張秋雪，劉曉嬋，朱宗濤，萬 峰，孫思睿，賈芳芳，孟祥晨*

嬰兒糞便長(zhǎng)雙歧桿菌的分離與多樣性分析

張秋雪，劉曉嬋，朱宗濤，萬 峰，孫思睿，賈芳芳，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

本研究旨在分析嬰兒糞便長(zhǎng)雙歧桿菌的多樣性，采用改良MRS培養(yǎng)基從哈爾濱地區(qū)健康嬰兒糞便中分離雙歧桿菌，采用生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合16S rDNA和熱應(yīng)激蛋白60基因（heat-shock protein 60，hsp60）同源性分析鑒定分離株，利用同源性分析及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技術(shù)進(jìn)一步分析長(zhǎng)雙歧桿菌多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)從11 個(gè)嬰兒體內(nèi)分離得到18 株厭氧的細(xì)菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA測(cè)序及hsp60測(cè)序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，其中7 株為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種，3 株為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。RAPD和MLST結(jié)果表明：7 株長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種為6 個(gè)基因型，3 株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種為2 個(gè)基因型，上述結(jié)果說明不同人源嬰兒糞便長(zhǎng)雙歧桿菌基因型差異較大。

長(zhǎng)雙歧桿菌；熱應(yīng)激蛋白60基因（hsp60）；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）；多位點(diǎn)序列分型（MLST）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）作為腸道有益微生物在保持機(jī)體健康方面起重要作用[1-2]，嬰兒出生后，來自出生環(huán)境、母乳、后天環(huán)境的微生物共同塑造了嬰兒腸道菌群[3-5]，母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道中雙歧桿菌占優(yōu)勢(shì)，但是不同個(gè)體雙歧桿菌種類差異較大，雙歧桿菌多樣性與嬰兒健康之間的關(guān)系目前還不十分清楚，因此對(duì)嬰兒腸道雙歧桿菌多樣性進(jìn)行分析有利于深入了解雙歧桿菌在嬰兒健康中的作用。

人源長(zhǎng)雙歧桿菌（B. longum）包括長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種（B. longum subsp. longum）和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種（B. longum subsp. infantis）[6]。傳統(tǒng)的生理生化和16S rDNA同源性分析對(duì)親緣關(guān)系比較近的物種分辨率不高，而高度保守的熱應(yīng)激蛋白60（heat-shock protein，hsp60）基因，在雙歧桿菌親緣物種鑒定方面則可以提供更為準(zhǔn)確的信息[7]，能彌補(bǔ)16S rDNA同源性分析的不足。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）是研究多樣性經(jīng)常采用的方法，與之相比多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技術(shù)可以更為準(zhǔn)確地區(qū)分分離株的基因型，提供更多的基因信息[8]。一般選擇6～8 個(gè)編碼蛋白的管家基因進(jìn)行測(cè)序，分析等位基因圖譜同時(shí)進(jìn)行聚類分析，根據(jù)位點(diǎn)序列的不同賦予不同菌株序列類型（sequence typing，ST），達(dá)到對(duì)菌株進(jìn)行多位點(diǎn)精確區(qū)分[9]。

本研究擬采集3～6 個(gè)月純母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便，采用純培養(yǎng)技術(shù)分離其中的長(zhǎng)雙歧桿菌，進(jìn)一步利用16S rDNA、hsp60、RAPD和MLST技術(shù)分析分離得到的長(zhǎng)雙歧桿菌多樣性，為深入研究長(zhǎng)雙歧桿菌在嬰兒健康中的作用和功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 微生物菌株

長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種ATCC15707作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

改良MRS（modified MRS，mMRS）培養(yǎng)基（每升添加含0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽和5%乳糖的MRS培養(yǎng)基） 青島海博生物技術(shù)有限公司。

預(yù)還原液：L-半胱氨酸鹽酸鹽3 g/L，大豆蛋白胨2 g/L，121 ℃滅菌15 min[10]。

糞便稀釋液：Na2HPO46 g/L；KH2PO44.5 g/L；L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L；吐溫80 0.5 g/L[11]。

TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、dNTPs、Taq DNA聚合酶 天根生化科技有限公司；引物 吉林省庫美生物科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；乳糖 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LJQ-F2厭氧培養(yǎng)罐 自行設(shè)計(jì)；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BCN1360型生物潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造；微量臺(tái)式離心機(jī)美國Beckman公司；光學(xué)顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 糞便采集與菌株的分離純化

采集哈爾濱地區(qū)3～6 個(gè)月母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒的糞便，糞便采集前嬰兒均未服用過抗生素類藥物，無益生菌服用史，無胃腸病史。取新鮮嬰兒糞便立刻放入加有預(yù)還原液的無菌取樣管中，并放入冰盒內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

將1 g新鮮糞便用糞便稀釋液梯度稀釋，在10-4、10-5、10-6稀釋度下取0.1 μL涂布于mMRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h后挑取凸起、光滑、邊緣水潤的乳白色或白色菌落鏡檢。將呈V、Y或兩端鈍圓的桿狀形態(tài)菌落劃線于mMRS培養(yǎng)基中，進(jìn)行有氧和厭氧培養(yǎng)，剔除需氧和兼性厭氧菌。選取僅厭氧條件生長(zhǎng)并且革蘭氏染色為陽性的菌落，進(jìn)一步劃線厭氧培養(yǎng)純化，直至鏡檢為純菌。

