劉航瑋，張強(qiáng)，耿亭，董昆，安興奎，王琪，張永軍，郭予元

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兩種方法測定綠盲蝽氣味結(jié)合蛋白AlucOBP21配體結(jié)合特性的結(jié)果比較

劉航瑋1，張強(qiáng)1，耿亭2，董昆1，安興奎1，王琪1，張永軍1，郭予元1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地，河北廊坊 065000）

比較熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)（fluorescence competitive binding assay）和微量熱涌動（microscale thermophoresis，MST）技術(shù)在研究綠盲蝽（）氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs） AlucOBP21配體結(jié)合特性上的差異，探索一種新的測定昆蟲OBPs結(jié)合功能的方法。提取綠盲蝽雌、雄成蟲觸角總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得綠盲蝽成蟲觸角cDNA。采用特異性克隆引物，以綠盲蝽成蟲觸角cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建pET32a/AlucOBP21重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)，獲得含表達(dá)標(biāo)簽的重組AlucOBP21蛋白。通過高親和Ni-NTA純化介質(zhì)對重組粗蛋白進(jìn)行純化，采用重組腸激酶切掉His-tag標(biāo)簽，最終獲得無表達(dá)標(biāo)簽的重組AlucOBP21蛋白。利用熒光競爭結(jié)合試驗(yàn),以1-N-phenylnaphthylamine（1-NPN）為熒光探針研究重組AlucOBP21蛋白與候選配體的結(jié)合特性，其中1-NPN和氣味標(biāo)樣均溶解在質(zhì)譜純級的甲醇中。同時，利用MST技術(shù)解析重組AlucOBP21蛋白與候選配體的結(jié)合特性，候選配體標(biāo)樣溶解在二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液中。候選配體化合物包括8種潛在的盲蝽性信息素及性信息素類似物、12種植物綠葉揮發(fā)物和綠盲蝽驅(qū)避劑主要組分二甲基二硫醚等。重組AlucOBP21蛋白在上清液和包涵體均能夠表達(dá)，最終選擇上清組分進(jìn)行目標(biāo)蛋白純化，利用重組腸激酶在22℃切除His-tag標(biāo)簽得到無標(biāo)簽的重組AlucOBP21蛋白。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組AlucOBP21與熒光探針1-NPN的解離常數(shù)為（6.88±0.31）μmol·L-1，AlucOBP21能夠與-紫羅蘭酮和-石竹烯結(jié)合，解離常數(shù)分別為（13.74±1.93）和（13.24±2.12）μmol·L-1，而其他候選配體均不能與重組AlucOBP21有效結(jié)合。MST測試結(jié)果顯示，AlucOBP21可以與-石竹烯、-紫羅蘭酮、-蒎烯和檸檬烯有效結(jié)合，解離常數(shù)分別為（0.20±0.02）、（0.05±0.01）、（0.70±0.04）和（0.40±0.06）μmol·L-1。其余候選配體化合物與AlucOBP21的熱涌動不能隨配體濃度變化而表現(xiàn)有規(guī)律的變化，故這些氣味化合物不能與AlucOBP21發(fā)生結(jié)合作用。MST檢測與熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)相比，MST所得配體結(jié)合譜更廣，不會遺漏一些結(jié)合力較弱的氣味配體。

