sample information of 10 batches of L.alatafromdifferentareasinGuangxi Zhuang Autonomous Region

2 方法與結(jié)果

2.1 六棱菊中咖啡酸提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素考察（1）提取方法考察。從六棱菊中提取咖啡酸的方法主要有回流提取法、超聲提取法、浸漬法、滲漉法、煎煮法等[14]。以咖啡酸提取時(shí)間1 h、料液比1∶40、提取溶劑45%乙醇為提取條件，分別采用回流提取法、超聲提取法和溶劑浸漬法提取六棱菊中的咖啡酸。結(jié)果，回流提取法對(duì)咖啡酸提取率較高，故采用回流提取法。（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)考察。固定咖啡酸提取時(shí)間為3 h、料液比為1∶40，采用回流提取法，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、25%、45%、65%、95%提取六棱菊中咖啡酸并計(jì)算得率。結(jié)果，25%乙醇回流提取率較高，但與10%乙醇提取效果差別不大。從減少乙醇溶劑方面考慮，選用10%乙醇為提取體積分?jǐn)?shù)。（3）料液比考察。固定咖啡酸提取時(shí)間為3 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，采用回流提取法，以料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60提取六棱菊中咖啡酸并計(jì)算得率。結(jié)果，料液比為1∶40時(shí)咖啡酸得率較高，故選用料液比為1∶40。（4）提取時(shí)間考察。固定料液比為1∶40、乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，采用回流提取法，以提取時(shí)間為1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 h提取六棱菊中咖啡酸并計(jì)算得率。結(jié)果，提取時(shí)間為2.5 h時(shí)咖啡酸得率較高，故選用提取時(shí)間為2.5 h。

2.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)[15]和參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部），以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A，%）、料液比（B，g/mL）、提取時(shí)間（C，h）為考察因素，以咖啡酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按3因素3水平選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。各因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab 2Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3Orthogonal test design and results

表4 方差分析結(jié)果Tab 4Result of variance analysis

由表3可知，各提取因素對(duì)六棱菊提取工藝的影響順序?yàn)锳＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)六棱菊的提取工藝影響最大，其次是提取時(shí)間，最后是料液比。由表4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)六棱菊提取具有顯著影響，而料液比和提取時(shí)間無(wú)顯著影響，所以對(duì)六棱菊中咖啡酸成分提取效果有顯著影響的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)。因此，本試驗(yàn)最理想的提取方案是A1B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、料液比為1∶40、提取時(shí)間為3 h時(shí)，提取效果最佳。

2.1.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)以優(yōu)選出的咖啡酸提取條件進(jìn)行六棱菊中咖啡酸提取的驗(yàn)證試驗(yàn)。分別稱取3份六棱菊藥材粉末，分別為0.500 6、0.500 1，0.500 9 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，平行進(jìn)行3次測(cè)定。計(jì)算六棱菊中咖啡酸含量分別為0.521 4、0.514 8、0.527 1 mg/g，平均含量為0.521 1 mg/g，RSD＝1.18%（n＝3）。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)化后的咖啡酸提取條件較好，工藝可行。

2.2 高效液相色譜法測(cè)定六棱菊中咖啡酸的含量

按文獻(xiàn)[15-16]和參考2015年版《中國(guó)藥典》（四部）方法測(cè)定含量。2.2.1色譜條件色譜柱為Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（22∶78，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。按照上述條件測(cè)定，各組分分離度良好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取咖啡酸對(duì)照品16.2 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得咖啡酸對(duì)照品貯備液，質(zhì)量濃度為0.81 mg/mL。精密量取上述咖啡酸對(duì)照品貯備液2 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，即得咖啡酸對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度為64.8 μg/mL。精密量取上述對(duì)照品溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，即得咖啡酸對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度為12.96 μg/mL，此咖啡酸濃度用于做線性方程。

