苗陽陽，師尚禮，康文娟

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赤霉素對根瘤菌運移、定殖及苜蓿幼苗生長的影響

苗陽陽，師尚禮，康文娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，蘭州730070）

研究赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌運移和定殖的動態(tài)及接種對甘農(nóng)5號紫花苜蓿（L. Gannong No.5）幼苗生長的影響，為增強根瘤菌向苜蓿體內(nèi)尤其向繁殖器官轉(zhuǎn)移并定殖的能力，促進苜蓿種植業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。分別向LZgn5f（gn5f）和12531f（12531f）兩種根瘤菌液內(nèi)添加0.5、1、10和100 mg·L-1赤霉素，測定第1、3、5、7和9天兩種根瘤菌OD600吸光度值，同時將添加不同赤霉素的菌液分別澆灌于幼苗根部，于接種后第15、30、45和60天檢測根瘤菌在根和地上各組織內(nèi)運移和定殖及對苜蓿幼苗生長的情況。添加10 mg·L-1赤霉素稍可促進12531f生長，但效果并不明顯；而1 mg·L-1赤霉素對gn5f生長初期效果較好，但隨著時間的延長則無明顯作用。10 mg·L-1赤霉素促進12531f運移并定殖到下部莖、上部莖和上部葉內(nèi)，1 mg·L-1赤霉素促進gn5f運移并定殖到下部莖和下部葉內(nèi)，以無菌水為對照的各組織內(nèi)未檢測到兩種熒光標(biāo)記根瘤菌。單獨接種12531f和gn5f，均促進了葉綠素的形成，而添加赤霉素后接種均抑制了葉綠素的形成，但12531f添加10 mg·L-1赤霉素、gn5f添加1 mg·L-1赤霉素接種可使幼苗單株結(jié)瘤數(shù)、單株根瘤重、單株葉片數(shù)、株高、根長、地上干重和根干重則均達最高。其中12531f添加10 mg·L-1赤霉素接種后苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理75.71%和11.82%，但差異不顯著（＞0.05）；單株根瘤重分別高出對照和單獨接菌處理1 136.11%和55.05%，差異顯著（＜0.05）；單株葉片數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理113.94%和78.28%，差異顯著（＜0.05）；株高分別高出對照和單獨接菌處理83.33%和50.24%，差異顯著（＜0.05）；根長分別高出對照和單獨接菌處理115.28%和29.17%，差異顯著（＜0.05）；地上干重分別高出對照和單獨接菌處理214.27%和206.43%，差異顯著（＜0.05）；根干重分別高出對照和單獨接菌處理1 156.19%和1 049.53%，差異顯著（＜0.05）。gn5f添加1 mg·L-1赤霉素接種后苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理82.86%和4.07%，但差異不顯著（＞0.05）；單株根瘤重分別高出對照和單獨接菌處理697.22%和105.00%，差異顯著（＜0.05）；單株葉片數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理32.12%和19.13%，株高分別高出對照和單獨接菌處理95.24%和37.82%，根長分別高出對照和單獨接菌處理76.39%和5.83%，但各處理間均無顯著差異（＞0.05）；地上干重分別高出對照和單獨接菌處理125.98%和121.80%，差異顯著（＜0.05）；根干重分別高出對照和單獨接菌處理864.43%和762.21%，差異顯著（＜0.05）。分別添加10 mg·L-1和1 mg·L-1赤霉素后利于12531f和gn5f在苜蓿體內(nèi)的運移和定殖并對結(jié)瘤、葉片生長、株高、根長、生物量均有促進作用，表明適宜赤霉素濃度可作為促進目標(biāo)根瘤菌運移和定殖的方法，進而促進植株生長。