綠盲蝽；氣味結(jié)合蛋白；AlucOBP21；競爭結(jié)合試驗(yàn)；微量熱涌動測定

0 引言

【研究意義】綠盲蝽（）嗅覺系統(tǒng)在其尋找寄主、交配及趨向行為中發(fā)揮重要作用，深入研究其嗅覺系統(tǒng)對設(shè)計(jì)綠盲蝽選擇行為調(diào)控劑具有重要指導(dǎo)意義。昆蟲氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）是一類小分子水溶性蛋白（120—150個氨基酸，大小約為14 kD），在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。通常，昆蟲觸角中的OBPs與特異性氣味物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物后穿過淋巴液將氣味物質(zhì)運(yùn)輸?shù)綒馕妒荏w（odorant receptors，ORs），最終激活嗅覺受體神經(jīng)元，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒁l(fā)后續(xù)的嗅覺行為反應(yīng)[1-3]。研究綠盲蝽OBPs的氣味配體結(jié)合特性對深入解析綠盲蝽嗅覺系統(tǒng)具有重要意義，可以為設(shè)計(jì)綠盲蝽嗅覺行為調(diào)控劑提供新思路。【前人研究進(jìn)展】當(dāng)前體外研究昆蟲重組OBPs配體結(jié)合特征的主要方法是熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)（fluorescence competitive binding assay）[4]，最近微量熱涌動（microscale thermophoresis，MST）檢測技術(shù)被成功應(yīng)用于分析小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合[5-7]，該技術(shù)在DNA與蛋白質(zhì)互作以及昆蟲嗅覺受體功能研究等方面被廣泛應(yīng)用[7-8]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，氣味結(jié)合蛋白AlucOBP21主要在綠盲蝽觸角中高表達(dá)，推測其在綠盲蝽嗅覺行為中發(fā)揮重要作用[9]。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)是當(dāng)前普遍采用的研究OBPs配體結(jié)合特性的方法，其原理是利用熒光探針具有發(fā)射熒光的特性，熒光探針與OBPs混合后熒光值會顯著增強(qiáng)，加入氣味分子后氣味分子將和熒光探針競爭結(jié)合OBPs，氣味分子和OBPs的結(jié)合能力越強(qiáng)，則OBPs/熒光探針復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值下降的越大，以此計(jì)算氣味分子和OBPs的解離常數(shù)Ki。這種方法簡單高效，安全系數(shù)高，在研究OBPs功能方面得到了廣泛的應(yīng)用[4,10-12]。但熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)屬于間接測定OBPs與氣味分子的結(jié)合能力，要求蛋白質(zhì)必須與熒光探針結(jié)合且狀態(tài)穩(wěn)定，二者結(jié)合后不會影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、空間構(gòu)象及動力學(xué)等特性。蛋白質(zhì)與配體分子的結(jié)合作用會引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的改變，如分子大小、電荷及溶劑化層，相應(yīng)地結(jié)合前后它在微小溫度梯度下的運(yùn)動也會有發(fā)生變化，而MST檢測可以量化蛋白質(zhì)分子在微小溫度梯度下的熱運(yùn)動差異，進(jìn)而分析體系內(nèi)的蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合現(xiàn)象。MST檢測只需在很小的體系內(nèi)完成，體系可設(shè)置為類似于細(xì)胞提取物或淋巴液，使之更接近生物體內(nèi)的原始條件，且不受分子量大小和分子理化性質(zhì)的影響，理論上其結(jié)果可信度更高[5-7,13]。MST技術(shù)可用于分析蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合特性，OBPs與配體的結(jié)合研究正好也符合該技術(shù)應(yīng)用范圍?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】比較熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)與MST檢測兩種方法研究綠盲蝽氣味結(jié)合蛋白AlucOBP21結(jié)合特性的差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】重組表達(dá)綠盲蝽氣味結(jié)合蛋白AlucOBP21，開展熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)與MST檢測兩種方法測定AlucOBP21結(jié)合特性的結(jié)果比較，探索一種新的高效篩選昆蟲OBPs配體化合物的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

綠盲蝽成蟲于2016年采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地紫花苜蓿地，將綠盲蝽置于塑料保鮮盒（25 cm×12 cm×8 cm）并用新鮮的四季豆飼養(yǎng)，保鮮盒內(nèi)要放一些彎曲的紙條。養(yǎng)蟲室溫度26℃，相對濕度65%，光周期16L﹕8D。

