李 皓，董建華，董建明，袁紫倩，胡俊靖，趙偉明

退化與正常山核桃林土壤細菌多樣性比較研究

李 皓1，董建華1，董建明2，袁紫倩1，胡俊靖1，趙偉明1

（1. 杭州市林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310022；2. 杭州市臨安區(qū)林業(yè)局，浙江 杭州 311300）

2014年10月，在浙江省臨安市選擇4個退化山核桃Carya cathayensis林樣地和2個正常山核桃林樣地，采土樣后用16SrDNA測序技術(shù)分析兩種林地土壤細菌多樣性。結(jié)果表明，6個樣地土壤細菌共有36門75綱96目224科924屬。在門的水平上，退化和正常林地細菌主要類群基本一致，主要類群有變形菌門Proteobacteria，酸桿菌門 Acidobacteria，擬桿菌門 Bacteroidetes，綠彎菌門 Chloroflexi，厚壁菌門 Firmicutes，疣微菌門Verrucomicrobia，放線菌門Actinobacteria和浮霉菌門Planctomycetes，但不同林地中各類群相對豐度明顯不同；在屬的水平上，退化和正常林地差別很大。Alpha多樣性分析顯示，6個樣地 Shannon指數(shù)，ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)的排序各不相同，分析說明山核桃林退化程度與土壤細菌數(shù)量和多樣性無關(guān)。相關(guān)分析結(jié)果表明，ACE指數(shù)與交換性H+顯著相關(guān)，其余土壤物理化學性質(zhì)與細菌多樣性指數(shù)均無顯著相關(guān)性。

山核桃；退化；土壤細菌群落；16SrDNA測序；多樣性

山核桃Carya cathayensis是我國特有的木本油料樹種，主要分布在浙皖交界的天目山地區(qū)，包括浙江臨安及安徽寧國等縣市，其果實富含不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)，可加工為干果食用，經(jīng)濟價值高。近年來，為了追求高產(chǎn)，林農(nóng)大量使用化肥和化學除草劑使許多山核桃林地出現(xiàn)退化現(xiàn)象，植株生長不良、枝條死亡，產(chǎn)量大幅下降，甚至整片林分死亡。

土壤細菌是土壤環(huán)境的重要組成部分，參與土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量傳遞。土壤中細菌的種類、數(shù)量和分布影響著土壤肥力、植物營養(yǎng)及土壤中有毒物質(zhì)降解，同時在促進土壤生態(tài)恢復(fù)方面發(fā)揮著重要作用，土壤細菌的生物多樣性越豐富，越有利于土壤的可持續(xù)利用和抗壓力[1-2]。

16SrDNA測序以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建 16SrDNA文庫，利用高通量測序技術(shù)分析樣品所包含的全部微生物的群體基因組成及功能和參與的代謝通路，解讀微生物群體的多樣性與豐度，探求微生物與環(huán)境之間的關(guān)系[3-4]。

本研究采用 16SrDNA測序分析技術(shù)分析退化山核桃林和正常山核桃林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，研究山核桃生長不良及土壤環(huán)境變化對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為山核桃退化林地的土壤管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省臨安市龍崗鎮(zhèn)林坑村，119°05′35.1″ E，30°09′27.6″ N，亞熱帶季風氣候，四季分明，氣候溫和，雨量充足，年平均氣溫15.8℃，年平均日照1 939 h，無霜期234 d。研究區(qū)內(nèi)山核桃林普遍為人工純林，株行距5 m×6 m，300株·hm-2。林農(nóng)通常在林地內(nèi)使用大量化肥和化學除草劑，使多數(shù)山核桃林出現(xiàn)不同程度的退化，只有化肥施用量少、采用人工劈草方式經(jīng)營的林分生長健康。2014年5月，根據(jù)山核桃林分生長狀況，對山核桃林進行退化程度分級：（1）正常，山核桃長勢正常良好；（2）輕度退化，葉色偏黃，頂端出現(xiàn)少量枯枝；（3）嚴重退化，多數(shù)植株樹葉稀少，頂端枯死或整株死亡。

