胡飛飛 陳良立 劉 珊 黃 悅 余勝男 陳 龍 喬 曦 鄧張雙 杜維力 付彩霞

(1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002； 2. 安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心，湖北 宜昌 443003； 3. 湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜都 443302)

宜都周邊養(yǎng)殖水體及魚肉中阿維菌素含量測(cè)定

胡飛飛1陳良立1劉 珊1黃 悅1余勝男1陳 龍1喬 曦1鄧張雙1杜維力2付彩霞3

(1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002； 2. 安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心，湖北 宜昌 443003； 3. 湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜都 443302)

建立固相萃取-高效液相色譜測(cè)定養(yǎng)殖水體及魚類中阿維菌素(Avermectins)殘留量的方法，了解AVMs在宜都水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用情況．采用固相萃取法(Solid Phase Extraction，SPE)對(duì)水體和魚類中AVMs進(jìn)行富集，高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)進(jìn)行含量檢測(cè)，外標(biāo)法定量．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AVMs在2.0～128.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9．測(cè)定結(jié)果顯示：在宜都周邊養(yǎng)殖區(qū)所采集的6份水樣和7份魚樣中均檢測(cè)到AVMs的殘留，殘留量分別為0.004 4～0.127 7 mg/kg和0.031 7～1.069 9 mg/kg，高于日本《食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》中規(guī)定魚肉中最大殘留限量0.005 mg/kg．固相萃取與HPLC法聯(lián)合運(yùn)用能精確測(cè)定水體及魚類中AVMs的含量，樣品處理方法簡(jiǎn)單、快速，實(shí)用性強(qiáng)．

阿維菌素； 抗生素； 固相萃??； 高效液相色譜法； 水產(chǎn)養(yǎng)殖

阿維菌素(Avermectins，AVMs)是一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，最早由日本北里大學(xué)大村智等人和美國(guó)Merck公司聯(lián)合研發(fā)，在生產(chǎn)應(yīng)用中又被叫做阿滅丁、白螨凈．AVMs在農(nóng)作物害蟲小菜蛾、棉鈴蟲等的防治上效果顯著，成為現(xiàn)在應(yīng)用較為普遍的一類廣譜獸用抗生素類殺蟲劑[1]．AVMs進(jìn)入機(jī)體神經(jīng)元突觸后競(jìng)爭(zhēng)性與谷氨酸門控氯離子通道結(jié)合使其開放，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元末端由于大量的氯離子進(jìn)入，引起神經(jīng)元休止電位的超極化，使正常的動(dòng)作電位不能釋放，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)受阻[2]．成蟲、幼蟲在接觸AVMs后，即會(huì)產(chǎn)生麻痹、不活動(dòng)、不取食等一些中毒癥狀，2～4 d就會(huì)死亡．

圖1 阿維菌素結(jié)構(gòu)式

人類由于血腦屏障的作用，按推薦劑量正確使用這類藥物對(duì)中樞系統(tǒng)傷害很?。?dāng)人和動(dòng)物攝入過(guò)量AVMs時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)不適癥狀，嚴(yán)重時(shí)表現(xiàn)為低血壓和昏迷等癥狀，并對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖能力具有潛在的威脅[3]．Ahmed Elbetieha等研究發(fā)現(xiàn)，每天每只小鼠的攝入量為1.19～2.13 mg時(shí)，雄性老鼠的生育生殖能力明顯下降，且具有較高的死胎機(jī)率[4]．因此，GB 2763-2014中明確規(guī)定，AVMs每日允許攝入量(ADI)為0.002 mg/kg，谷物蔬菜中AVMs最大殘留限量(Maximum Residue Limit， MRL)為0.01～0.5 mg/kg．日本《食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》中規(guī)定魚肉MRL值為0.005 mg/kg，中國(guó)未見類似水產(chǎn)殘留標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定．