紫花苜蓿；赤霉素；熒光標(biāo)記；根瘤菌；運移；定殖；生長特性

0 引言

【研究意義】根瘤菌可與豆科植物共生結(jié)瘤將大氣中分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為植物可以利用的氨態(tài)氮，還能以內(nèi)生菌的形式與植物共生形成特殊的微環(huán)境，從而增強豆科植物的抗性、培肥地力、增加植物產(chǎn)量并改善品質(zhì)[1-2]。土壤中75%以上的土著根瘤菌是低效或無效菌株，常能使豆科植物結(jié)瘤但不能進行高效固氮[3]，因此，采用人工接種高效根瘤菌是十分重要的一項措施。然而，植物種類與根瘤菌種類及外在特殊的自然環(huán)境、土壤狀況、與土著根瘤菌的競爭等均可影響接種目標(biāo)根瘤菌存活率及繁殖能力，使得根瘤菌接種效率低，進而影響與豆科植物共生固氮，難以達到應(yīng)有的增產(chǎn)效果[4-5]。因此如何提高根瘤菌接種效果對豆科植物生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，大量微生物可定殖于植物根際，有些還可以內(nèi)生菌的形式定殖于宿主體內(nèi)，且可由根部向上運移至莖葉或繁殖器官內(nèi)并進行大量繁殖[6-10]。然而有關(guān)內(nèi)生根瘤菌在紫花苜蓿體內(nèi)運移和定殖的動態(tài)變化及對營養(yǎng)和繁殖器官內(nèi)微生物群落影響的研究較少。陳丹明等[11]首次發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿種子內(nèi)攜帶有根瘤菌。李劍峰等[6-7]發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿內(nèi)生根瘤菌主要存在于毛根和與種子形成的有關(guān)部位。而與土著根瘤菌相比，內(nèi)生根瘤菌在競爭結(jié)瘤方面有明顯優(yōu)勢，因此對內(nèi)生根瘤菌的研究具有較強的理論與實踐意義。種子及植株體內(nèi)根瘤菌的分布和數(shù)量并不是恒定的，會受土壤狀況、種子儲藏、植物及菌株遺傳特性等因素影響[12-14]。尋找利于提高苜蓿植株體內(nèi)目標(biāo)根瘤菌數(shù)量的方法具有較強的理論與實踐意義。根瘤菌侵入宿主后，在體內(nèi)運移時會遇到宿主的機械阻隔、菌體對宿主內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性和信號物質(zhì)識別過程，這些阻礙或屏障會引發(fā)植物防御反應(yīng)，進而降低根瘤菌定殖數(shù)量[6]。李劍峰等[7]發(fā)現(xiàn)添加LaCl3、生長素（IAA）、胞外多糖等外源物質(zhì)可以減弱根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運移與定殖時遇到的防御反應(yīng)，從而有提高苜蓿組織內(nèi)根瘤菌定殖數(shù)量的趨勢，但這一研究目前尚處初步階段，如何研發(fā)高效的方法來提高苜蓿植株體內(nèi)根瘤菌定殖數(shù)量的研究需要進一步深入。赤霉素可調(diào)控豌豆（）結(jié)瘤，突變株根部因失去合成赤霉素的能力而不能結(jié)瘤，加入外源赤霉素后，可正常結(jié)瘤[15]。LievenS等[16]在根瘤菌侵入前2 d加入外源赤霉素合成抑制劑時阻斷了田菁（）根瘤的形成，而加入外源赤霉素后減弱了這種阻礙作用。由此表明赤霉素與細菌侵入有關(guān)。Lievens等[16]和Dobert等[17]分別發(fā)現(xiàn)赤霉素在蕓扁豆（L.）和田菁的根瘤、細菌侵染線和前感染區(qū)中表達能力較強。由此表明赤霉素可調(diào)控細菌的侵染過程和根瘤的形成。此外，赤霉素還可促進作物種子萌發(fā)、幼苗生長、種子發(fā)育、增加產(chǎn)量和改善品質(zhì)等[18]?！颈狙芯壳腥朦c】近年來有關(guān)赤霉素的研究主要集中在促進種子萌發(fā)和作物生長方面，而關(guān)于赤霉素對根瘤菌在豆科植物體內(nèi)運移和定殖影響的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究為提高根瘤菌接種效果，促進目標(biāo)根瘤菌在苜蓿體內(nèi)大量定殖，進而為其向繁殖器官轉(zhuǎn)移并定殖，為形成攜帶的種子提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：熒光標(biāo)記根瘤菌為12531f（12531f）和LZgn5f（gn5f）。其原始菌株分別為12531（購自中國科學(xué)院微生物保藏中心—分離自非本苜蓿植株體內(nèi)的外源根瘤菌），LZgn5（分離自甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子的內(nèi)源根瘤菌，經(jīng)中國科學(xué)院微生物鑒定保藏中心測序鑒定），通過三親本雜交法導(dǎo)入青色熒光蛋白質(zhì)粒標(biāo)記構(gòu)建熒光標(biāo)記根瘤菌株待用[19]。所有菌種培養(yǎng)于TY（Yeast Tryptone Agar）[20]固體穿刺管中并4℃保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點實驗室。

供試苜蓿種子：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點實驗室提供的甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子（L.Gannong No.5），凈度為97%，發(fā)芽率為84%。

供試赤霉素：購自于蘭州博域生物科技有限責(zé)任公司的赤霉素（Gibberellin GA3），含量不少于90%。

培養(yǎng)基：利用TY培養(yǎng)基進行菌種的保存、活化、培養(yǎng)及苜蓿各組織內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量的檢測。配方為胰蛋白胨0.5 g，酵母粉0.3 g，CaCl2·6H2O 0.13 g，蒸餾水100 mL，pH：7.0，121℃高溫滅菌26 min，固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5 g·L-1。

營養(yǎng)液：Hoagland有氮營養(yǎng)液[21]和Hoagland無氮營養(yǎng)液，以1 mol·L-1的NaOH溶液或1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH為7.0±0.1。