1.2 AlucOBP21重組表達(dá)及純化

綠盲蝽氣味結(jié)合蛋白AlucOBP21基因全長序列（GenBank登錄號：KT281929）由筆者實(shí)驗(yàn)室前期通過綠盲蝽觸角轉(zhuǎn)錄組測序獲得。收集4日齡綠盲蝽雌、雄成蟲觸角，并置于-80℃保存。觸角樣品經(jīng)液氮研磨后采用Trizol（Invitrogen，USA）提取總RNA，按照操作說明書利用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，USA）合成第一鏈cDNA。采用特異性克隆引物（表1），以綠盲蝽成蟲觸角cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。克隆片段經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化及測序驗(yàn)證，最終獲得正確的目標(biāo)基因序列。設(shè)計(jì)含有Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的表達(dá)引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。按操作說明書對目的片段進(jìn)行雙酶切，并通過T4連接酶將目的片段連接至pET-30a（+）表達(dá)載體，獲得pET32a/AlucOBP21重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（北京天根）中，并在含有0.1 mg·mL-1氨芐的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待OD600達(dá)到0.6—0.8時加入IPTG至終濃度為1.0 mmol·L-1，隨后20℃，150 r/min培養(yǎng)8 h。菌液經(jīng)超聲破碎和和高速離心后，分別取上清和沉淀部分通過12% SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白主要表達(dá)在上清中。隨后，利用高親和Ni-NTA純化介質(zhì)對蛋白進(jìn)行純化。按照操作說明采用重組腸激酶Recombinant entherokinase切掉His-tag，獲得不含標(biāo)簽的AlucOBP21蛋白并溶于pH 7.4的50 mmol·L-1Tris-HCl備用。

表1 試驗(yàn)中所用引物

引物序列中小寫字母為添加的酶切位點(diǎn)，Ⅰ位點(diǎn) “ccatgg” ，Ⅰ位點(diǎn)ctcgag，“-”代表ORF前，“+”代表ORF后

the lowercases in primer sequences were the restriction enzyme sites, “ccatgg” wasⅠsite , “ctcgag” wasⅠsite, ”-” represented the area before ORF, ”+” represented the area behind ORF

1.3 熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)

采用熒光分光光度計(jì)（中國天津港東科技發(fā)展股份有限公司，F(xiàn)-380）進(jìn)行配體熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)，試驗(yàn)地點(diǎn)為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，測試時間為2016年8—12月。將熒光探針1-N- phenylnaphthylamine（1-NPN）溶于甲醇（質(zhì)譜純級）至終濃度為1.0 mmol·L-1。設(shè)激發(fā)波長為337 nm，掃描的發(fā)射波長范圍為370—500 nm。向熒光比色皿中加入AlucOBP21和pH 7.4 Tris-HCl緩沖液使總體積為2.0 ml，蛋白終濃度為2 μmol·L-1。隨后依次向比色皿中加8 μl 1-NPN，使1-NPN終濃度由2 μmol·L-1遞增至30 μmol·L-1，穩(wěn)定后分別記錄熒光最大值，采用Scatchard方程計(jì)算AlucOBP21/1-NPN的解離常數(shù)。

檢測8種盲蝽科性信息素及其類似物、12種植物揮發(fā)物及1種綠盲蝽驅(qū)避劑組分與重組AlucOBP21的結(jié)合能力。4-氧代-反-2-己烯醛由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所新農(nóng)藥創(chuàng)制研究組合成并提供，純度＞90%。其余氣味標(biāo)樣購自Sigma公司或東京化成工業(yè)株式會社，純度均＞95%（表2）。氣味分子標(biāo)樣以1.0 mmol·L-1濃度溶于甲醇。向濃度均為2 μmol·L-1的AlucOBP21和1-NPN的混合液中逐次加入氣味標(biāo)樣，使標(biāo)樣的濃度從2 μmol·L-1逐步升至30 μmol·L-1，并記錄每次加入氣味標(biāo)樣后體系熒光強(qiáng)度的變化。若在此操作過程中混合液的熒光強(qiáng)度降為初始熒光強(qiáng)度的一半，則認(rèn)為該氣味分子能夠與AlucOBP21結(jié)合。通過計(jì)算解離常數(shù)Ki值來明確AlucOBP21與氣味分子的結(jié)合力，計(jì)算公式：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，其中[IC50]表示熒光強(qiáng)度下降到最強(qiáng)熒光強(qiáng)度50%時體系中氣味分子的物質(zhì)的量濃度，[1-NPN]為體系中未結(jié)合的1-NPN的物質(zhì)的量濃度，K1-NPN為AlucOBP21/ 1-NPN復(fù)合物的解離常數(shù)[28-29]。

