周亞楠，白潔，袁浩，劉永利（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊050011）

UPLC法同時(shí)測(cè)定連參通淋片中5種黃連生物堿類成分的含量

周亞楠＊，白潔，袁浩，劉永利#（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊050011）

目的：建立同時(shí)測(cè)定連參通淋片中表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的方法。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為Thermo Scientific Syncronis C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（加三乙胺調(diào)pH至3.0）（30∶70，V/V），流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為2 μL。結(jié)果：表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為4.08～163 ng（r＝0.999 9）、5.72～229 ng（r＝0.999 8）、5.67～227 ng（r＝0.999 9）、6.78～271 ng（r＝0.999 6）、13.2～526 ng（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.83%～103.92%（RSD＝2.2%，n＝9）、97.62%～104.85%（RSD＝2.9%，n＝9）、99.44%～104.18%（RSD＝1.8%，n＝9）、98.64%～104.42%（RSD＝1.8%，n＝9）、98.24%～102.40%（RSD＝1.5%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于連參通淋片中5種黃連生物堿類成分含量的同時(shí)測(cè)定。

超高效液相色譜法；黃連生物堿；連參通淋片；含量

連參通淋片由黃連、苦參、瞿麥、川木通、萹蓄、梔子、大黃、丹參、綿萆薢、茯苓、白術(shù)、石菖蒲、甘草等13味中藥組成，具有清熱祛濕、利水通淋的功效[1]。該制劑現(xiàn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ00622009，該標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了黃連中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定項(xiàng)；且現(xiàn)有文獻(xiàn)多采用薄層掃描法[2]、紫外分光光度法[3]、高效液相色譜法[4-6]測(cè)定黃連生物堿的含量，但分離度和靈敏度均不好。鑒于此，筆者采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了同時(shí)測(cè)定連參通淋片中表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿5種黃連生物堿含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型UPLC儀，包括光電二極管矩陣檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；KQ-500KDE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

連參通淋片（A 廠，1511272、1503081、1503102、1503101、1503091、1511091、1511101、140305、130820、140304、140806，規(guī)格：0.8 g/片）；表小檗堿對(duì)照品[批號(hào)：YS-（usp）-0049，純度：98%]、黃連堿對(duì)照品（批號(hào)：BR-09205，純度：98%）均購(gòu)自日本Sigma公司；鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)：110733-201108，純度：90.3%）、鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)：110732-200506，純度：100%）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-200911，純度：86.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（加三乙胺調(diào)pH至3.0）（30∶70，V/V）；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取待測(cè)成分對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量，超聲（功率：400 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，制成表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度分別為0.102 1、0.142 8、0.141 7、0.328 8、0.328 8 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。取上述表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿和鹽酸巴馬汀單一對(duì)照品貯備液各5.0 mL，鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液10.0 mL，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加鹽酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷；再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，制備缺黃連的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各待測(cè)成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)＞10 000，保留時(shí)間約為10.2 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.4、0.6、1、2、6、10、16 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程與線性范圍見(jiàn)表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.2%、0.1%、0.6%、0.1%、0.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：140806）適量，分別于室溫下放置0、1、3、6、15、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.5%、0.9%、1.7%、0.5%、0.2%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：140806）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的平均值分別為3.01、4.25、4.75、7.11、22.93 mg/g，RSD分別為0.8%、0.7%、1.0%、1.1%、0.7%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：140806）適量，共9份，每份約0.25 g，分別置于50 mL量瓶中，各加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品含量測(cè)定結(jié)果

取11批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者采用光電二極管矩陣檢測(cè)器在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿在228、265、345 nm波長(zhǎng)附近均有較大吸收，考慮到樣品中藥味較多，低波長(zhǎng)處雜質(zhì)峰可能會(huì)增多，故選擇較大波長(zhǎng)345 nm作為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