1.2 試驗設(shè)計及方法

1.2.1 赤霉素培養(yǎng)基的制備 將赤霉素裝入無菌三角瓶，置于無菌操作臺內(nèi)紫外殺菌1 h，少量酒精溶解后無菌水稀釋并過無菌濾膜（直徑0.22 μm）3次，然后按赤霉素為0、0.5、1、10和100 mg·L-1的濃度要求加入配制好的40 mL TY液體培養(yǎng)基中。

1.2.2 熒光標(biāo)記根瘤菌菌液制備 將保存的兩種熒光標(biāo)記根瘤菌活化后接入50 mL TY液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/min振蕩至OD600為0.5—0.8，將該菌液按10%濃度加入不同赤霉素濃度的液體培養(yǎng)基內(nèi)。待上述培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600為0.5—0.8后將其轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄上清，留沉淀，加入等體積的無菌水，在渦旋振蕩器上充分打散，制成菌懸液待用。

1.2.3 苜蓿幼苗的培養(yǎng)及接種 試驗于2014年5月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進行。選取健康飽滿的甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子，置于已滅菌的50 mL三角瓶內(nèi)，碘伏（購自蘭州博域生物科技有限責(zé)任公司，有效碘含量0.45%—0.55%）浸泡3 min，無菌水清洗4次，每次1 min，無菌濾紙吸干水分待用。以上操作均在無菌操作臺內(nèi)進行。

將清洗干凈的細沙150℃高溫持續(xù)烘干5 h，121℃滅菌26 min，連續(xù)滅菌5次，冷卻后裝入75%乙醇消毒且杯底扎有網(wǎng)眼的塑料杯（直徑6.0 cm、高7.5 cm，400 g/杯），然后放入水培盒中（長31 cm，寬19 cm，高10.5 cm），每盒3杯。每杯播種40粒已消毒的種子，表面覆蓋干沙2 cm左右。每處理水培盒內(nèi)一次性加入500 mL Hoagland有氮營養(yǎng)液，使其由杯底至下而上浸濕[22]。

待苜蓿幼苗長出真葉后，每杯定苗25株，將已制好的熒光標(biāo)記根瘤菌菌懸液澆于盆栽表面，25 mL/杯。每處理6次重復(fù)，以無菌蒸餾水處理為對照。幼苗生長過程中用無菌水補充水分，接種后每15 d澆灌500 mL/盒Hoagland無氮營養(yǎng)液，至60 d幼苗收獲。按表1設(shè)置試驗處理。

表1 試驗處理

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 熒光標(biāo)記根瘤菌生長的測定 測定培養(yǎng)1、3、5、7和9 d的含不同濃度赤霉素的熒光標(biāo)記根瘤菌液體的OD600吸光度值。

1.3.2 熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運移和定殖的測定 接種后每隔15 d隨機選取幼苗，將其分離為根、下部葉、下部莖、上部葉和上部莖；分別稱取1 g，置于50 mL無菌三角瓶內(nèi)，碘伏消毒3 min，無菌水沖洗4次，每次1 min。消毒后的植物組織各面在固體培養(yǎng)基上放置30 min后取出，平板28℃條件下培養(yǎng)48 h，未長出菌落時，表明已徹底消毒[23]。將徹底消毒的植物組織分別置于無菌研缽中加入2 mL無菌蒸餾水研磨（根部研磨液依次稀釋為10、100、1 000倍，其他組織不稀釋），4 000 r/min離心3 min，吸0.2 mL均勻涂布于TY固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h。黑暗條件下用手提紫外燈觀察每皿內(nèi)發(fā)光的熒光標(biāo)記根瘤菌個數(shù)，并換算出每克樣品（鮮重）內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌的數(shù)量。

1.3.3 單株結(jié)瘤數(shù)及根瘤重的測定 幼苗生長60 d后每處理隨機取5株測定單株結(jié)瘤數(shù)及單株根瘤重。

1.3.4 形態(tài)和生物量指標(biāo)的測定 幼苗生長60 d后每處理每重復(fù)隨機選取5株計算單株復(fù)葉數(shù)、刻度尺測量株高及根長。同時每處理隨機選取10株，稱取地上和根部鮮重（濾紙吸干表面水分）和干重（烘箱中105 ℃殺青20 min，然后80℃烘干至恒重）[24]。

1.3.5 葉綠素含量的測定 幼苗生長60 d后隨機選取葉片，去除主脈和兩頭部分，剪碎，混勻，稱0.2 g左右，用99%丙酮和95%乙醇1﹕1混合液定容50 mL，重復(fù)3次。將定容好的容量瓶置于黑暗處，每天搖動1次，直至葉片完全變白，記錄吸光度值（OD645、OD663）[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理及作圖，SPSS16.0（SPSS V16.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，采用Duncan新復(fù)極差法進行各處理的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌生長的影響