表2 試驗(yàn)中所用氣味化合物

1.4 MST測定

MST測定地點(diǎn)為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，測試時間為2016年8—12月。將重組AlucOBP21蛋白濃度稀釋到約10 μmol·L-1，用脫鹽柱將蛋白質(zhì)溶液體系置換成MST測定要求的標(biāo)記緩沖液。取6 μL溶解在DMSO中Monolith NT.115TMProtein Labeling Kit染料、94 μL標(biāo)記緩沖液與100 μL蛋白質(zhì)混勻，混合液常溫下避光保存30 min，再用分離柱將熒光標(biāo)記好的蛋白和剩余的熒光染料分離，得到純凈的帶有熒光標(biāo)記的蛋白后置于-20℃避光保存。候選配體標(biāo)樣（表2）溶解在DMSO中制成濃度為100 mmol·L-1的母液，再用50 mmol·L-1Tris-HCl蛋白緩沖液將母液配制成濃度為500 μmol·L-1的標(biāo)樣于4℃保存待用。MST檢測儀器為Monolith NT. Label Free型（Nano temper，德國），參數(shù)設(shè)定：Led power 60，MST power 40，F(xiàn)luo before 5，MST on (s) 30 s，F(xiàn)lou after (s) 5，Delay 25。測試前將熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)冰上解凍，12 000 r/min，4℃離心后取上清。將配制好的候選配體標(biāo)樣用50 mmol·L-1的Tris-HCl蛋白緩沖液按1﹕2比例稀釋成16個梯度，每個梯度體積為10 μL。取10 μL帶有熒光標(biāo)記的蛋白和各梯度標(biāo)樣在PCR管中混勻，冰上靜置5 min使配體分子和蛋白充分混合，用MST-NT-Label-FreeTM毛細(xì)吸管吸取混合液在MST（Monolith NT.115，NanoTemper）設(shè)備上進(jìn)行檢測。MST測試中若配體與目標(biāo)蛋白發(fā)生有效結(jié)合，其熱涌動會隨配體濃度升高發(fā)生有規(guī)律的變化；若熱涌動不隨配體濃度升高發(fā)生有規(guī)律的變化，說明該配體與目標(biāo)蛋白不結(jié)合。MST測試數(shù)據(jù)用NT-analysis軟件進(jìn)行分析，按照分析軟件說明，依據(jù)質(zhì)量作用定律進(jìn)行Kd擬合。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)AlucOBP21蛋白

重組AlucOBP21蛋白在上清和包涵體都能夠表達(dá)。最終選擇上清組分來純化目標(biāo)蛋白，利用重組腸激酶在22℃切除His-tag得到無標(biāo)簽的重組AlucOBP21蛋白。在線軟件（http://www.bio-soft.net/ sms/prot_mw.html）預(yù)測重組AlucOBP21分子量為14.5 kD，通過12% SDS-PAGE電泳結(jié)果可看出，目的蛋白條帶大小與預(yù)測分子量大小一致（圖1）。

2.2 熒光競爭結(jié)合檢測重組AlucOBP21與配體的結(jié)合特征

AlucOBP21重組蛋白與熒光探針1-NPN解離常數(shù)為（6.88±0.31）μmol·L-1（圖2）。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組AlucOBP21能夠與-紫羅蘭酮和-石竹烯結(jié)合，解離常數(shù)分別為（13.74±1.93）和（13.24±2.12）μmol·L-1（圖3）。重組AlucOBP21不能與盲蝽類性信息素類似物或驅(qū)避劑組分有效結(jié)合（解離常數(shù)均＞50 μmol·L-1，未列出）。

