杜自強，周進蘇，向秋蓮

(南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院，南京 210008)

輕度胃腸炎伴良性嬰幼兒驚厥患兒的腸道微生物檢測及部分腸黏膜屏障指標觀察

杜自強，周進蘇，向秋蓮

(南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院，南京 210008)

目的探討患兒腸道內(nèi)微生物的變化與輕度胃腸炎伴良性嬰幼兒驚厥(BICE)之間的關系。方法選擇同期收治的BICE患兒50例(A組)、急性輕度胃腸炎患兒50例(B組)以及同期進行體檢的健康兒童50例(C組)，對三組的腸道內(nèi)微生物進行檢測，并對其部分腸黏膜屏障指標進行觀察。結(jié)果A組有24例糞便中檢出輪狀病毒(陽性率為48.00%)，B組有10例糞便中檢出輪狀病毒(陽性率為20.00%)，C組有1例糞便中檢出輪狀病毒(陽性率為2.00%)；組間兩兩相比，P均lt;0.05。 A組糞便中大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量分別為(7.65±2.24)×105、(6.13±2.32)×105、(4.83±1.62)×105、(5.02±1.46)×105CFU/g，B組分別為(8.79±2.31)×105、(7.45±2.28)×105、(6.12±2.47)×105、(5.81±1.86)×105CFU/g，C組分別為(9.87±1.68)×105、(9.12±2.20)×105、(8.35±2.12×105)、(6.82±1.20)×105CFU/g；組間兩兩相比，P均lt;0.05。A組血清二胺氧化酶(DAO)、一氧化氮(NO)、D-乳酸水平分別為(9.84±4.17)U/L、(0.92±0.39)mmol/L、(156.78±48.25)μmol/L，B組分別為(7.49±2.73)U/L、(0.73±0.25)mmol/L、(102.45±40.45)μmol/L，C組分別為(6.35±1.61)U/L、(0.62±0.21)mmol/L、(86.36±30.12)μmol/L，血清DAO、NO、D-乳酸水平組間兩兩相比，P均lt;0.05。結(jié)論BICE患兒腸道內(nèi)輪狀病毒陽性率增高、各類益生菌群數(shù)量降低及腸黏膜屏障能力降低，以上原因可能與BICE的發(fā)病有關，但致病機制尚不明確。

腸道微生物；腸道益生菌群；輪狀病毒；腸黏膜屏障；微生態(tài)；輕度胃腸炎伴良性嬰幼兒驚厥；腸炎

輕度胃腸炎伴良性嬰幼兒驚厥(BICE)是以癥狀進行命名的一種兒科疾病，盡管已經(jīng)進行了多年的研究，但該病的病因尚沒有統(tǒng)一的結(jié)論[1～3]。BICE在兒童罹患胃腸炎的特殊情況下才會出現(xiàn)，其驚厥發(fā)作次數(shù)可以為單次，也可以為多次，一般患兒既往體健，也不會出現(xiàn)中度以上的脫水、電解質(zhì)和酸堿平衡的紊亂以及發(fā)熱的癥狀(體溫≥38 ℃)[4]。目前國際上認為BICE的發(fā)生與腸道內(nèi)微生物的感染有著密切的聯(lián)系，包括病毒與細菌兩個方面。幾乎所有罹患BICE的患兒具有胃腸炎的臨床表現(xiàn)，兒童腸道內(nèi)的微生物可以通過體內(nèi)的腦-腸軸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，所以一般認為兒童腸道內(nèi)的微生物失調(diào)可能對BICE的發(fā)病和進展有著促進作用[5，6]。目前對于罹患BICE的患兒進行腸道內(nèi)微生物檢測的報告很少。本研究對確診的BICE患兒的腸道內(nèi)微生物進行了檢測并對其部分腸黏膜屏障指標進行觀察，探討B(tài)ICE是否與腸道微生物分布變化等因素有關，希望對BICE的病因研究和治療方法的開發(fā)提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年12月1日～2017年2月1日南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院收治的BICE患兒50例(A組：男28例、女22例，年齡8個月～6歲)，同期收治的急性輕度胃腸炎患兒50例(B組：男24例、女26例，年齡9個月～7歲)及進行體檢的健康兒童50例(C組：男25例、女25例，年齡8個月～8歲)。A組納入標準：①既往體健，年齡6個月～3歲；②被確診為輕度胃腸炎伴無熱驚厥，未見電解質(zhì)紊亂；③驚厥發(fā)作單次或多次；④驚厥發(fā)作期腦電圖異常；⑤電解質(zhì)、腦脊液檢查正常。A組排除標準：①合并有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患兒；②合并有先天性心臟病的患兒；③已使用微生物制劑進行治療的患兒。

