貴陽中醫(yī)學院,貴州 貴陽 550002

實驗研究

大建中湯介導ERK1/2信號通路調控脾陽虛胃癌動物模型MMP-9的表達

何海軍王俊霞*楊毅康繼紅龔小雪

貴陽中醫(yī)學院,貴州 貴陽 550002

目的探討大建中湯對SD大鼠脾陽虛胃癌模型胃癌組織中細胞外調節(jié)蛋白激酶1、2(ERK1、ERK2)、基質金屬蛋白酶-明膠酶(MMP-9)mRNA的影響。方法將健康SD大鼠隨機分為正常組(A)、模型組(B)、大建中湯高、低劑量組(C、D組，給藥劑量為生藥10.8、5.4 g/kg)、西藥對照組(E組，給藥劑量為0.019g/kg)。A組予生理鹽水，1次/d；B、C、D、E組予番瀉葉水浸液灌胃、N -甲基 -N′-硝基 -N -亞硝基胍 (MNNG)儲存液自由飲用，并使其飲食失節(jié)、疲勞過度復制脾陽虛胃癌動物模型。5個月后，B組予生理鹽水，1次/d；C、D組予大建中湯，1次/d；E組予環(huán)磷酰胺，1次/d。15d后，處死大鼠。應用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法，檢測大鼠ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的表達量。結果模型組ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的表達量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大建中湯高、低劑量組、西藥組 ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的量明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論大建中湯可通過調節(jié)ERK1/2信號通路調控MMP-9的表達。

大建中湯；脾陽虛胃癌；ERK1/2信號通絡；MMP-9

胃癌(Gastric Cancer)為消化道常見惡性腫瘤，屬祖國醫(yī)學“癥瘕”、“積聚”等范疇，嚴重影響著人們的生活質量。其形成和瘀血有著密切的關系，而瘀血的產生和人體陽氣的功能失常極其相關。由于陽虛則內寒，體內陰寒之邪偏盛則津液精血的運行遲滯，而成為有形之瘀血，最終形成積塊。如《靈樞·百病始生》原文所述，“積之始生”，歸責于“得寒”和“厥乃成積”。由于脾與胃互為表里，故脾陽虛時，則胃體血管收縮，血行滯澀，極易形成胃部腫瘤。因此，抑制血管收縮成為研究脾陽虛證胃癌的重要靶點。研究擬復制脾陽虛胃癌大鼠模型，探討脾陽虛證胃癌大鼠癌組織中細胞外調節(jié)蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinases 1/2, ERK1/2)、基金金屬蛋白酶-明膠酶(MMP-9)的表達及大建中湯的干預作用。

1 儀器與材料

1.1 動物 清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，體重(200±20)g，許可證號：SCXK(渝)2007-0006，合格證編號：0000128，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供。

1.2 儀器 勻漿器(德國IKA公司)，Multiskan(r) Go酶標儀(Therm Scientific公司)，Legendmicro 21R高速冷凍離心機(Therm Scientific公司)，PCR儀(美國Bio RAD公司)，Chemi DocTM XRS+ with Image LabTM Software化學發(fā)光凝膠成像儀(美國Bio-RAD公司)，DYY-6C型水平電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 造模用藥 番瀉葉(貴陽中醫(yī)學院第一附醫(yī)院)。將番瀉葉水浸過夜，制成濃度為100%的水浸液(每100mL含生藥100g)，同1批藥材，按相同條件，每次制備3d藥量，4℃冰箱保存待用。N-甲基 -N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG，批號：M0526，北京中順華騰生物技術有限公司)。