M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量 Protein molecular weight marker；A：pET32/ AlucOBP21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株未加IPTG誘導(dǎo)pET/AlucOBP21 without IPTG induction；B：pET32/AlucOBP21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株加入IPTG誘導(dǎo)pET/AlucOBP21 with IPTG induction；C：菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)超聲破碎后上清 The supernatant of pET32/AlucOBP21 after ultrasonication；D：菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)超聲破碎后包涵體 The inclusion bodies of pET32/AlucOBP21 after ultrasonication；E：腸激酶切除His-tag后純化后AlucOBP21蛋白 The AlucOBP21 protein without his-tag purified by HisTrap column

圖2 1-NPN和AlucOBP21的結(jié)合曲線

2.3 MST檢測AlucOBP21與配體的結(jié)合特征

MST檢測顯示（圖4），熱涌動隨配體-石竹烯、-紫羅蘭酮、-蒎烯和檸檬烯濃度變化而發(fā)生有規(guī)律的變化，說明重組AlucOBP21能夠與這4種氣味化合物有效結(jié)合，解離常數(shù)分別為（0.20±0.02）、（0.05± 0.01）、（0.70±0.04）和（0.40±0.06）μmol·L-1。包括芳樟醇等其余配體化合物與AlucOBP21的熱涌動隨配體濃度變化而表現(xiàn)無規(guī)律的變化，所以這些氣味化合物不能與AlucOBP21發(fā)生結(jié)合作用。MST檢測中有效結(jié)合的4個配體化合物包括熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)的-石竹烯和-紫羅蘭酮，雖然解離常數(shù)差異很大，但主要趨勢一致。

圖3 兩種氣味化合物與AlucOBP21競爭結(jié)合曲線

3 討論

本文采用兩種技術(shù)手段檢測綠盲蝽重組AlucOBP21與候選配體化合物的結(jié)合特征。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組AlucOBP21能夠與植物揮發(fā)物-石竹烯和-紫羅蘭酮有效結(jié)合。MST檢測顯示，AlucOBP21除了能與-石竹烯和-紫羅蘭酮有效結(jié)合外，還可與-蒎烯及檸檬烯結(jié)合。兩種檢測方法都發(fā)現(xiàn)AlucOBP21的氣味結(jié)合范圍相對較窄，只能夠與一些寄主植物萜烯類揮發(fā)物結(jié)合，推測該蛋白在綠盲蝽尋找、定位寄主植物的行為過程中發(fā)揮功能。

MST測定的AlucOBP21配體結(jié)合范圍比采用熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)所得結(jié)果略大，但基本趨勢是一致的。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)應(yīng)用的原理為蛋白質(zhì)和熒光探針結(jié)合前后發(fā)射光譜波長和熒光強(qiáng)度不同，試驗(yàn)要求熒光探針能與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合且不會影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[4,10-12]，這種方法是間接檢測OBPs的結(jié)合能力，氣味分子與OBPs結(jié)合需要把熒光探針競爭下來，若存在探針與蛋白質(zhì)結(jié)合能力很強(qiáng)而氣味分子與OBPs結(jié)合能力較弱時就可能出現(xiàn)假陰性。MST檢測在一定程度上提高了配體結(jié)合的檢測靈敏度，能夠直接測定OBPs與氣味分子的結(jié)合作用，試驗(yàn)體系更接近蛋白質(zhì)與氣味分子結(jié)合的原始環(huán)境，結(jié)果可能更符合預(yù)期[5-8]。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AlucOBP21能與兩種氣味配體-石竹烯和-紫羅蘭酮結(jié)合，而MST檢測中AlucOBP21同樣能結(jié)合-石竹烯和-紫羅蘭酮，表明兩種方法存在一定的一致性。在MST檢測中，-蒎烯和檸檬烯的解離常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于-石竹烯和-紫羅蘭酮，表明AlucOBP21與-蒎烯和檸檬烯的結(jié)合力顯著小于-石竹烯和-紫羅蘭酮。由于熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)檢測靈敏度低于MST，導(dǎo)致這種結(jié)合力比較低的氣味配體沒有在熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)中被檢測出來。本文中MST檢測計(jì)算得到的解離常數(shù)遠(yuǎn)小于熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)對應(yīng)數(shù)值，這可能是由于MST直接檢測體系內(nèi)的分子結(jié)合，其結(jié)合能力可能更接近真實(shí)值。另外，兩種檢測技術(shù)測定原理不同，不同的儀器參數(shù)設(shè)置也會引起差異，所以計(jì)算出的Ki并不適合直接進(jìn)行數(shù)值比較。