1.2 試驗材料

2014年10月，選擇4個退化山核桃林地（樣地1，樣地2，樣地3，樣地4）和2個正常林地（樣地5和樣地6），每個樣地面積為666.67 m2，樣地基本情況見表1。

在每個樣地內(nèi)隨機設(shè)5個采樣點，去除表面雜草和浮土，采集0 ～ 20 cm 土層中的土壤，將每個樣地5個樣點采樣土壤充分混合后，一部分用聚乙烯袋密封，帶回實驗室置于-80℃冰箱中保存，另一部分樣品自然風干，用于測定土壤化學性質(zhì)，樣地土壤基本性質(zhì)見表2。

表1 樣地基本情況Table1 Information of 6 sample plots

表2 不同樣地土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Phisio-chemical properties of soil in 6 sample plots

1.3 試驗方法

利用宏基因組測序技術(shù)對山核桃林地土壤細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析鑒定。所有樣品細菌基因組 DNA提取和16S rDNA擴增與測序工作委托生工生物工程（上海）有限公司完成。實驗流程：對提取到的基因組DNA進行瓊脂糖電泳檢測，查看基因組DNA的完整性與濃度。利用Qubit2.0DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)需加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的通用引物。PCR結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（cat：SK8131）對DNA進行回收。回收產(chǎn)物用Qubit2.0定量，根據(jù)測得的DNA濃度，將所有樣品按照1:1的比例進行混合，混合后充分震蕩均勻，用于后續(xù)的樣品建庫（加測序標簽）與測序。

測序分析流程：采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對各樣本序列做 QC。去除非靶區(qū)域序列及嵌合體，采用 RDPclassifier將序列進行物種分類，根據(jù)序列間的距離對多條序列進行聚類，把序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用不同分類水平的OTU分析，說明山核桃林地土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。采用Alpha多樣性分析，計算Shannon指數(shù)，ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)，Coverage等，衡量每個樣本的物種多樣性[5]。使用SPSS 19.0對不同樣地土壤化學性質(zhì)與細菌多樣性指數(shù)進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 退化山核桃林地和正常山核桃林地土壤細菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過OTU分析得出，在相似水平為97%的條件下，6個樣地中土壤細菌共有36門75綱96目224科924屬。在門的分類水平上，退化山核桃林地和正常山核桃林地主要類群基本一致，其中變形菌門 Proteobacteria，酸桿菌門 Acidobacteria，擬桿菌門 Bacteroidetes，綠彎菌門 Chloroflexi，厚壁菌門 Firmicutes，疣微菌門Verrucomicrobia，放線菌門Actinobacteria和浮霉菌門Planctomycetes為主要類群，詳見表3。

表3 不同樣地土壤細菌優(yōu)勢門相對豐度Table 3 Relative abundance of dominant phylum in 6 sample plots

對正常樣地中相對豐度超過1%的細菌主要門類進行分析，與退化林地的相比，在生長良好的山核桃林地中變形菌門相對豐度較高，酸桿菌門、綠彎菌門相對豐度較低，不同樣地中存在一定數(shù)量的無法分類的類群。在屬的水平上，退化山核桃林地中，紅游動菌屬 Rhodoplanes，慢生根瘤菌屬 Bradyrhizobium，Rhizomicrobium，長繩菌屬Longilinea，Gp1，Gp2和Gp3為主要類群。在嚴重退化的樣地1和樣地2中，Meniscus和Levilinea相對豐度較高，在輕度退化的樣地3和樣地4中，Gemmatimonas相對豐度高于嚴重退化林地，Rhizomicrobium相對豐度低于嚴重退化林地。生長良好的樣地5和樣地6中的主要類群與退化山核桃林完全不同，Gp6，Sphingomonas，Nitrospira，Gp10，Alcaligenes，Providencia，Pseudomonas和Paenibacillus相對豐度較高，結(jié)果見表4。