2.2.3 供試品溶液的制備精密稱取六棱菊藥材粉末0.5 g，使用10%乙醇提取，回流，以離心半徑0.65 cm、13 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察按相關(guān)方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，所用色譜條件分離效果良好，提取溶劑對(duì)咖啡酸測(cè)定無(wú)干擾，咖啡酸出峰時(shí)間為6.8 min。以咖啡酸進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為橫坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝4×106x－22 912（r＝0.999 1），檢測(cè)限為10.60μg/mL，咖啡酸進(jìn)樣量的線性范圍為0.025 92～0.259 2μg；精密度試驗(yàn)中，RSD＝2.25%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中，樣品溶液室溫放置24 h的峰面積RSD＝1.77%（n＝6）；重復(fù)性試驗(yàn)中，六棱菊中咖啡酸平均含量為0.455 2mg/g，RSD＝2.86%（n＝6）；加樣回收試驗(yàn)中，低、中、高加樣量（0.182 1、0.227 6、0.273 1 mg）的六棱菊中咖啡酸的平均回收率分別為98.33%、97.18%、100.07%，RSD分別為1.85%、2.07%、1.31%（n＝3），均符合相關(guān)要求。2.2.5樣品含量測(cè)定分別稱取10批不同產(chǎn)地的六棱菊藥材粉末（過(guò)2號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算咖啡酸的含量，結(jié)果見表5。

表5 廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊樣品中咖啡酸含量測(cè)定結(jié)果Tab 5Content determination results of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas in Guangxi Zhuang Autonomous Region

由表5可知，廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊藥材中均含有咖啡酸，且咖啡酸含量差異較大，其含量范圍為0.375 2～0.776 6 mg/g；其中百色市靖西縣的六棱菊藥材所含咖啡酸含量最高，明顯高于其他產(chǎn)地樣品，其次是百色市田陽(yáng)縣、桂林市荔浦縣樣品，而桂林市平樂縣樣品咖啡酸含量最低。六棱菊中的咖啡酸含量差異較大，可能是受六棱菊植物生長(zhǎng)期與生長(zhǎng)環(huán)境的共同作用，影響其生長(zhǎng)和咖啡酸成分的積累。若僅以咖啡酸成分作為六棱菊藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)，六棱菊的最佳產(chǎn)地是百色市靖西縣。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)過(guò)程中考察了甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.3%甲酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.3%甲酸、甲醇-水、乙腈-水等系統(tǒng)對(duì)樣品成分分離效果的影響，結(jié)果，乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，分離度較好，故流動(dòng)相最終確定為乙腈-0.1%磷酸溶液。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)下對(duì)供試品和對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果咖啡酸在291、320 nm波長(zhǎng)下有最大吸收?？紤]到291 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，溶劑峰大，基線漂移；而用320 nm時(shí)，溶劑峰小，基線平穩(wěn)，咖啡酸響應(yīng)值較大。故最終采用320 nm作為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法的選擇

本試驗(yàn)過(guò)程中還考察了提取溶劑（甲醇、乙醇）、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（10%、45%、95%）、提取方法（超聲和加熱回流）和提取時(shí)間（1、2、3 h）對(duì)樣品提取結(jié)果的影響。結(jié)果，10%乙醇溶液加熱回流3 h提取效果好。

綜上，本試驗(yàn)優(yōu)選工藝提取咖啡酸含量重復(fù)性較好；建立的咖啡酸含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可行。

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].75卷.北京：科學(xué)出版社，1979：48-50.

[2]周長(zhǎng)新，吳迪瑤，李湘萍，等.六棱菊屬植物研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（14）：1133-1140.

[3]魏江存，陳勇，魏中璇，等.六棱菊生藥學(xué)與質(zhì)量分析研究進(jìn)展[J].廣州化工，2017，45（2）：1-2.

[4]何紅，蔡瑞錦，龐永成.臭靈丹口服液治療急性呼吸道感染高熱95例[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2000，21（6）：38-39.