不同赤霉素濃度對熒光標(biāo)記根瘤菌12531f生長的影響為先增大后減小，至7 d時達最大，第9天后逐漸減小。赤霉素對12531f的生長無明顯促進作用，雖然10 mg·L-1赤霉素對其生長的促進作用高于其他赤霉素濃度的處理，但與未添加赤霉素處理無顯著差異（＞0.05），當(dāng)濃度達100 mg·L-1時反而顯著抑制其生長（＜0.05）（圖1-A）。

赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌gn5f生長的影響為先增大后減小，至第3天時達最大，隨時間的增加，生長能力均降低。第1天至第3天，1 mg·L-1赤霉素對gn5f的生長促進作用最強，顯著高于未添加赤霉素處理（＜0.05）；第7天和第9天時僅在100 mg·L-1赤霉素濃度下顯著抑制了其生長（＜0.05），其余各處理間差異不顯著（＞0.05）（圖1-B）。

綜上，赤霉素對兩種不同來源的熒光標(biāo)記根瘤菌生長促進作用不同，其中10 mg·L-1赤霉素對12531f生長稍有促進，但無明顯作用。而1 mg·L-1赤霉素對gn5f生長初期效果較好，但隨著時間的延長則無明顯作用。

2.2 赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿根內(nèi)定殖的影響

熒光標(biāo)記根瘤菌在根內(nèi)的定殖數(shù)量呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢，赤霉素對不同熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿根內(nèi)運移和定殖的影響不同（表2）。接種15 d時，僅在添加1 mg·L-1赤霉素時根部可檢測到12531f，數(shù)量為1 801.80 cfu/g；30 d未添加赤霉素單獨接菌時，根內(nèi)12531f定殖數(shù)量最多，達8 591.00 cfu/g，顯著高于其他處理（＜0.05），添加1、10和100 mg·L-1赤霉素后，根部也可檢測到12531f，但各處理間無顯著差異（＞0.05）；45 d時，添加1和100 mg·L-1赤霉素時根內(nèi)可檢測到12531f，其余處理未檢測到12531f；60 d時各處理和對照均未檢測出12531f。

A：赤霉素對12531f生長的影響；F0、F0.5、F1、F10和F100表示12531f接種液分別添加0、0.5、1、10和100 mg·L-1赤霉素。B：赤霉素對gn5f生長的影響；G0、G0.5、G1、 G10和G100表示gn5f接種液分別添加0、0.5、1、10和100 mg·L-1赤霉素。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

表2 赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿根內(nèi)運移與定殖的影響

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Values (mean ± SE) represent the results of Duncan’s multiple range test, different letters in the same column indicate significant differences (＜0.05). the same as below

接種15 d時根內(nèi)gn5f數(shù)量較少，30 d后數(shù)量逐漸增加，45 d未添加赤霉素單獨接菌時，根內(nèi)gn5f數(shù)量最多，達7.55×104cfu/g，顯著高于其他處理（＜0.05），而添加10 mg·L-1赤霉素時gn5f含量高于添加其他赤霉素的處理，達1.90×104cfu/g；60 d時各處理和對照均未檢測出gn5f。

2.3 赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿地上組織內(nèi)運移和定殖的影響

由表3可看出，熒光標(biāo)記根瘤菌在接種初期地上組織內(nèi)的定殖數(shù)量較多，后期逐漸下降，且赤霉素對不同熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿地上組織內(nèi)運移和定殖的影響不同。添加赤霉素后促進了12531f向下部莖、上部莖和上部葉內(nèi)的運移和定殖。添加10 mg·L-1赤霉素顯著提高了其向下部莖內(nèi)的運移和定殖，接種15 d時數(shù)量最高，達54.72 cfu/g，顯著高于其他處理（＜0.05）；30 d后12531f定殖數(shù)量逐漸減少，至60 d時，僅在添加10 mg·L-1赤霉素處理下可檢測出12531f，數(shù)量僅為1.32 cfu/g。接種15 d時，單獨接種12531f時下部葉內(nèi)數(shù)量最多，達90.72 cfu/g，顯著高于其他處理（＜0.05），后期數(shù)量逐漸減少，45 d后不能檢測到該熒光標(biāo)記根瘤菌。接種15 d時同樣發(fā)現(xiàn)10 mg·L-1赤霉素促進了12531f向上部莖和上部葉內(nèi)運移并定殖，數(shù)量分別為16.72 cfu/g和95.91 cfu/g，其余處理其余時間均未檢測出12531f。對照未檢測出12531f。