抗生素藥物的廣泛使用以及其潛在的對(duì)環(huán)境和食品安全的影響，推動(dòng)著更加高效，準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展．固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)由液固萃取和柱液相色譜兩種技術(shù)演變而來(lái)，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，減少其他組分的干擾，提高分析物的回收率，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、省力[5]．高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是色譜分析方法的重要內(nèi)容之一，具有高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[6]．胡獻(xiàn)剛等建立了固相萃取-反相高效液相色譜法測(cè)定畜牧糞便中5種磺胺類、4種四環(huán)素類、2種喹諾酮類以及氯霉素和呋喃唑酮的檢測(cè)方法[7]．譚建華等結(jié)合固相萃取(SPE)與高效液相色譜(HPLC)分析，建立了一種適用于我國(guó)城市水環(huán)境中多種抗生素的分析方法，能夠同時(shí)分析多種抗生素[8]．GB 29695-2013中采用乙腈提取，正己烷除脂，堿性氧化鋁柱凈化，1-甲基咪唑和三氟醋酸酐衍生化，高效液相色譜-熒光法測(cè)定，外標(biāo)法定量，測(cè)定水產(chǎn)品中AVMs的含量[9]．蘇仲毅等通過(guò)分改良毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)和優(yōu)化流動(dòng)相組成、梯度洗脫程序等液相色譜分離條件，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)24種抗生素的目標(biāo)[10]．本文采用固相BRP(Banlanced Reverse Polymer)萃取柱對(duì)宜都市周邊水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)水體和魚類中AVMs進(jìn)行富集，利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)．

1 儀器與試劑

waters 1525EF分析兼半制備色譜系統(tǒng)，美國(guó)waters公司；KQ3200DB臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9140A臺(tái)式電熱鼓風(fēng)恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精密儀器儀表有限公司；電子分析天平，ME204中國(guó)上海梅特勒-拖利多有限公司；BT1-100V-LCD智能恒流泵，上海琪特分析儀器有限公司；VD 53真空干燥箱，德國(guó)Binder公司；BRP SPE萃取柱(500 mg/6 mL)，Welchrom公司；0.45 μm微孔濾膜．AVMs標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Labor Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈均為色譜級(jí)，J.T.Baker公司；EDTA-2Na，分析純，西隴化工股份有限公司；其它試劑均為分析純．

2 方法與結(jié)果

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取AVMs標(biāo)準(zhǔn)品40.0 mg，色譜級(jí)甲醇溶解；10.0 mL定容，充分搖勻得到AVMs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4.0 mg/mL)；采用甲醇逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，供HPLC測(cè)定．

2.2 樣品采集

水樣和魚樣均采集于湖北省宜都市，采樣時(shí)間為2016年5～6月．采集地點(diǎn)為養(yǎng)殖較為密集的宜都市廖家湖(樣1，1*和樣4)、石門村毛家崗水庫(kù)(樣2，2*)、下溪口水庫(kù)(樣3，3*)、驛馬沖(樣5)、木村(樣6)以及宜都市尾筆農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)水產(chǎn)市場(chǎng)(樣7*，8*，9*)、宜昌市大明市場(chǎng)(樣10*)．其中毛家崗水庫(kù)和下溪口水庫(kù)采用的是網(wǎng)箱養(yǎng)殖，其余為魚塘養(yǎng)殖．用1.5 L水樣采集瓶(預(yù)先用去離子水潤(rùn)洗兩次)采集水面以下0.5 m處水體，捕捉或購(gòu)買的魚類樣品野外用冰袋保鮮處理．

2.3 水樣預(yù)處理

水樣抽濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾．取1.0 L加入0.2 g EDTA-2Na溶解，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0．以10 mL/min的流速通過(guò)萃取小柱(使用前依次用6.0 mL甲醇和12.0 mL pH 3.0的去離子水淋洗作預(yù)處理)，經(jīng)pH 3.0的去離子水淋洗，淋洗后的小柱置于真空干燥箱干燥．甲醇洗脫并吹干，待HPLC測(cè)定．

2.4 魚樣預(yù)處理

將采集的魚樣剖殺去骨和內(nèi)臟，稱取5.0 g肌肉搗碎后置于燒杯中．加入乙腈15 mL，充分?jǐn)嚢杌旌?，超?0 min，2 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取兩次，合并兩次上清液．提取液用正己烷重復(fù)提取兩次，棄上層正己烷．下層乙腈提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏，用2 mL乙腈溶解，以10 mL/min流速過(guò)BRP萃取柱，收集濾液于試管，氮?dú)獯蹈纱鼿PLC測(cè)定．

2.5 色譜條件

色譜柱：YMC Hydrosphere C18色譜柱(3 μm，120 A，4.6×250 mm)；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；20 μL進(jìn)樣；流動(dòng)相：A相：甲醇，B相：水；洗脫條件：甲醇-水以80∶20(v/v)比例開始，10 min內(nèi)線性變梯度到100∶0(v/v)，最后穩(wěn)定10 min．依上述色譜條件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品在色譜中的保留時(shí)間(11.5 min)，在供試品的色譜圖中找到AVMs對(duì)應(yīng)色譜峰．