[5]朱紅濤，和立，薜鳳玉，等.臭靈丹合劑治療急性支氣管炎30例臨床觀察[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2015，24（17）：118、121.

[6]周家璇.靈丹草顆粒劑治療50例急性乳蛾的臨床觀察[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2002，23（1）：14-15.

[7]鄭秀琴，李潔，陳昆昌，等.臭靈丹合劑治療感冒臨床療效觀察[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2000，9（6）：343-345.

[8]李洪兵.臭靈丹與桑菊飲加減治療頑固性帶狀皰疹臨床觀察[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2000，9（1）：30.

[9]武艷琪，李娜，王明偉.我國(guó)六棱菊屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（3）：181-184.

[10]徐昭君.六棱菊化學(xué)成分及植物化學(xué)分類學(xué)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2005.

[11]VanPuyveldeL，BosselaersJ，StevensC，et al.Phytotoxins from the leaves of Laggera Decurrens[J].J Agric Food Chem，1999，47（5）：2116-2119.

[12]占麗琴，耿華偉，李墨嬌，等.六棱菊的化學(xué)成分[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版），2014，35（3）：325-329.

[13]蘇美英，周婷婷，周茂金.咖啡酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（16）：1220-1222.

[14]夏委.中藥有效成分提取方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè)，2016，25（9）：94-96.

[15]魏江存，陳勇，謝臻，等.瑤藥扁擔(dān)藤薄層鑒別和原兒茶酸提取工藝及含量測(cè)定研究[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2017，26（14）：30-34.

[16]魏江存，陳勇，闕祖亮，等.優(yōu)化槐米中蘆丁提取工藝的實(shí)驗(yàn)研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，38（2）：91-95、101.

Technology Optimization and Content Determination of Caffeic Acid in 10 Batches of Laggera alata from Different Areas

WEI Jiangcun1，CHEN Yong1，XIE Zhen1，LI Yaohua1，TANG Chunli2，QUE Zuliang1，YU Yanhe1，ZHANG Xin1，PANG Danqing1（1.College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530020，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530022，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of caffeic acid in Laggera alata，and establish a method for its content determination.METHODS：The caffeic acid in L.alata was extracted by reflux extraction.Using extraction content as investigation index，orthogonal test was used to investigate the effects of ethanol volume fraction，material-liquid ratio and extraction time on caffeic acid，and the extraction technology conditions were optimized.HPLC was adopted to determine the content of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas，using caffeic acid as reference substance，at wavelength of 320 nm.RESULTS：The optimized extraction technology conditions were as follows as ethanol volume fraction of 10%，material-liquid ratio of 1∶40 and extraction time of 3 h.Under the condition，verification test for caffeic acid was carried out，and the average content of caffeic acid in L.alata was 0.521 1 mg/g（RSD＝1.18%，n＝3）.The content of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas ranged in 0.375 2-0.776 6 mg/g，and the content showed great differences.CONCLUSIONS：The content of caffeic acid in L.alata is related to area and harvest season.The caffeic acid extration by optimized technology shows good reproducibility；and the established method for content determination is stable and feasible.

Laggera alata；Content determination；Caffeic acid；HPLC

R914.1

A

1001-0408（2017）34-4792-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81260673、81360524）；壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（No.桂教科研〔2013〕20號(hào)）；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No.桂科基字〔2014〕32號(hào)）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（No.YJS201625）；廣西重點(diǎn)學(xué)科壯藥學(xué)項(xiàng)目（No.桂教科研〔2013〕16號(hào)）；廣西八桂學(xué)者中藥創(chuàng)新理論與藥效研究項(xiàng)目（No.J13162）；廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No.桂教科研〔2014〕6號(hào)）

＊碩士研究生。研究方向：藥物質(zhì)量控制。電話：0771-3137585。E-mail：WJC2553@163.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥及其制劑質(zhì)量分析。電話：0771-3137585。E-mail：cy6381@163.com

2017-01-24

2017-09-29）

（編輯：余慶華）