添加赤霉素后促進了gn5f向下部莖和下部葉內(nèi)運移并定殖。添加1 mg·L-1赤霉素提高了gn5f在下部莖內(nèi)的定殖數(shù)量，15 d時數(shù)量最高，達52.08 cfu/g，但與該濃度處理接種45 d時無顯著差異（＞0.05）。同樣，1 mg·L-1促進了gn5f向下部葉內(nèi)的運移和定殖，15 d時數(shù)量最高，達321.40 cfu/g，顯著高于其他處理（＜0.05）。其余各處理間數(shù)量無顯著性差異（＞0.05）。gn5f較難運移并定殖于上部莖和上部葉內(nèi)，僅在添加1 mg·L-1赤霉素接種60 d時，上部莖內(nèi)檢測到少量gn5f，數(shù)量僅為5.90 cfu/g，上部葉內(nèi)未檢測到。對照未檢測出gn5f。

由此表明，赤霉素對兩種熒光標(biāo)記根瘤菌運移和定殖的影響不同。10 mg·L-1赤霉素有利于12531f向下部莖和上部莖葉內(nèi)運移和定殖，1 mg·L-1赤霉素有利于gn5f定殖于下部莖葉內(nèi)，接種30 d后不利于其在地上各組織內(nèi)定殖。因此，兩種熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿地上組織表現(xiàn)出不同的運移及定殖規(guī)律，受菌種來源及遺傳特性影響。

表3 赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿地上各組織內(nèi)運移與定殖的影響

2.4 熒光標(biāo)記根瘤菌液添加赤霉素接種對苜蓿結(jié)瘤的影響

添加適宜濃度赤霉素后的兩種熒光標(biāo)記根瘤菌接種苜蓿幼苗，可增加單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重（表4）。12531f添加10 mg·L-1赤霉素接種后苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理75.71%和11.82%，但差異不顯著（＞0.05）；單株根瘤重分別高出對照和單獨接菌處理1136.11%和55.05%，差異顯著（＜0.05）。其余過高或過低赤霉素濃度對單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重均無促進作用。

gn5f添加低濃度赤霉素接種苜蓿幼苗未提高單株結(jié)瘤數(shù)，當(dāng)赤霉素濃度為1 mg·L-1時，單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重均達最高，其中單株結(jié)瘤數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理82.86%和4.07%，但差異不顯著（＞0.05）；單株根瘤重分別高出對照和單獨接菌處理697.22%和105.00%，差異顯著（＜0.05）。高于1 mg·L-1時，單株結(jié)瘤數(shù)和單株根瘤重則逐漸降低。

結(jié)果表明只有在適宜赤霉素添加濃度下接種才可促進苜蓿根瘤的形成，且不同來源的根瘤菌要選擇不同的赤霉素濃度。

表4 熒光標(biāo)記根瘤菌接種液添加赤霉素對苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)及根瘤重的影響

2.5 熒光標(biāo)記根瘤菌液添加赤霉素接種對苜蓿幼苗生長的影響

兩種熒光標(biāo)記根瘤菌接種后均可增加苜蓿幼苗單株葉片數(shù)、株高和根長，熒光標(biāo)記根瘤菌添加適宜濃度赤霉素后接種，3個指標(biāo)均高于對照和單獨接菌處理（表5）。12531f添加赤霉素后接種，隨赤霉素濃度的升高，3個指標(biāo)均逐漸增大，添加10 mg·L-1赤霉素后均達最高，單株葉片數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理113.94%和78.28%，差異顯著（＜0.05）；株高分別高出對照和單獨接菌處理83.33%和50.24%，差異顯著（＜0.05）；根長分別高出對照和單獨接菌處理115.28%和29.17%，差異顯著（＜0.05）；然后隨赤霉素濃度的增加，單株葉片數(shù)、株高和根長則減小。gn5f添加赤霉素后接種，單株葉片數(shù)、株高和根長逐漸增加，添加1 mg·L-1后各指標(biāo)均達到最大，其中單株葉片數(shù)分別高出對照和單獨接菌處理32.12%和19.13%；株高分別高出對照和單獨接菌處理95.24%和37.82%；根長分別高出對照和單獨接菌處理76.39%和5.83%，但各處理間均無顯著差異（＞0.05）；然后隨赤霉素濃度的增加，單株葉片數(shù)、株高和根長逐漸減小。

接種兩種熒光標(biāo)記根瘤菌可提高苜蓿幼苗的生物量，添加適宜赤霉素后生物量高于未添加赤霉素的單獨接菌處理和對照（表6）。12531f添加赤霉素后接種，隨赤霉素濃度的升高，生物量逐漸增加，到10 mg·L-1后地上和根干重均達最高；其中，地上干重分別高出對照和單獨接菌處理214.27%和206.43%，差異顯著（＜0.05）；根干重分別高出對照和單獨接菌處理1156.19%和1049.53%，差異顯著（＜0.05）；然后隨赤霉素濃度的逐漸增加，生物量逐漸降低，但均高于對照和單獨接菌處理。gn5f添加赤霉素后接種，隨赤霉素濃度的升高，苜蓿生物量逐漸增加，濃度達1 mg·L-1時，地上和根干重均達最高；其中，地上干重分別高出對照和單獨接菌處理125.98%和121.80%，差異顯著（＜0.05）；根干重分別高出對照和單獨接菌處理864.43%和762.21%，差異顯著（＜0.05）；然后隨赤霉素濃度的逐漸增加，生物量逐漸降低，但均高于對照和單獨接菌處理。