2.2 不同山核桃林地土壤細菌Alpha多樣性分析

根據(jù)Alpha多樣性分析顯示（表5），6個樣地Shannon多樣性指數(shù)排序為樣地5＞樣地3＞樣地2＞樣地1＞樣地4＞樣地6，說明樣地5土壤細菌物種多樣性最豐富，6號樣地物種多樣性最低；ACE多樣性指數(shù)排序為樣地1＞樣地3＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6；Chao1多樣性指數(shù)排序為樣地3＞樣地1＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6，說明樣地1和樣地3土壤細菌物種總數(shù)最多，樣地6物種總數(shù)最少。綜合3種多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)山核桃林地土壤細菌多樣性與山核桃退化程度無關(guān)，退化林地的土壤細菌多樣性并不低于正常林地。

表4 不同樣地細菌優(yōu)勢屬相對豐度Table 4 Relative abundance of genera in 6 sample plots

表5 不同樣地土壤細菌Alpha多樣性統(tǒng)計Table 5 Alpha diversity analysis on soil bacteria in 6 sample plots

2.3 土壤理化性質(zhì)與細菌多樣性相關(guān)分析

對不同山核桃林地土壤理化性質(zhì)與細菌多樣性指數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表6。ACE指數(shù)與交換性H+之間呈顯著相關(guān)，其余土壤理化性質(zhì)指標與細菌多樣性指數(shù)均無顯著相關(guān)性。

表6 山核桃林地土壤理化性質(zhì)與細菌多樣性的相關(guān)分析Table 6 Correlation analysis on soil physiochemical properties and bacteria diversity

3 討論

3.1 山核桃林退化與土壤理化性質(zhì)

山核桃林退化是由林地土壤問題導致的。土壤的酸化、養(yǎng)分供應(yīng)不平衡使山核桃的生長受到制約，出現(xiàn)根系、枝條死亡，嚴重退化的林地甚至會出現(xiàn)大量單株枯死的現(xiàn)象。山核桃適宜的土壤pH值通常在6.0左右[7]，本研究中正常林地的pH值分別為5.73和6.08，退化山核桃林地土壤pH值低于正常林地，土壤交換性酸高于正常林地，說明退化林土壤都有一定程度的酸化。表1中堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質(zhì)的數(shù)據(jù)說明，退化林地土壤中氮素積累過多，部分退化林地中磷和鉀不足，有機質(zhì)含量不高。

3.2 山核桃林退化與土壤細菌群落結(jié)構(gòu)

6個樣地中共發(fā)現(xiàn)36門75綱96目224科924屬細菌，在門的水平上，退化山核桃林與正常山核桃林主要類群基本一致，但不同門的相對豐度明顯不同，正常林地中變形菌門相對豐度較高，酸桿菌門、綠彎菌門相對豐度較低，這可能與土壤 pH值相對較高有關(guān)。在屬的分類水平上，退化林與正常山核桃林優(yōu)勢屬差別很大，退化林地細菌優(yōu)勢屬有紅游動菌屬，慢生根瘤菌屬，長繩菌屬等，這些屬在正常林地中不是優(yōu)勢屬。正常山核林樣地之間細菌優(yōu)勢屬也有所不同，可能與2塊樣地土壤類型不同有關(guān)。研究顯示，山核桃林地中還存在許多不能分類的類群，仍需對山核桃林地土壤細菌生態(tài)功能及山核桃生長的作用開展研究，以期通過管理和調(diào)控土壤微生物，為山核桃生長提供良好的土壤環(huán)境，有效解決山核桃林地退化問題。

降香Dalbergia odorifera，香蕉Musa nana，蘋果Malus pumila和白皮松Pinus bunging等植物的土壤中，多樣性較好的土壤微生物群落有利于植物的生長，促進植物營養(yǎng)吸收，增強抗病性[8-12]。本研究中，山核桃林地土壤細菌多樣性與退化程度無關(guān)，生長良好的山核桃林地土壤細菌多樣性也有低于生長不好的林地，可能是林農(nóng)在生長不良的林地內(nèi)施用了更多的化肥，改變了土壤肥力，同時也對土壤細菌多樣性產(chǎn)生了影響。

4 結(jié)論

（1）6個樣地土壤共發(fā)現(xiàn)36門75綱96目224科924屬細菌，在細菌門的水平上，退化與正常山核桃林主要類群基本一致，但不同門細菌相對豐度明顯不同，正常林地中變形菌門相對豐度較高，酸桿菌門、綠彎菌門相對豐度較低。在屬的水平上，生長良好的林地中的主要細菌屬與退化山核桃林差異很大。