1.2 糞便輪狀病毒檢測方法 取受檢者稀便約5 mL，置具塞滅菌試管中，若糞便較稠可加入適量生理鹽水混勻。輪狀病毒檢測試條卡以雙抗體夾心法為基礎，利用免疫層析金標記技術，快速檢測糞便中的輪狀病毒抗原，在檢測時一個抗體吸附在硝酸纖維素膜上，另一個抗體結(jié)合在膠體金顆粒表面，當糞便樣本中含有輪狀病毒抗原時，抗原先與硝酸纖維素膜上抗體結(jié)合，然后與金標記抗體反應，形成抗體-抗原-金標記抗體夾心式復合物，呈現(xiàn)出紫紅色沉淀線。將制備好的糞便稀釋液垂直滴加到測試卡上4～5滴，20 min之內(nèi)查看結(jié)果，測試卡出現(xiàn)兩條紫紅色沉淀線則結(jié)果為輪狀病毒陽性，只出現(xiàn)質(zhì)控線(紫紅色)為陰性，如果不出現(xiàn)紅線則無效，重新測試。

1.3 糞便細菌培養(yǎng)及檢測方法 稱取受檢者新鮮糞便0.3 g，10倍稀釋法稀釋，滴注法接種于非選擇性培養(yǎng)基及選擇性培養(yǎng)基上。選擇腸道菌群具有代表性的兩種需氧菌[包括大腸桿菌(EMB培養(yǎng)基)和腸球菌(TTC疊氮鈉培養(yǎng)基)]，以及兩種厭氧菌[包括乳酸桿菌(LBS培養(yǎng)基)和雙歧桿菌(BS培養(yǎng)基)]。需氧菌置37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，厭氧菌置厭氧工作站37 ℃培養(yǎng)48 h，然后觀察計數(shù)，記錄每克糞便所含菌群的數(shù)量。

1.4 腸黏膜屏障指標檢測 所有受檢者抽空腹靜脈血，用分光光度計法測定血清中二胺氧化酶(DAO)，硝酸還原酶法測定血清中一氧化氮(NO)，分光光度計法測定血清中D-乳酸。

2 結(jié)果

2.1 三組輪狀病毒陽性率比較 A組有24例糞便中檢出輪狀病毒(陽性率為48.00%)，B組有10例糞便中檢出輪狀病毒(陽性率為20.00%)，C組有1例糞便中檢出輪狀病毒(陽性率為2.00%)；三組輪狀病毒陽性檢出率相比，χ2=30.037，Plt;0.05；組間兩兩相比，P均lt;0.05。

2.2 三組細菌培養(yǎng)結(jié)果比較 三組糞便大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量相比，F(xiàn)分別為12.358、13.689、11.442、12.268，P均lt;0.05；組間兩兩相比，P均lt;0.05；詳見表1。

表1 三組糞便大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量比較

注：與B組相比，*Plt;0.05；與C組相比，ΔPlt;0.05。

2.3 三組腸黏膜屏障指標比較 三組的DAO、NO、D-乳酸水平相比，F(xiàn)分別為15.158、27.492、25.656，Plt;0.05；組間兩兩相比，P均lt;0.05；詳見表2。

表2 三組DAO、NO、D-乳酸水平比較

注：與B組相比，*Plt;0.05；與C組相比，ΔPlt;0.05。

3 討論

在上個世紀末BICE才被正式命名，經(jīng)過多年的研究，目前對于BICE的認知在世界范圍內(nèi)僅能從患兒的臨床表現(xiàn)和診斷方面達成一定的共識，對于BICE的病因與發(fā)病機制尚缺乏令人信服的結(jié)論，因此對于該疾病治療方法的選擇也大多根據(jù)醫(yī)師的經(jīng)驗決定，沒有可參考的標準[7，8]。本研究對罹患BICE的患兒進行了輪狀病毒感染情況的調(diào)查，結(jié)果表明，BICE患兒糞便輪狀病毒陽性率為48.00%。在已經(jīng)公開的報道[9]中，BICE患兒糞便中輪狀病毒陽性率為43%～57%，與本研究的結(jié)果大致相符。而對于單純性急性腹瀉的患兒，其糞便中輪狀病毒陽性率一般在9%～28%，而健康兒童的輪狀病毒陽性率不超過5%，這與本研究的結(jié)果也一致。上述結(jié)果提示BICE的發(fā)生可能與輪狀病毒的感染有著密切的關系。在國內(nèi)進行的一項研究[10]表明，糞便中輪狀病毒陽性的急性輕度胃腸炎患兒發(fā)生驚厥的概率高于10%，而輪狀病毒陰性的患兒發(fā)生驚厥的概率不超過4%。輪狀病毒引起B(yǎng)ICE的具體機制尚不清楚，需要將來進行深入的研究探討。

