王玉俊，王長寶,2，岳麗紅

朱紅栓菌原生質(zhì)體制備與再生的研究

王玉俊1，王長寶1,2，岳麗紅1

（1. 佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學(xué) 環(huán)境與生物技術(shù)研究所，黑龍江 佳木斯 154007）

將2016年7月在黑龍江省涼水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)采集的朱紅栓菌Trametes cinnabarina子實(shí)體接種于PDA固體培養(yǎng)基平皿中，30℃下培養(yǎng)7 d，截取菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中用于原生質(zhì)體制備與再生實(shí)驗(yàn)。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究酶解溫度、酶解時(shí)間、菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶配比對原生質(zhì)體制備的影響。結(jié)果表明，以0.6 mol·L-1甘露醇溶液作為高滲緩沖液，復(fù)合酶組成為 1.5%溶壁酶+1.0%纖維素酶+1.0%蝸牛酶，菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%，30℃條件下酶解3.5 h為朱紅栓菌原生質(zhì)體制備的最適條件，產(chǎn)量達(dá)1.00×107個(gè)·mL-1；以0.6 mol·L-1蔗糖溶液作為再生高滲緩沖液，原生質(zhì)體再生率最高達(dá)20.6%。

朱紅栓菌；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；原生質(zhì)體；制備；再生

朱紅栓菌Trametes cinnabarina（Jacq.: Fr.）Fr.，又名紅栓菌、朱砂菌、胭脂栓菌、朱紅密孔菌等，隸屬擔(dān)子亞門Basidiomycotina多孔菌科Polyporaceae[1-2]。它是一種能有效降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的白腐真菌，可作為降解秸稈的優(yōu)良菌株，減少農(nóng)業(yè)焚燒秸稈產(chǎn)生的污染，在環(huán)境治理方面應(yīng)用前景廣闊。

在真菌的改良育種中，制備出高質(zhì)量的原生質(zhì)體對其融合及再生至關(guān)重要。高等擔(dān)子菌原生質(zhì)體制備的研究，始于 1972年對裂褶菌原生質(zhì)體的成功分離[3]。研究表明，影響原生質(zhì)體制備的因素較多，包括酶解溫度、酶解時(shí)間、復(fù)合酶配比、菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)、菌齡、高滲緩沖液、pH值等[4]，其中，復(fù)合酶的效果要好于單一酶[5-6]。近年來，關(guān)于朱紅栓菌的研究主要集中在培養(yǎng)條件、成分提取和抗菌活性等方面[7-10]，而有關(guān)其原生質(zhì)體的制備和再生的研究鮮有報(bào)道。通過分析酶解溫度、酶解時(shí)間、菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶配比4個(gè)主要影響因素，探索朱紅栓菌原生質(zhì)體制備及再生的適宜條件，旨在為今后研究朱紅栓菌原生質(zhì)體融合及優(yōu)良品種選育提供技術(shù)基礎(chǔ)。

表1 原生質(zhì)體制備酶體系的優(yōu)化設(shè)計(jì)Table 1 Design for enzymesystem of protoplast preparatio

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 朱紅栓菌子實(shí)體于2016年7月采集于黑龍江省涼水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，用無菌小剪子剪取體積為0.5 cm3的內(nèi)部未受污染的菌肉，接種于PDA固體培養(yǎng)基平皿中，30℃下培養(yǎng)7 d。朱紅栓菌菌種保存在佳木斯大學(xué)環(huán)境與生物技術(shù)研究所。

1.1.2 藥品與試劑 溶壁酶（Lywallzyme/L）（上海金穗生物科技有限公司），纖維素酶（Cellulose/C）（南京奧多福尼生物科技有限公司），蝸牛酶（Glusulase/G）（Sigma），甘露醇（六安華源制藥有限公司），山梨醇（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司），蔗糖（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO43.0 g，用蒸餾水補(bǔ)足至1 L；（2）PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖15.0 g，瓊脂15.0 g，用蒸餾水補(bǔ)足至1 L。（3）再生培養(yǎng)基：蔗糖15.0 g，酵母粉 3.0 g，馬鈴薯 200.0 g，瓊脂 8.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO41.0 g，VB14.0 mg，用 0.6 mol·L-1蔗糖溶液補(bǔ)足至1 L[11]。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 TG16-W 微量高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），BSD-YX（F）2600立式搖床(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），F(xiàn)A3204B電子分析天平（上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司），GMSX-280高壓蒸汽滅菌器（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），血球計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)大培養(yǎng) 用無菌接種器截取直徑為1.0 cm的朱紅栓菌菌絲體，接入液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)7 d，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶液的配置 用分析天平稱取不同質(zhì)量的固體酶于1 mL離心管中（復(fù)合酶體系中L，C，G的質(zhì)量見表1），加入1 mL濃度為0.6 mol·L-1的無菌甘露醇高滲透壓緩沖液溶解，經(jīng)微孔濾膜（直徑0. 22 μm）過濾后備用。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備 取液體培養(yǎng)基中的菌絲體，用0.6 mol·L-1甘露醇高滲緩沖液洗3次，去除殘留培養(yǎng)基后，無菌濾紙吸去多余水分，用無菌小剪子將其剪碎。取菌絲體置于裝有1 mL酶液的離心管中，充分混勻，搖散菌絲，進(jìn)行酶解。酶解完畢后，冰浴終止酶解，經(jīng)0.18 mm無菌濾網(wǎng)過濾，濾液4 000 rpm·min-1離心5 min，棄去上清液，用1 mL濃度為0.6 mol·L-1甘露醇高滲緩沖液懸浮沉淀，重復(fù)3次，得到純化的朱紅栓菌原生質(zhì)體，血球計(jì)數(shù)板檢測原生質(zhì)體個(gè)數(shù)（式1），4℃保存。