（2）Alpha多樣性分析顯示，6個樣地Shannon指數(shù)排序為樣地5＞樣地3＞樣地2＞樣地1＞樣地4＞樣地6，ACE指數(shù)排序為樣地1＞樣地3＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6，Chao1指數(shù)排序為樣地3＞樣地1＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6。

（3）只有ACE指數(shù)與交換性H+之間呈顯著相關(guān)，其余土壤化學性質(zhì)指標與細菌多樣性指數(shù)均無顯著相關(guān)性。

[1] Fierer N，Jackson R B. The diversity and biogeography of soil bacterial communities[J]. Proceed Natl Acad Sci U S A，2006，103（3）：626－631．

[2] Chen Q H，F(xiàn)eng Y，Zhang Y P，et.al. Short-term responses of nitrogen mineralization and microbial community to moisture regimes in greenhouse vegetable soils[J]. 土壤圈（英文版），2012，22（2）：263－272．

[3] 李橋. 基于高通量測序技術(shù)下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[D]. 濟南：山東師范大學，2011．

[4] 曾希柏，王亞男，王玉忠，等. 不同施肥模式對設(shè)施菜地細菌群落結(jié)構(gòu)及豐度的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（1）：69－79．

[5] 張彩霞. 新一代高通量測序技術(shù)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對環(huán)境條件的響應(yīng)[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2012．

[6] 秦楠，栗東芳，楊瑞馥. 高通量測序技術(shù)及其在微生物學研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學報，2011，51（4）：445－457．

[7] 宋素靈. 山核桃林地土壤退化現(xiàn)狀和施肥改良研究[D]. 臨安：浙江農(nóng)林大學，2014．

[8] 楊菁，周國英，田媛嬡，等. 降香黃檀不同混交林土壤細菌多樣性差異分析[J]. 生態(tài)學報，2015，35（24）：8117－8127．

[9] 常顯波，劉舉，等. 不同種植年限蘋果園土壤理化性質(zhì)及微生物數(shù)量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（5）：1423－1426．

[10] 黃珍. 海南福山香蕉地土壤細菌和真菌多樣性分析[D]. 海南：海南大學，2010.

[11] Peck G M，Merwin I A，Thies J E，et.al. Soil properties change during the transition to integrated and organic apple production in a New York orchard[J]. App Soil Ecol，2011，48：18－30.

[12] 賈麗. 珍稀瀕危植物白皮松土壤微生物多樣性研究[D]. 蘭州：西北師范大學，2007.

Comparison on Soil Bacteria Diversity between Degrated and Healthy Carya cathayensis Forests

LI Hao1，DONG Jian-hua1，DONG Jian-ming2，YUAN Zi-qian1，HU Jun-jing1，ZHAO Wei-ming1
（1. Hangzhou Forestry Academy of Zhejiang, Hangzhou 310022, China; 2. Lin'an Forestry Bureau of Zhejiang, Hangzhou 311300, China）

Four sample plots in degraded Carya cathayensis stand and 2 in normal ones were established in October 2014 in Lin’an district, Zhejiang province. Soil samples were sequenced by 16SrDNA for comparison on bacteria community diversity of different sample plots. The results indicated that there were 924 genera of 224 families and 36 phylums, 75 classes, 96 orders in sampled plots. The main phylums were the same in the tested plots, included Proteobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Verrucomicrobia, Actinobacteria and Planctomycetesbut with different relative abundance . The distribution of main genera had great difference between degraded and normal plots. The Shannon index, the ACE index and Chao1 index showed that it had no relationship between degradation of sampled stands with bacteria richness and diversity. Correlation analysis demonstrated that ACE index had evident relation with H+, the other physiochemical properties of the tested had no significant correlation with bacteria diversity index.

Carya cathayensis; degraded; soil bacteria community; 16SrDNA sequencing; diversity

S664.1

A

1001-3776（2017）05-0042-06

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.05.007

2017-03-21；

2017-08-13

浙江省林業(yè)科研成果推廣項目（2013B13）

李皓，工程師，從事經(jīng)濟林研究；E-mail：38761202@qq.com。