本研究結(jié)果顯示，三組患兒的糞便大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量差異均具有統(tǒng)計學意義，而且BICE患兒的菌群數(shù)量最低，正常兒童的菌群數(shù)量最高。此結(jié)果與國內(nèi)已經(jīng)報道[11]的結(jié)果相似。但是以往的研究所選擇的對照僅為健康兒童，本次研究中將健康兒童和單純急性輕度胃腸炎的患兒一起進行比較，所得出的結(jié)果更加明顯。雖然對于導致這種結(jié)果的原因尚不明確，但是大量菌群數(shù)量的降低，確實對于兒童的腸道發(fā)育與健康非常不利。作為導致兒童出現(xiàn)急性胃腸炎的常見微生物，大腸桿菌與其他的主要致病菌保持著相對的平衡，此消彼長，比如在B組和C組中，輪狀病毒的感染率較低，大腸桿菌的數(shù)量就相對上升了。輪狀病毒可以對小腸黏膜和腸上皮細胞造成直接的破壞，使乳糖酶的活性降低，腸道內(nèi)水和電解質(zhì)平衡紊亂，葡萄糖吸收減弱，導致腹瀉。正是因為輪狀病毒對于腸道的破壞作用，使小腸絨毛出現(xiàn)病理性變化，內(nèi)環(huán)境的紊亂導致腸道內(nèi)菌群失調(diào)[12]。但是這種變化是否在其他腸道病毒出現(xiàn)感染的情況下也會發(fā)生，則尚沒有明確答案。而腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌也是腸道內(nèi)重要的益生菌，其數(shù)量在A組患兒中也顯著降低[13]，提示BICE與腸道內(nèi)環(huán)境的紊亂有著密切的聯(lián)系。

人體腸道內(nèi)的菌群構(gòu)成復雜，相互依賴，共生共存，構(gòu)成一個完成的微生態(tài)系統(tǒng)，這個完整的系統(tǒng)形成了生物屏障，并且在屏障的每層有著不同的優(yōu)勢菌[14]，在屏障表層以大腸桿菌和腸球菌為主，在深層以專性厭氧菌為主，厭氧菌帖服在腸道的表面，形成一個固定的菌群。本研究結(jié)果顯示，作為生物屏障最深層的乳酸桿菌和雙歧桿菌，與正常兒童相比，BICE患兒和急性輕度胃腸炎患兒出現(xiàn)了數(shù)量的降低，提示罹患BICE的患兒，其腸道黏膜屏障功能受到了嚴重損害。在這些指標中應該引起關注的主要是NO，正常濃度的NO對于人體的腸道具有一定的保護作用，但是NO的濃度過高，其自身及其代謝產(chǎn)物就會介導腸道黏膜的損傷而導致腸道屏障功能出現(xiàn)障礙，所以臨床上將NO作為腸道屏障功能出現(xiàn)損壞的標志物。NO在體內(nèi)有著很多功能，大劑量的NO有可能導致癲癇發(fā)作。在國外學者[15]的研究中，發(fā)現(xiàn)輪狀病毒陽性的BICE患兒體內(nèi)NO濃度要高于其他可能引發(fā)驚厥的疾病，比如腦膜炎、腦炎等。

BICE屬于一種自限性疾病，患兒驚厥持續(xù)時間比較短，多數(shù)患兒有多次發(fā)作的病史。一般認為針對BICE的治療重點為縮短發(fā)作時間和減少發(fā)作次數(shù)。從本研究的結(jié)果進行推論，適當補充腸道菌群，對于改善BICE患兒的病情或許有著積極的意義，可能對降低NO的水平有一定幫助，但這還需要進行深入的研究探討。

總之，本研究結(jié)果表明， BICE患兒腸道內(nèi)輪狀病毒陽性率增高、各類益生菌群數(shù)量降低及腸黏膜屏障能力降低，這可能與BICE的發(fā)病有關，但致病機制尚不明確，需要進行深入研究。

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