2.6 線性關(guān)系考察

在上述相同色譜條件下，對(duì)上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣分析，繪制濃度-峰面積曲線，計(jì)算回

歸方程和相關(guān)系數(shù)．實(shí)驗(yàn)顯示，AVMs在2.0～128.0 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=41 677X-4 452.7(Y為峰面積，X為AVMs質(zhì)量濃度，μg/mL)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9．

圖2 AVMs標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖對(duì)照

2.7 精密度考察

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在相同色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定色譜峰峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation， RSD)為2.26%，表明該方法的精密度良好．

2.8 穩(wěn)定性考察

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品以及抽取樣品3、樣品3*，分別于制備后的0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得其精密度分別為1.79%、2.80%、2.13%．表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定．

2.9 重復(fù)性考察

取同一批樣品，重復(fù)進(jìn)樣5次．根據(jù)色譜峰面積計(jì)算得其RSD值為1.79%．表明該方法重復(fù)性良好．

2.10 加樣回收實(shí)驗(yàn)

在100 μL供試品中依次加入質(zhì)量濃度為2、4 μg/mL的AVMs標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合均勻待測(cè)．在相同色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，根據(jù)峰面積計(jì)算其回收率，計(jì)算結(jié)果見表1．

表1 供試品加樣回收結(jié)果

2.11 樣品中阿維菌素含量測(cè)定

依照上述方法，對(duì)供試樣品進(jìn)行分析，測(cè)定供試樣品色譜峰峰面積，利用線性方程計(jì)算樣品中AVMs的含量，平行3次試驗(yàn)．測(cè)得的結(jié)果見表2～3．

表2 水體中AVMs含量測(cè)定結(jié)果

表3 魚肉中AVMs含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖水體及魚肉中阿維菌素的含量，該方法采用Welchrom BRP SPE小柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，工藝簡(jiǎn)單，便于操作，且快速準(zhǔn)確，效率高．配以高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)使得含量測(cè)定的結(jié)果可信度更高，實(shí)用性更強(qiáng)．因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)水體和水產(chǎn)品都有較為準(zhǔn)確的測(cè)定，固相萃取-高效液相色譜法對(duì)AVMs的檢測(cè)具有較高的應(yīng)用價(jià)值．

[1] 張啟迪．阿維菌素在鱘魚體內(nèi)生物富集與生物消除規(guī)律的研究[D]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003．

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DeterminationofAvermectininthePondWaterand

FishfromtheAquacultureAreasinYidu

Hu Feifei1Chen Liangli1Liu Shan1Huang Yue1Yu Shengnan1Chen Long1Qiao Xi1Deng Zhangshuang1Du Weili2Fu Caixia3

To investigate the usage of avermectin in aquaculture areas in Yidu, a method for the determination of avermectin residues in aquaculture water and fish by solid phase extraction and high performance liquid chromatography (HPLC) was established. The avermectin was enriched in aquaculture water and fish by solid phase extraction (SPE) and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) with external standard method. The avermectin concentration and peak area showed a good linear relationship in the range of 2-128 μg/mL and the correlation coefficient was 0.999 9. The analytical results showed that the residues of avermectin in the water and fish samples were 0.004 4-0.127 7 mg/kg and 0.031 7-1.069 9 mg/kg, respectively, which were much higher than the maximum residue limit in the Japanese Positive List System of 0.005 mg/kg. The combination of solid phase extraction and HPLC could be used for accurate determination of avermectin residues in water and fish. The method of sample treatment is simple, rapid and practical.

Avermectins； antibiotics； Solid-Phase Extraction； High Performance Liquid Chromatography； aquaculture

10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2017.05.022

2017-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(311000801)；三峽大學(xué)教學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No. J2015037)；生物與制藥學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新課題

鄧張雙(1979-)，男，博士，教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)．E-mail： dzs163@163.com

S 948

A

1672-948X(2017)05-0109-04

(1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research & Development, College of Biological & Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China; 2. Research & Development Center, Angel Yeast Co., Ltd., Yichang 443003, China; 3. Hubei Old Silly Soil Ecological Agriculture Science & Technology Co., Ltd., Yidu 443302, China)

[責(zé)任編輯周文凱]