表5 熒光標(biāo)記根瘤菌接種液添加赤霉素對苜蓿單株葉片數(shù)、株高和根長的影響

表6 熒光標(biāo)記根瘤菌接種液添加赤霉素對苜蓿生物量的影響

2.6 熒光標(biāo)記根瘤菌液添加赤霉素接種對苜蓿葉綠素含量的影響

不同濃度赤霉素與兩種熒光標(biāo)記根瘤菌混合接種對苜蓿葉片葉綠素含量影響不同（圖2）。單獨接種12531f時葉片葉綠素（a+b）含量高于對照1.05%，但差異不顯著（＞0.05）；添加赤霉素后抑制了葉綠素的形成，含量低于對照和單獨接菌處理（圖2-A）。而單獨接種gn5f時葉綠素含量高出對照29.02%，差異顯著（＜0.05），添加赤霉素后其含量低于單獨接菌處理；當(dāng)添加100 mg·L-1赤霉素后其含量最低，低于對照和單獨接菌處理23.78%和40.92%，差異顯著（＜0.05）（圖2-B）。

A：12531f添加赤霉素接種；B：gn5f添加赤霉素接種 A: Gibberellin added into inoculant of 12531f; B: Gibberellin added into inoculant of gn5f

3 討論

3.1 赤霉素對熒光標(biāo)記根瘤菌生長及其在苜蓿幼苗體內(nèi)運移和定殖的影響

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，赤霉素具有增大葉面積、促進種子發(fā)芽、刺激作物生長、增加作物產(chǎn)量、減少器官脫落等重要作用[26-28]。但關(guān)于赤霉素對根瘤菌生長的研究較少。陳文浩[29]研究發(fā)現(xiàn)添加 10-3v/v GA3可使大豆根瘤菌的生長速率和數(shù)量發(fā)生顯著提高，然而添加較低或較高濃度GA3時會抑制大豆根瘤菌的發(fā)育。本試驗中添加10 mg·L-1赤霉素對12531f生長稍有促進作用，但效果并不明顯，而1 mg·L-1赤霉素對gn5f生長初期效果較好，隨著時間的延長則無明顯作用。表明添加適宜赤霉素濃度后可促進兩種熒光標(biāo)記根瘤菌的生長，而過高或過低濃度時會抑制根瘤菌的生長。兩種根瘤菌適宜的赤霉素濃度不同，可能是不同的根瘤菌基因型對相同激素水平會產(chǎn)生了不同的響應(yīng)。

接種45 d后根部12531f和gn5f的定殖量分別在2.20×102—8.60×103cfu/g和5.46×102—7.55×104cfu/g之間，表明兩種熒光標(biāo)記根瘤菌均可在植物根部長期穩(wěn)定定殖，占據(jù)生態(tài)位點，這為其向地上各組織運移并發(fā)揮促生作用奠定了基礎(chǔ)。在地上組織內(nèi)，葉片內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌含量高于莖內(nèi)，因為葉片是光合作用的場所，含較多碳水化合物，而莖是運輸水分、礦物質(zhì)、養(yǎng)分的通道，因此在營養(yǎng)富集的葉內(nèi)菌落定殖的數(shù)量高于作為運輸部位的莖[30]。但接種15 d后莖葉內(nèi)根瘤菌定殖數(shù)量減少，表明根瘤菌侵入苜蓿后在其體內(nèi)運移遇到了阻礙或屏障，降低了運移和定殖能力。遲峰等[23]同樣發(fā)現(xiàn)根部接種綠色熒光標(biāo)記根瘤菌ORS571后，可由根部向上運移，且定殖數(shù)量在15 d時達最高，隨后數(shù)量保持穩(wěn)定或稍微下降。

10 mg·L-1赤霉素促進了12531f大量定殖于上部葉內(nèi)，1 mg·L-1赤霉素促進了gn5f大量定殖于下部葉內(nèi)，由此表明添加赤霉素后可減弱苜蓿對外源根瘤菌12531f的選擇性屏障，使其大量運移并定殖于上部葉片。本試驗已發(fā)現(xiàn)添加赤霉素并未明顯促進兩種熒光標(biāo)記根瘤菌的生長，因此，赤霉素促進根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運移并定殖的原因很可能是因為添加赤霉素提高了植物體內(nèi)IAA的含量[31]，而IAA能使入侵微生物較容易侵染定殖于植物組織[32-33]，增加根瘤菌的侵染能力，使得大量根瘤菌向地上各組織內(nèi)運移并定殖。陳文浩[29]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GA3處理可誘導(dǎo)大豆根瘤菌80號氧化還原蛋白上調(diào)，表明赤霉素可能通過調(diào)控此蛋白表達從而調(diào)控根瘤菌的發(fā)育；經(jīng) GA3處理的292號轉(zhuǎn)運蛋白表達量表現(xiàn)出明顯的降低，而292號蛋白在調(diào)控蒺藜狀苜蓿（）與苜蓿中華根瘤菌（）共生互作形成及功能相關(guān)的蛋白方面已具有重要作用[34]。由此解釋了經(jīng)GA3處理大豆根瘤菌具有更好的根系侵染能力，添加適宜赤霉素后促進了兩種熒光標(biāo)記根瘤菌向地上各組織內(nèi)運移并定殖。