1.4 治療藥物 ①中藥湯劑組成及制備：大建中湯藥物組成及比例：花椒6g，干姜12g，人參6g，膠飴30g(由貴陽中醫(yī)學院一附院提供,經貴陽中醫(yī)學院藥學院劉育辰副教授鑒定結果均為正品)。取中藥飲片置于玻璃燒杯內，加相當于藥材量6倍的冷蒸餾水浸泡1～2 h，煮沸30 min，紗布過濾取汁，二煎加藥材量的6倍水，沸騰后煎35 min紗布過濾，合并水煎液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮為1.08、0.54 g/mL，同1批藥材，按相同條件，每次制備3 d藥量，4℃冰箱保存待用。②環(huán)磷酰胺水溶液(批號: BZQ1482)：按人和動物折算公式把環(huán)磷酰胺溶于生理鹽水制成含環(huán)磷酰胺1.9 mg/mL冷藏備用，同1批藥材，按相同條件，每次制備3 d藥量。

1.5 檢測試劑盒 超純RNA提取試劑盒(批號：23810G，北京康為世紀科技有限公司)；一步法PCR試劑盒(批號：17613D，北京康為世紀科技有限公司)，引物由上海生工生物科技公司設計合成。

2 方法

2.1 分組與造模 大鼠隨機分為5組，正常組(A)、模型組(B)、大建中湯大劑量組(C)、大建中湯小劑量組(D)、西藥環(huán)磷酰胺組(E)，每組10只。除A組外，B、C、D、E組均參照文獻報道[1]的綜合造模法復制脾陽虛動物模型，然后再予稀釋好的MNNG儲存液100 μg/mL置于棕色瓶中，由大鼠自由飲用4個月，1次/d(在此期間不間斷給予脾陽虛動物模型造模方法的刺激)，復制脾陽虛胃癌動物模型[2]。模型評判標準：大鼠表現出精神倦怠、納呆、消瘦，嗜臥，拱背，扎堆，體重、肛溫下降、大便溏薄或泄瀉，肛周污濁；鏡檢可見胃粘膜內腺體細胞核大而濃染，核漿比例增大，胃粘膜增厚及結節(jié)等表現。

2.2 給藥 正常組、模型組生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)15 d；大建中湯高、低劑量組灌胃大建中湯(10.8、5.4 g/kg)，1次/d；西藥組灌胃環(huán)磷酰胺0.019 g/kg，1次/d。

2.3 標本采集和保存 動物連續(xù)給藥15 d。末次給藥后，動物禁食不禁水12 h，股動脈放血，脫頸處死動物，快速開胸摘取胃于平皿中，生理鹽水漂去血污，沿大彎側縱向剖開，置體視顯微鏡下觀察，剪取胃黏膜異常處胃組織兩塊，液氮凍存，或4%多聚甲醛固定，用于病理檢測和PCR實驗。

2.4 標本測定

2.4.1 總RNA提取 樣品處理：組織：30～50 mg組織充分研磨后加入1 mL buffer RLT；單層培養(yǎng)細胞：吸去培養(yǎng)液，加入適量的buffer RLT，每10 cm2加入1 mL buffer RLT；細胞懸液：離心收集細胞；樣品中加入buffer RL后反復吹打幾次，使樣本充分裂解。置于室溫5min，使蛋白核酸復合物徹底分離；以每1 mL buffer RLT加入200 uL氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，溫室放置2 min；4℃12000 rpm離心10 min，待離心完成后取上層水相，放入新的RNase-Free離心管中；以等體積的比例將70%乙醇(無RNase的水配制)加入得到的上層溶液中，顛倒混勻；將上步所得的溶液全部加入到已裝入收集管(Collection Tube 2mL)的吸附柱(Spin Column RM)中。12000 rpm轉速離心20s，棄去收集管內的廢液，重新將吸附柱放回收集管內；向吸附柱中加入700uL buffer RW1，12000 rpm離心20 s，棄去收集管內的廢液，重新將吸附柱放回收集管內； 向吸附柱中加入500 μL buffer RW2，12000 rpm離心20 s，棄去收集管內的廢液，重新將吸附柱放回收集管內；重復1次；12000 rpm離心2 min，去除收集管中的廢液，另將吸附柱置于室溫數分鐘，以達到徹底晾干；將吸附柱置于1個新的無RNase離心管(collection tube 1.5 mL)中，向吸附柱的中間不為鍵入30～50 uLRNase-Free Water ,室溫放置1 min，12000 rpm離心1 min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