圖4 5種氣味配體與AlucOBP21結(jié)合的MST檢測

Fig. 4 MST analysis of five odor ligands with recombinant AlucOBP21

綜上所述，熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)和MST在研究昆蟲OBPs與配體分子的結(jié)合特征方面具有一定的統(tǒng)一性，但MST測得的結(jié)合譜更廣，可以篩選出結(jié)合力較弱的配體化合物。

4 結(jié)論

熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，綠盲蝽AlucOBP21能夠與-紫羅蘭酮和-石竹烯結(jié)合，解離常數(shù)分別為（13.74±1.93）和（13.24±2.12）μmol·L-1。微量熱涌動（MST）檢測表明，AlucOBP21可與-石竹烯、-紫羅蘭酮、-蒎烯、檸檬烯等結(jié)合，解離常數(shù)分別為（0.20±0.02）、（0.05±0.01）、（0.70±0.04）和（0.40±0.06）μmol·L-1。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)和MST在研究昆蟲OBPs與配體分子的結(jié)合特征方面具有一定的統(tǒng)一性，但MST測得的結(jié)合譜更廣，可以篩選出結(jié)合力較弱的配體化合物。

[1] Kaissling K E, Keil T A, Williams J L D. Pheromone stimulation in perfused sensory hairs of the moth., 1991, 37(1): 71-75, 77-78.

[2] Pelosi P, Zhou J J, Ban L P, Calvello M. Soluble proteins in insect chemical communication., 2006, 63(14): 1658-1676.

[3] Kaissling K E. Kinetics of olfactory responses might largely depend on the odorant-receptor interaction and the odorant deactivation postulated for flux detectors., 2013, 199(11): 879-896.

[4] Ban L, Scaloni A, D'Ambrosio C, Zhang L, Yahn Y, Pelosi P. Biochemical characterization and bacterial expression of an odorant-binding protein from., 2003, 60(2): 390-400.

[5] Jerabek-Willemsen M, Wienken C J, Braun D, Baaske P, Duhr S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis., 2011, 9(4): 342-353.

[6] Wienken C J, Baaske P, Rothbauer U, Braun D, Duhr S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.s, 2010, 1(7): 100.

[7] Zillner K, Jerabek-Willemsen M, Duhr S, Braun D, L?ngst G, Baaske P. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution., 2012, 815: 241-252.

[8] Tegler L T, Corin K, Hillger J, Wassie B, YU Y M, ZHANG S G. Cell-free expression, purification, and ligand-binding analysis ofolfactory receptors DmOR67a, DmOR85b and DmORCO., 2015, 5: Article number 7867.

[9] Yuan H B, Ding Y X, Gu S H, Sun L, Zhu X Q, Liu H W, Khalid H D, Zhang Y J, Guo Y Y. Molecular characterization and expression profiling of odorant-binding proteins in., 2015, 10(10): e0140562.

[10] Zhou J J, Robertson G, He X L, Dufour S, Hooper A M, Pickett J A, Keep N H, Field L M. Characterisation ofodorant-binding proteins reveals that a general odorant-binding protein discriminates between sex pheromone components., 2009, 389(3): 529-545.