兩種熒光標(biāo)記根瘤菌所需的赤霉素濃度不同，這是因為菌種來源不同，對赤霉素的響應(yīng)不同。12531f的原始菌株為12531，分離自非本苜蓿植株體內(nèi)的外源根瘤菌，gn5f的原始菌株gn5是分離自甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子的內(nèi)源根瘤菌，寄主對內(nèi)源根瘤菌gn5f的防御性反應(yīng)弱于外源根瘤菌12531f，從而使得運移并定殖于植物體下部莖和葉內(nèi)時所需赤霉素濃度不同，說明了赤霉素對不同基因型根瘤菌影響不同，受菌種來源及遺傳特性影響。

根瘤菌可由根部向地上的莖葉內(nèi)運移并定殖，但存在選擇性屏障。本研究發(fā)現(xiàn)該屏障可能存在于苜蓿下部與上部的分界點之間，降低運移至上部莖和葉內(nèi)的gn5f根瘤菌數(shù)量，但上部葉內(nèi)12531f數(shù)量高于下部葉片，又表明宿主對不同根瘤菌菌株的選擇性屏障不同。

3.2 熒光標(biāo)記根瘤菌添加赤霉素接種對苜蓿幼苗的影響

苜蓿含種帶根瘤菌[11,14]，雖已發(fā)現(xiàn)未接種根瘤菌時苜蓿也可結(jié)瘤，但數(shù)量少于接種兩種熒光標(biāo)記根瘤菌的處理，說明種帶根瘤菌的競爭結(jié)瘤能力低于所接種的目標(biāo)根瘤菌[35]。內(nèi)生根瘤菌可提高植物體內(nèi)IAA和GA的含量，提高植物對磷的利用效率，提高植物葉片光合作用，從而具有促進生長、增加產(chǎn)量及種子含氮量的作用[23, 36]。添加赤霉素后促進了兩種熒光標(biāo)記根瘤菌在苜蓿體內(nèi)的運移和定殖，因此對苜蓿的生長具有促進作用。

本試驗中以12531f添加10 mg·L-1赤霉素和gn5f添加1 mg·L-1赤霉素處理后苜蓿結(jié)瘤、葉片數(shù)、株高、根長和生物量的效果較好。這可能是因為赤霉素可促進束縛型IAA釋放游離型IAA，增加細胞內(nèi)IAA的水平，而IAA可提高內(nèi)生根瘤菌的定殖數(shù)量[7]，因此內(nèi)生根瘤菌發(fā)揮了固氮優(yōu)勢和促進植株生長的能力，提高了苜蓿結(jié)瘤能力，促進了植株的生長，從而增加了生物量[35]。

葉綠素是植物進行光合作用的主要物質(zhì)，苜蓿葉片光合特性、生理代謝和光合產(chǎn)物代謝的變化可共同影響植株生長發(fā)育[37-38]。本試驗發(fā)現(xiàn)單獨接菌時葉片葉綠素含量高于對照，添加赤霉素后其含量低于未添加赤霉素的單獨接菌處理，其原因可能是赤霉素具有分解色素的作用，會降低色素合成的速度，使色素合成速度跟不上赤霉素促進細胞增大的速度等[39]，因此添加赤霉素后降低了葉綠素的含量。

可見，適宜濃度的赤霉素對根瘤菌的生長、在植物體內(nèi)運移和定殖、結(jié)瘤和苜蓿生長均有一定的促進作用，但需根據(jù)菌株的遺傳特性來選擇適宜的濃度。本研究初步探索了赤霉素對兩種根瘤菌生長的影響，且只探索了赤霉素對根瘤菌在苜蓿幼苗各組織內(nèi)的運移和定殖的影響，因此，后續(xù)研究會繼續(xù)探索赤霉素對根瘤菌在田間營養(yǎng)和生殖生長階段苜蓿體內(nèi)的運移和定殖的影響。此外，仍會繼續(xù)尋找利于根瘤菌生長的其他外源物質(zhì)，并篩選更多優(yōu)良的根瘤菌，為促進根瘤菌的運移和定殖效果并實現(xiàn)目標(biāo)根瘤菌導(dǎo)入良種苜蓿種子提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