2.4.2 一步法RT-PCR 將RNA模版、引物、onestep RT-PCR Buffer、Onestep RT-PCR EnzymeMix和RNsae-Free Water 溶解并置于冰上備用；配置反應體系；震蕩混勻，再將溶液短暫離心收集到管底；提前開啟熱循環(huán)儀，設置預熱達45℃后，再將PCR管放置于熱循環(huán)儀內，開始RT-PCR體系反應；反應結束后取5 uL產物，加入適量上樣反沖液后進行電泳檢測結果。

3 結果

3.1 一般情況 正常對照組體重與實驗前相比明顯增加，肛溫無明顯變化，其它亦無明顯改變。造模組(模型對照組、大建中湯大劑量組、大建中湯小劑量組、西藥對照組)在造模結束后，有不同的精神倦怠、納呆、消瘦，嗜臥，拱背，扎堆，體重、肛溫下降、大便溏薄或泄瀉，肛周污濁；鏡檢可見胃粘膜內腺體細胞核大而濃染，核漿比例增大，胃粘膜增厚及結節(jié)等表現，符合脾陽虛胃癌大鼠模型評估標準。

3.2 ERK1、ERK2、MMP-9 mRNA表達檢測 由圖1、表1可知，模型組ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的表達量高于正常組(P<0.05)；大建中湯高、低劑量組、西藥組 ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的量明顯低于模型組(P<0.05)。提示：大建中湯可通過調節(jié)ERK1/2信號通路調控MMP-9的表達。

組別劑量/g/kgERK1/GADPHERK2/GADPHMMP9/GADPH正常組-0.83±0.09△0.85±0.19△0.47±0.58△模型組-1.41±0.35*1.83±0.32*2.41±0.99*大建中湯組(高)10.80.85±0.31△*0.90±0.27△*0.59±0.14△*大建中湯組(低)5.40.96±0.28△*0.94±0.12△*0.70±0.63△*環(huán)磷酰胺組0.0190.92±0.42△*0.91±0.25△*0.56±0.35△*

注：與正常組比較,*P<0.05，與模型組比較,△P<0.05。

4 討論

中醫(yī)學認為，“陽氣”是人體生命活動的物質基礎和原動力，人體的氣血津液，皆有賴于陽氣的溫化推動及運化宣暢。陽氣充足則氣血津液得以正常運行，陽氣不足則陰寒內生，終致津液精血的運行遲滯，成為瘀血之邪，最終形成積塊。如《靈樞·百病始生》原文提出“積皆成矣”的病理原因在于“溫氣不行”所造成的“凝血蘊裹而小散”同時伴有“津液灌滲，著而不去”。鑒于脾為中陽，脾之陽氣健旺，氣血津液流動，加之化生有源，則不易形成積聚，且脾與胃互為表里，因此本項目研究脾陽虛陰寒內盛引起血管收縮對胃部腫瘤產生的影響及大建中湯的干預作用。

ERK是促分裂原活化蛋白激酶家族成員，與血管收縮和血管平滑肌細胞的增殖有著密切的關系[3]。研究表明[3]，ERK1、ERK2在細胞質可以調節(jié)血管平滑肌收縮?；钚匝?ROS)作為細胞外和細胞內第二信使可以調節(jié)許多下游信號，細胞外ROS的生成可以導致血管平滑肌細胞ERK1/2通路的激活。研究表明，ERK1/2通路的激活對動脈瘤的形成起著重要作用，抑制ERK1/2有可能抑制動脈瘤的形成[4]。MMPs的蛋白水解對血管重建等起著重要作用，其中MMP-9可分解基底膜Ⅳ型膠原，在體內可經一系列蛋白酶級聯而激活，激活后形成Ⅳ型膠原酶，降解細胞外基質，破壞基底膜的完整，導致腫瘤細胞向周圍組織浸潤并侵入血管和淋巴管向遠處轉移[5]。另外，ROS可以誘導MMP表達，增加腫瘤細胞的侵襲[6]。田氏等[7]研究了不同中醫(yī)證型胃癌組織中MMP-9的表達情況，結果發(fā)現MMP-9在脾胃虛寒型胃癌組織中的含量均高于肝胃不和型及瘀毒內阻型。有研究表明[8]，在MMP-9啟動子區(qū)存在多種轉錄因子結合位點，在這些轉錄因子結合位點之中，其中某些位點可能受ERK調控。