[11] Gu S H, Zhou J J, Wang G R, Zhang Y J, Guo Y Y. Sex pheromone recognition and immunolocalization of three pheromone binding proteins in the black cutworm moth, 2013, 43(3): 237-251.

[12] He X L, Tzotzos G, Woodcock C, Pickett J A, Hooper T, Field L M, Zhou J J. Binding of the general odorant binding protein of, BmorGOBP2 to the moth sex pheromone components., 2010, 36(12): 1293-1305.

[13] Duhr S, Braun D. Why molecules move along a temperature gradient., 2006, 103(52): 19678-19682.

[14] 蘇建偉, 陳展冊, 張廣珠, 戈峰. 綠盲蝽雌蟲的浸提物分析. 昆蟲知識, 2010, 47(6): 1113-1117.

Su J W, Chen Z C, Zhang G Z, Ge F. Identification of extracted compounds of female., 2010, 47(6): 1113-1117. (in Chinese)

[15] Yang C Y, Kim J, Ahn S J, Kim D H, Cho M R. Identification of the female-produced sex pheromone of the plant bug., 2014, 40: 244-249.

[16] 陳展冊, 蘇麗, 戈峰, 蘇建偉. 綠盲蝽對性信息素類似物和植物揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng). 昆蟲學(xué)報, 2010, 53(1): 47-54.

Chen Z C, Su L, Ge F, Su J W. Electroantennogram responses of the green bug(Hemiptera: Miridae), to sex pheromone analogs and plant volatiles., 2010, 53(1): 47-54. (in Chinese)

[17] Aldrich J R. Chemical ecology of the Heteroptera., 1998, 33: 211-238.

[18] 張濤. 綠盲蝽性信息素的提取和鑒定[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.

Zhang T. The study of the extraction, identification and application of sex pheromone produced by[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese)

[19] 潘洪生. 綠盲蝽與秋季蒿類寄主的化學(xué)通訊機(jī)制[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013.

Pan H S. Chemical communication mechanism between(Meyer-Dür) and its fall host plants ofspp.[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013. (in Chinese)

[20] Loughrin J H,Manukian A,Heath RR,Tumlinson J H. Volatiles emitted by different cotton varieties damaged by feeding beet armyworm larvae., 1995, 21(8): 1217-1227.

[21] McCall P J,Turlings T C,Loughrin J,Proveaux A T,Tumlinson J H. Herbivore-induced volatile emissions from cotton (L.)seedlings., 1994, 20(12): 3039-3050.

[22] BlackmerJ L, Rodriguez-Saona C, ByersJ A, ShopeK L, SmithJ P. Behavioral response ofto conspecifics and headspace volatiles of alfalfa in a Y-tubeolfactometer., 2004, 30(8): 1547-1564.

[23] Chinta S, Dickens J C, Aldrich J R. Olfactory reception of potential pheromones and plant odors by tarnished plant bug,(Hemiptera: Miridae)., 1994, 20(12): 3251-3267.

[24] Obata T, Koh H S, Kim M, Fukami H. Constituents of planthopper attractant in rice plant., 1983, 18: 161-169.

[25] Williams L, Blackmer J L, Rodriguez-Saona C, Zhu S. Plant volatiles influence electrophysiological and behavioral responses of, 2010, 36(5): 467-478.

[26] Loughrin J H, Manukian A, Heath R R, Turlings T C, Tumlinson J H. Diurnal cycle of emission of induced volatile terpenoids by herbivore-injured cotton plant., 1994, 91(25): 11836-11840.

[27] Pan H S, Lu Y H, Wyckhuys K A, Wu K M. Preference of a polyphagous mirid bug,(Meyer-Dur) for flowering host plants., 2013, 8(7): e68980.

[28] Qiao H L, Tuccoria E, He X L, Gazzanoc A, Fieldb L, Zhou J J, Pelosia P. Discrimination of alarm pheromone ()-- farnesene by aphid odorant-binding proteins., 2009, 39: 414-419.