12531f添加10 mg·L-1赤霉素接種，gn5f添加1 mg·L-1赤霉素接種利于二者在苜蓿幼苗體內(nèi)運移并定殖。上述兩種菌液添加相應(yīng)濃度赤霉素接種苜蓿幼苗，對單株結(jié)瘤數(shù)、單株根瘤重、單株葉片數(shù)、株高、根長、地上鮮重、地上干重、根鮮重、根干重均有促進作用。

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（責(zé)任編輯 楊鑫浩）

Effects of Gibberellin on Migration and Colonization of Rhizobia and Seedling Growth of Alfalfa

MIAO YangYang, SHI ShangLi, KANG WenJuan

(College of Grass and Science, Gansu Agricultural University/Key Laboratory for Grassland Ecosystem of Ministry of Education/ Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province/Sino-U.S. Centers for Grazing Land Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070)

The objectives of this study are to determine the effect of gibberellin on the migration and the colonization dynamics of the two fluorescent tagged rhizobia in Gannong No.5 alfalfa(L., Gannong No.5) tissues, and also to determine the effects of the combination treatments on alfalfa seedlings growth, so as to the results will not only enhance the colonization ability especially in reproductive tissues, but also provide benefits for alfalfa cultivation.The effect of gibberellin on the rhizobia growth (OD600) were detected at 1, 3, 5, 7 and 9 d after the day of adding gibberellin; the migration and colonization of rhizobia in alfalfa tissues of 15, 30, 45 and 60 day, and seedling growth were also investigated by drenching root with the inoculant of rhizobia12531f (12531f) andLZgn5f (gn5f), which were added with 0.5, 1, 10 and 100 mg·L-1gibberellin, respectively.The results showed that, under 10 mg·L-1and 1 mg L-1gibberellin level, 12531f and gn5f could grow better than other levels, but did not have significant effects. The two fluorescent tagged rhizobia could migrate to the aerial tissues and well colonize lower stems, upper stems and upper leaves by adding 10 mg·L-1gibberellin into 12531f treatment and added 1 mg·L-1into gn5f treatment, respectively. The fluorescent tagged rhizobia could not be detected in the control (sterile distilled water) treatment. Inoculating 12531f and gn5f alone increased the leaf chlorophyll content, while the addition of gibberellin inhibited the leaf chlorophyll content, but the individual plant nodule number, individual plant nodule weight, individual plant leaf number, plant height, root length, aerial dry weight, and root dry weight were increased highest when added 10 mg L-1and 1 mg·L-1gibberellin into 12531f and gn5f, respectively. When 10 mg·L-1gibberellin added into inoculant of 12531f, the individual plant nodule number was higher than that of control and single inoculated 75.71% and 11.82%, respectively, but there were no significant difference (＞0.05). the individual plant nodule weight was significantly higher than control and single inoculated 1 136.11% and 55.05%, respectively (＜0.05). the individual plant leaf number was significantly higher than control and single inoculated 113.94% and 78.28%, respectively (＜0.05). the plant height was significantly higher than control and single inoculated 83.33% and 50.24%, respectively (＜0.05). the root length was significantly higher than control and single inoculated 115.28% and 29.17%, respectively (＜0.05). the aerial dry weight was significantly higher than control and single inoculated 214.27% and 206.43%, respectively (＜0.05). the root dry weight was significantly higher than control and single inoculated 1 156.19% and 1 049.53%, respectively (＜0.05). When 1 mg·L-1gibberellin added into inoculant of gn5f, the individual plant nodule number was higher than control and single inoculated 82.86% and 4.07%, respectively, but there were no significant difference (＞0.05). the individual plant nodule weight was significantly higher than control and single inoculated 697.22% and 105.00%, respectively (＜0.05). the individual plant leaf number was higher than control and single inoculated 32.12% and 19.13%, respectively. the plant height was higher than control and single inoculated 95.24% and 37.82%, respectively; the root length was higher than control and single inoculated 76.39% and 5.83%, respectively, but there were no significant difference of these data (＞0.05). the aerial dry weight was significantly higher than control and single inoculated 125.98% and 121.80%, respectively (＜0.05). the root dry weight was significantly higher than control and single inoculated 864.43% and 762.21%, respectively (＜0.05).These results suggest that 10 mg·L-1gibberellin and 1 mg·L-1gibberellin promote the migration and colonization of 12531f and gn5f in alfalfa seedling, also enhance the number of nodules and leaves, and promote the growth of plant height, root length and biomass, indicating that suitable gibberellin might be exploited to promote the migration and colonization of rhizobia in alfalfa tissue and positively impact growth and yield.

; gibberellin;fluorescent tagged; rhizobia; migration; colonization; growth characteristic

2017-04-17；

2017-08-31

國家自然科學(xué)基金（31560666）

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