式中，X1，X2，X3，X4，X5為血球計(jì)數(shù)板單位小格中原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 酶解條件的單因素試驗(yàn)設(shè)置溫度為20，25，30，35℃，菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，酶液體系為1.0% L，1.0% C和1.0% G，酶解3.5 h，初步篩選最適溫度。根據(jù)篩選出的適宜酶解溫度進(jìn)行酶解時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置酶解時(shí)間為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h，其他條件同上。根據(jù)篩選出的適宜酶解溫度、時(shí)間進(jìn)行菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化，設(shè)置菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%，10%，15%，20%。同理設(shè)置酶配比，調(diào)節(jié)酶體系中溶壁酶、纖維素酶、蝸牛酶的濃度，初步確定最佳的酶體系。分別研究酶解溫度、酶解時(shí)間、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶的配比對原生質(zhì)體制備量的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn) 按照單因素試驗(yàn)結(jié)果，對溫度、時(shí)間、菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)、復(fù)合酶配比4個(gè)酶解因素進(jìn)行3個(gè)水平的設(shè)置，即L9（34）。依照表2進(jìn)行朱紅栓菌原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化正交試驗(yàn)，測定其原生質(zhì)體制備量。

表2 原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal designfor optimization of protoplast preparation

1.2.6 不同高滲緩沖液對再生及再生率的影響 根據(jù)正交試驗(yàn)篩選出的最佳條件進(jìn)行朱紅栓菌原生質(zhì)體的制備，酶解3.5 h后，經(jīng)0.18 mm無菌濾網(wǎng)過濾，濾液4 000 rpm離心5 min，棄去上清液，分別用1 mL濃度為0.6 mol·L-1的蔗糖、甘露醇、NaCl、山梨醇高滲緩沖液懸浮沉淀，得到原生質(zhì)體懸液。用移液管吸取0.1 mL涂布在再生培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5 ～ 7 d，記錄再生菌落生長情況，計(jì)算原生質(zhì)體再生率（式2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度對原生質(zhì)體制備數(shù)量的影響

由圖1可知，原生質(zhì)體產(chǎn)量由高到低對應(yīng)的酶解溫度依次為30℃＞25℃＞35℃＞20℃。單因素方差分析結(jié)果顯示，不同處理間均存在顯著差異（P＜0.05）。說明酶解溫度對菌絲壁的酶解效率影響較大，溫度過高或過低都不利于細(xì)胞壁的酶解。隨著溫度的升高，朱紅栓菌原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著升高，到30℃時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到最高峰，為4.64×106個(gè)·L-1，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)原生質(zhì)體數(shù)量顯著下降。酶解溫度為25℃時(shí)次之，兩者間差異性顯著。

2.2 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響

由圖2可知，酶解時(shí)間在2.0 ～ 2.5 h范圍內(nèi)，原生質(zhì)體制備量較少，隨著酶解時(shí)間的增加原生質(zhì)體制備量顯著升高（P＜0.05）。酶解時(shí)間在3.0 ～ 4.0 h制得的原生質(zhì)體數(shù)目較多。到3.5 h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高，為 4.68×106個(gè)·mL-1，與酶解 3 h，4 h 的產(chǎn)量差異顯著。從3.5 h后，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著時(shí)間的延長開始下降，且差異顯著。因此，制備朱紅栓菌原生質(zhì)體的適宜酶解時(shí)間為 3.5 h，產(chǎn)量最高。

2.3 菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響

在酶解體系中，菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5% ～ 20%范圍內(nèi)，原生質(zhì)體制備量隨菌絲量的增多而增加，菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，原生質(zhì)體制備量達(dá)到最高值，為4.4×106個(gè)·mL-1（圖3）。菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)由5%增大至20%過程中，酶解速度不斷提升，原生質(zhì)體產(chǎn)量上升趨勢顯著。經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，不同處理間均存在顯著差異（P＜0.05），因此，菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)對原生質(zhì)體的制備至關(guān)重要。