[29] Gu S H, Wang W X, Wang G R, Zhang X Y, Guo Y Y, Zhang Z D, Zhou J J, Zhang Y J. Functional characterization and immunolocalization of odorant binding protein 1 in the lucerne plant bug,(Goeze)., 2011, 77(2): 81-99.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Comparison of Two Methods in Analysis of Binding Characteristics of Odorant Binding Proteins AlucOBP21 of

LIU HangWei1, ZHANG Qiang1, Geng Ting2, DONG Kun1, AN XingKui1, WANG Qi1, ZHANG YongJun1, GUO YuYuan1

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy ofAgricultural Sciences, Beijing100193;2Langfang Scientific Research Trial Station, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Langfang 065000, Hebei)

The objective of this study is to compare two methods of fluorescence competitive binding assay and microscale thermophoresis (MST) in analysis of binding characteristics of odorant binding proteins Alucobp21 of, and to explore a new method for determination of binding function of insect obps.Total RNA was extracted from antennae of both female and maleadults by using Trizol reagent. The cDNAs were synthesized using the Superscript III Reverse Transcriptase system.AlucOBP21 was PCR-amplified using gene-specific primers. The sample cDNA of the antennae was used as the template. The PCR product was cloned into an expression vector PET-32a (+) for expression in prokaryotic BL21 (DE3) cells. The transformation of the strain with pET32a/AlucOBP21 was incubated in cultures and the crude protein with His-tag was obtained. The supernatant was obtained by sonication, purified by Ni ion affinity chromatography. Soon after the His-tag was removed with recombinant enterokinase, then the purified AlucOBP21 without His-tag was harvested. To investigate the binding abilities of AlucOBP21 to candidate ligand chemicals, fluorescence binding test was performed using 1-N-phenylnaphthylamine (1-NPN) as a fluorescence probe. 1-NPN and odor standard samples were dissolved in methanol (mass spectrometry grade). And also, the binding characteristics of recombinant AlucOBP21 to candidate ligands were explored by MST technique. In this assay, the candidate ligand samples were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) solution. Candidate ligands included 8 potential sex pheromones and sex pheromone analogues of mirids, 12 green leaf volatiles and a repellent (dimethyl disulfide) of.Recombinant AlucOBP21 was expressed in both supernatant and inclusion bodies. Finally, the supernatant fraction was selected to purify the target protein. Recombinant AlucOBP21 without His-tag was obtained by using recombinant entherokinase at 22℃. In fluorescence competitive binding assays, recombinant AlucOBP21 could bind with 1-NPN probe, dissociation constant was (6.88±0.31) μmol·L-1. AlucOBP21 could bind with-ionone and-caryophyllene, and the dissociation constants were (13.74±1.93) and (13.24±2.12) μmol·L-1, respectively. However, remaining candidate ligands could not effectively bind to recombinant AlucOBP21. Analysis of MST demonstrated that AlucOBP21 could bind with-ionone,-caryophyllene,-pinene and limonene, and the dissociation constants were (0.20±0.02), (0.05±0.01), (0.70±0.04) and (0.40±0.06) μmol·L-1, respectively. The thermophoresis of remaining candidate ligands with AlucOBP21 could not display regular change along with the change of ligand concentration.Therefore, these odorant chemicals could not bind with recombinant AlucOBP21.In comparison with fluorescence competitive binding assay, MST detection demonstrated a broader ligand spectrum which could not miss odorant ligands with weak binding affinities.

; odorant binding protein; AlucOBP21; competitive binding assay; microscale thermophoresis (MST)

2017-05-10；

2017-06-23

國家自然科學(xué)基金（31471778，31672038，31621064，31772176）

聯(lián)系方式：劉航瑋，Tel：18201043601；E-mail：liuhangwei2014@163.com。通信作者張永軍，E-mail：yjzhang@ippcaas.cn