大建中湯有蜀椒、干姜、人參、飴糖組成，具有溫陽散寒，補虛緩急之功，是臨床治療脾陽虛寒的常用方劑。唐朋林等[9]觀察到寒凝血瘀證荷瘤小鼠使用溫陽活血法后，荷瘤小鼠腫瘤轉移肺組織中的ERK1/2得到明顯下調，從而使腫瘤轉移灶生成率降低。楊曉等[10]運用中藥健脾消癌方對大腸癌肝轉移裸鼠模型進行干預，得出裸鼠模型肝組織中MMP-9、TIMP-1表達量明顯下降。從李龍妹等[11]研究證明了扶正抗癌方可以使p-STAT3的蛋白表達水平以及MMP-9蛋白和mRNA的表達水平下調，進一步對PC9細胞的轉移產生抑制作用。研究大建中湯對脾陽虛胃癌腫瘤組織ERK1、ERK2、MMP-9mRNA基因表達的影響，結果表明，脾陽虛證胃癌模型大鼠胃癌組織ERK1、ERK2、MMP-9mRNA表達增加，經大建中湯治療后能明顯降低ERK1、ERK2、MMP-9mRNAmRNA的表達，揭示了大建中湯可能通過介導ERK信號通路調控MMP-9的表達發(fā)揮對脾陽虛證胃癌的防治作用。但是大建中湯通過介導ERK調控MMP-9發(fā)揮作用的途徑還需要進一步深入研究。

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DajianzhongRegulateMMP-9ExpressioninModelRatswithDeficiencyofSpleen-yangGastricCancerbyMediateERK1/2SignalPath

HE Haijun WANG Junxia*YANG yi KANG Jihong GONG Xiaoxue

Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China

ObjectiveTo study the effect of Dajianzhong decoction on ERK1、ERK2、MMP-9mRNA expression in gastric tissue of rats with spleen-yang deficiency gastric cancer.MethodsFifty SD rats were divided five groups by random,including normol group(A), model group(B),Dajianzhong decoction high-dosage group(C),loe-dosage group(D) and western medicine group(E). The A group were given normal saline. The B、C、D、E were to establish rat model. After five month,the B group were given normal saline,the C、D group were given Dajianzhong decoction(10.8、5.4 g·kg-1) every day, the E group were given western medicine(0.019 g·kg-1)every day. After fiften days, all rats were sacrificed to detect ERK1、ERK2、MMP-9mRNA expression .ResultsThe ERK 1、ERK 2、MMP-9mRNA expression of group B was roser than group A(P<0.05)but in group C、D、E was lower than group B (P<0.05).ConclusionDajianzhong decoction can reinforce the expression of ERK1、ERK2、MMP-9mRNA of rats with spleen-yang deficiency gastric cancer.

Dajianzhong decoction; Deficiency of Spleen-Yang Gastric Cancer;ERK1/2 Signaling Pathway; MMP-9

貴州省科技廳課題(黔科合J字[2012]2084號)；貴陽中醫(yī)學院博士基金課題。

何海軍(1985-)，男， 碩士研究生，研究方向為中醫(yī)臨床基礎。E-mail：hehaijun1810sma@163.com

王俊霞(1982-)，女，博士研究生，副教授，研究方向為《金匱要略》方藥的實驗與臨床研究。E-mail:diandian820713@163.com

R285

A

1007-8517(2017)22-0024-04

2017-10-11 編輯：梁志慶)