圖1 酶解溫度對朱紅栓菌原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Figure 1 Effect of enzymolysis temperature on yield of T. cinnabarina protoplast

圖2 酶解解時(shí)間對朱紅栓栓菌原生質(zhì)體體產(chǎn)量的影響Figure 2 Effect of enzymolysis time on yieldofT. cinnabarina protoplast

圖3 底物質(zhì)量分分?jǐn)?shù)對朱紅栓栓菌原生質(zhì)體體產(chǎn)量的影響響Figure3 Effect of mass frraction of hyphaeon yield of T. cinnabarina protoplast

2.4 酶的濃度及配比對原生質(zhì)體產(chǎn)量量的影響

如表3所所示，菌絲在在9種不同濃度的復(fù)合酶中均能產(chǎn)生原原生質(zhì)體。纖維素酶、溶壁酶、蝸牛酶分分別為1.5%，1.0%，1.0%時(shí)效果最好，配比為1.0%%，1.0%，1.0%次之，朱紅栓菌原生質(zhì)質(zhì)體制備量分別為 3.83×1006個(gè)·mL-1和3.79×106個(gè)·mL-1，兩者間差異不顯著，但顯著高于于其他酶配比的酶解效率（P＜0.05）。酶濃度在0.5% ～ 1.0%之間，隨著酶濃度的升高，原生質(zhì)體的產(chǎn)率逐漸增多，當(dāng)酶液濃度達(dá)到1.5%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量開始下降。

2.5 諸因素對原生質(zhì)體制備的影響

根據(jù)1.2.5正交設(shè)計(jì)計(jì)，9個(gè)處理的的試驗(yàn)結(jié)果見表4，對四個(gè)因素的極差進(jìn)行比較，重要性依次為為：酶解溫度（（℃）＞菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）＞酶解時(shí)間（h）＞酶配比（%）。其其中，酶解溫度度的極差最大大，是影響原生質(zhì)體制備的首要因素。綜合考慮各因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，采用酶液液組成為1.5% L+1.0% C+1.0% G的復(fù)復(fù)合酶、菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為為20%，在30℃下酶解3.55 h為朱紅栓菌原生質(zhì)體制備的最佳條件，原生質(zhì)體產(chǎn)量為10×106個(gè)·mL-1。

表3 不同酶的配比對朱紅栓菌原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Table 3Effects of different ratio of enzyme on yield of T. cinabarina

表4 朱紅栓菌原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化正交試驗(yàn)分析Table 4 Visual analysis of orthogona ltest scheme of Trametes cinnabarina protoplast proparion

圖4A（箭頭所指為原生質(zhì)體）為最佳條件下朱紅栓菌原生質(zhì)體制備情況。圖 4B（箭頭所指為再生菌落）是以0.6 mool·L-1蔗糖溶液為高滲緩沖液，涂布于再生培養(yǎng)基4 d后的生長情況。鏡檢下視野明亮，原生質(zhì)體較為密集，殘余菌絲較少，因此，通過本試驗(yàn)方法可獲得純凈的的朱紅栓菌原生質(zhì)體，產(chǎn)量為1.0×107個(gè)·mL-1。在30℃下培養(yǎng)5 ～ 7 d，原生質(zhì)體萌發(fā)，形成白色菌落。

圖4 最佳制備條件下純化的朱紅栓菌原生質(zhì)體（×400）（A）及再生平皿（B）Figure 4Purified protoplasts(×400)(A) and regeneration(B) of T.cinnabarina under the optimal condition