3.2 流動(dòng)相的選擇

筆者在參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]的基礎(chǔ)上，分別考察了不同比例的乙腈-磷酸二氫鉀、乙腈-庚烷磺酸鈉-磷酸二氫鉀、乙腈-0.1%磷酸溶液-庚烷磺酸鈉以及乙腈-0.1%磷酸溶液（加三乙胺）等作為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)的情況，結(jié)果乙腈-0.1%磷酸溶液-庚烷磺酸鈉系統(tǒng)和乙腈-0.1%磷酸溶液（加三乙胺）系統(tǒng)分離較好，基線平穩(wěn)。但是，考慮到乙腈-0.1%磷酸-庚烷磺酸鈉系統(tǒng)配置煩瑣，且長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)色譜柱造成堵塞，因此本試驗(yàn)最終選擇乙腈-0.1%磷酸溶液（加三乙胺）系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（加三乙胺調(diào)pH至3.0）（30∶70，V/V）。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于連參通淋片中5種黃連生物堿類成分含量的同時(shí)測(cè)定。

[1]孔德憲，姜海，劉育強(qiáng)，等.HPLC測(cè)定連參通淋片中鹽酸小檗堿的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13（5）：29-31.

[2]劉法錦，孫東梅，魯佳慧，等.薄層色譜掃描法測(cè)定黃連吳茱萸藥對(duì)中黃連生物堿的含量[J].中成藥，2010，32（1）：75-79.

[3]朱強(qiáng)，王有為，齊海濤，等.不同品系黃連產(chǎn)量和質(zhì)量的研究[J].中草藥，2006，37（12）：1866-1869.

[4]匡艷輝，朱晶晶，王智民，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44（5）：390-394.

[5]袁久榮，魏英勤，袁浩，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定黃連中4種原小檗堿型生物堿的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)，2006，8（6）：36-39.

[6]蘇靜華，張超，孫磊，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定黃連上清片的黃芩-黃連-黃柏藥對(duì)中9個(gè)指標(biāo)性成分的含量[J].藥物分析雜志，2015，35（11）：1940-1945.

[7]張曉靜，劉德福，丁菲菲，等.HPLC法測(cè)定癃清片中表小檗堿、黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2015，30（5）：527-530.

[8]鄧六勤，鐘鳴.RP-HPLC法測(cè)定黃連上清片中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22（16）：1514-1516.

[9]孫建彬，王欣，陽(yáng)勇，等.黃連須中5種生物堿含量的高效液相色譜法測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，26（7）：1607-1609.

Simultaneous Determination of 5 Coptis Alkaloid in Lianshen Tonglin Tablets by UPLC

ZHOU Yanan，BAI Jie，YUAN Hao，LIU Yongli（Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of epiberberine，jateorhizine hydrochloride，coptisine，palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride in Lianshen tonglin tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Thermo Scientific Syncronis C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（pH adjusted to 3.0 with triethylamine）（30∶70，V/V）at the flow rate of 0.3 mL/min.The detection wavelength was set at 345 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 2 μL.RESULTS：The linear ranges were 4.08-163 ng for epiberberine（r＝0.999 9），5.72-229 ng for jateorhizine hydrochloride（r＝0.999 8），5.67-227 ng for coptisine（r＝0.999 9），6.78-271 ng for palmatine hydrochloride（r＝0.999 6），13.2-526 ng for berberine hydrochloride（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%.The recoveries were 96.83%-103.92%（RSD＝2.2%，n＝9），97.62%-104.85%（RSD＝2.9%，n＝9），99.44%-104.18%（RSD＝1.8%，n＝9），98.64%-104.42%（RSD＝1.8%，n＝9），98.24%-102.40%（RSD＝1.5%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The developed method is simple，sensitive，rapid and accurate.It is suitable for simultaneous determination of 5 coptis alkaloids in Lianshen tonglin tablets.

UPLC；Coptis alkaloid；Lianshen tonglin tablets；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4725-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.32

＊主管藥師，碩士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量控制。電話：0311-85212007-8042。E-mail：172774170@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量控制。電話：0311-85212007-8041。E-mail：Liuyongli2008@126.com

（編輯：劉 柳）

2017-04-21

2017-07-06）