2.6 不同高滲緩沖液對原生質(zhì)體再生率的影響

不同高滲緩沖液的原生質(zhì)體再生率為蔗糖＞氯化鈉＞甘露醇＞山梨醇，分別為20.6%，8.3%，7.8%，4.3%（圖5）。4種高滲緩沖液中，，0.6 mol·L-1蔗糖溶液較適合朱紅栓菌原生質(zhì)體的再生（圖4B），再生率為20.6%，顯著高于其他3種高滲緩沖液（P＜0.05）。氯化鈉鈉和甘露醇次之，兩者間差異不顯著。以以 0.6 mol·L-1山梨醇作為高滲緩沖液，原生質(zhì)體再生率顯著降低。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)都雯玥等的研究報(bào)道，制備截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體適宜的酶解溫度為35℃，酶解時(shí)間為3.5 h[12]，與本研究結(jié)果一致。酶解溫度是影響原生質(zhì)體釋放的的主要因素，適宜的溫度可以提高酶液分解細(xì)胞壁的活力。朱紅栓菌原生質(zhì)體制備量的高峰在第3.5 h，酶解時(shí)間超過4.0h，原生質(zhì)體制備率下降，繼續(xù)延長溶壁酶的的作用時(shí)間會(huì)影響原生質(zhì)體膜系統(tǒng)，長時(shí)間浸泡在酶液中，部分原生質(zhì)體出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，這是因?yàn)樵|(zhì)體失去了細(xì)胞壁的保護(hù)，較為脆弱，容易破裂。在酶液的配置過程中，酶濃度過高或過低都會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量下降。酶濃度過低，不能充分酶解細(xì)細(xì)胞壁，導(dǎo)致制備速度緩慢，制備率不高；酶濃度過高，會(huì)使酶液脫壁過于徹底，對細(xì)胞損傷較大，會(huì)影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率。本研究采用1.5%溶壁酶+1.0%纖維素酶+1.0%蝸牛酶的復(fù)合酶作為酶解液，分離原生質(zhì)體效果較好。根據(jù)何小慧等的研究報(bào)道，濃度為2.0%的溶壁酶可獲得較高的杏鮑菇原生質(zhì)體制備量[13]，與本研究結(jié)果中最適酶配比及酶濃度不一致，可能是由于兩種真菌細(xì)胞壁成分差異較大，以及酶液的種類不同造成的。不同種類真菌細(xì)胞壁組成差異較大，所以不同種類真菌原生質(zhì)體制備的方法和適宜條件有所不同。

圖5 不同高滲緩沖液對原生質(zhì)體再生率的影響Figure 5 Effect of high osmotic buffers on regeneration rate of T. cinnabarina protoplast

菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)由5%增大至20%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著升高，當(dāng)菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%，菌絲體會(huì)裝滿離心管，雖然原生質(zhì)體制備量還在增加，但隨著酶體系中菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，部分菌絲體會(huì)從酶液中裸露出來，這會(huì)減少菌絲體與酶液的接觸，故朱紅栓菌菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%較為適宜。原生質(zhì)體再生方面，本研究選擇濃度為0.6 mol·L-1的蔗糖溶液作為再生穩(wěn)滲液，原生質(zhì)體再生率較高，為20.6%，這可能是由于蔗糖穩(wěn)滲液既可保持原生質(zhì)體合適的滲透壓，也可為其提供碳源，有利于原生質(zhì)體的再生。不同體積分?jǐn)?shù)的蔗糖、山梨醇和甘露醇的混合液作為穩(wěn)滲液，可能會(huì)提高再生率，需做進(jìn)一步研究。

在菌絲體培養(yǎng)過程中，靜置培養(yǎng)菌絲以輻射方式生長，菌絲分散，不成球，有利于溶壁酶的酶解[14]。朱紅栓菌原生質(zhì)體制備與再生的過程中，酶解條件對原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的影響需做統(tǒng)籌考慮，既要獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量，也要保證其再生率。本實(shí)驗(yàn)表明，采用1.5% L+1.0% C+1.0% G的復(fù)合酶，菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，在30℃下酶解3.5 h為朱紅栓菌原生質(zhì)體制備的最佳條件，原生質(zhì)體產(chǎn)量為1.0×107個(gè)·mL-1。以0.6 mol·L-1蔗糖溶液作為再生高滲緩沖液，原生質(zhì)體再生率最高達(dá)20.6%。

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Study on Preparation and Regeneration of Trametes cinnabarina Protoplast

WANG Yu-jun1，WANG Chang-bao1,2，YUE Li-hong1
（1. College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 1540072,China; 2. Institute of Environment and Biotechnology, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China）

Sporecarp of Trametes cinnabarina was collected in July 2016 in Liangshui National Nature Reserve of Heilongjiang province, and was cut out on PDA agarslantculture-medium under 30℃ for 7 days. Mycelium was inoculated on liquid nutrient medium for protoplast preparation and regeneration test. Single factor and orthogonal test was carried out on enzymolysis temperatures and enzymolysis time, mass fractions of hyphae and enzyme ratios. The result demonstrated that the best condition for protoplast preparation was 0.6 mol·L-1mannitol solution as buffer, 1.5% of lywallzyme, 1.0% of cellulase and 1.0% of glusulase as enzume ratio, 20% of mass fraction of mycelia, 3.5 hours foren zymolysis under 30℃. The yield of protoplast topped to 1.0×107mL-1. The highest regeneration rate was 20.6% with 0.6 mol·L-1sucrose solution as the regeneration stabilizer.

Trametes cinnabarina; single factor experiment; orthogonal experiment; protoplast; preparion; regeneration

Q 949.32

A

1001-3776（2017）05-0048-06

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.05.008

2017-04-29；

2017-07-30

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（YZ2016-010）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201452）

王玉俊，碩士研究生，從事微生物學(xué)研究；E-mail：wangyujun2011@163.com。岳麗紅，副教授，從事微生物學(xué)研究；E-mail：jmsylh@126.com。