1.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

將1.3.1節(jié)中獲得的分離株分別進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)[12-13]。選擇過氧化氫酶、明膠液化、氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚和硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，并且不運(yùn)動(dòng)的菌株進(jìn)行基因同源性分析。

1.3.3 分離菌株基因同源性分析

1.3.3.1 基因組DNA提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取分離株基因組DNA。

1.3.3.2 分離菌株16S rDNA同源性分析

16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)總體系50 μL：超純水35.5 μL；5×Taq DNA polymerase buffer（含Mg2＋）5 μL；dNTP（2.5 mol/L）4 μL；27F（10 μmol/L）2 μL；1429R（10 μmol/L）2 μL；Taq DNA聚合酶0.5 μL；DNA模板1 μL。其中引物序列27F為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R為5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[14]。

16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；30 個(gè)循環(huán)包括：94 ℃變性30 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸7 min。

1.3.3.3 分離菌株hsp60同源性分析

hsp60基因擴(kuò)增反應(yīng)體系同16S rDNA基因擴(kuò)增體系。其中上游引物為hspF3（5’-ATCGCCAAGGAGATCGAGCT-3’），下游引物為hspR4（5’-ATCGCCAAGGAGATCGAGCT-3’）[15]。

hsp60基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；第1階段4 個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性60 s，62 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s；第2階段21 個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s；第3階段15 個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃延伸7 min[15]。

1.3.3.4 基因擴(kuò)增產(chǎn)物分析

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）完畢之后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行觀察。若16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物獲得約1 500 bp的條帶，hsp60擴(kuò)增產(chǎn)物獲得約650 bp的條帶，且條帶單一清晰無雜帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列運(yùn)用MEGA 6軟件，采用Neighbor-Joining方法，自展值分析設(shè)置1 000 次重復(fù)取樣，對(duì)菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.4 分離菌株多樣性分析

1.3.4.1 RAPD分析

RAPD分析時(shí)選擇4對(duì)引物：A18（5’-AGGTGACCGT-3’）、L16（5’-AGGTTGCAGG-3’）、E14（ 5’-CCAAGCTTCC-3’） 、 OPU10（5’-ACCTCGGCAC-3’）。

RAPD反應(yīng)總體系25 μL：超純水17 μL；5×Taq DNA polymerase buffer（含Mg2＋）3 μL；dNTP（2.5 mol/L）2 μL；引物（10 μmol/L）1 μL；Taq DNA聚合酶1 μL；DNA模板1 μL。

RAPD反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；40個(gè)循環(huán)包括：94 ℃變性1 min，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，在紫外下觀察擴(kuò)增條帶圖譜[16]。

1.3.4.2 MLST分析

等位基因擴(kuò)增體系與16S rDNA基因擴(kuò)增體系相同。其中每個(gè)等位基因所用上下游引物信息如表1所示。

表1 長(zhǎng)雙歧桿菌MLST擴(kuò)增引物Table 1 MLST primers for Bifidobacterium longum

等位基因擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；30 個(gè)循環(huán)包括：95 ℃變性30 s，55 ℃或60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min。其中對(duì)于等位基因ileS和rpoB退火溫度為55 ℃，等位基因clpC、fusA、gyrB、purF、rplB退火溫度為60 ℃[17-18]。

PCR完畢之后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行觀察。若clpC、fusA、gyrB、ileS、PurF、rplB、rpoB條帶單一清晰無雜帶，送檢測(cè)序。

為提高多位點(diǎn)分型效果的準(zhǔn)確性，將等位基因進(jìn)行雙向測(cè)序，采用Chromas軟件打開測(cè)序峰圖驗(yàn)證序列的正確性，并去除測(cè)序起始端與引物結(jié)合不穩(wěn)定的序列[18]。經(jīng)測(cè)序及數(shù)據(jù)處理后，用于MLST分型分析的序列長(zhǎng)度分別為：clpC：603 bp；fusA：666 bp；gyrB：627 bp；ileS：489 bp；purF：591 bp；rplB：357 bp；rpoB：501 bp[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 分離菌株的菌落菌體形態(tài)

從11 個(gè)健康母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到18 株疑似菌株。菌落乳白色或白色、凸起、光滑且邊緣水潤。18 株菌均為革蘭氏染色陽性，菌體排列不規(guī)則，菌體形態(tài)為桿狀，且桿狀末端分叉，呈V或Y字、頓圓、啞鈴等形態(tài)。

2.1.2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

18 株分離株均為專性厭氧菌，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)均為陰性，無運(yùn)動(dòng)性。

2.2 分離菌株的基因同源性分析

2.2.1 16S rDNA同源性

圖1 分離菌株16S rDNA 的PCR電泳圖譜Fig. 1 Electrophotogram of PCR-amplified 16S rDNA from the isolates

18 株分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在1500 bp左右處有明亮單一條帶（圖1），滿足測(cè)序要求。對(duì)18 株分離菌株進(jìn)行測(cè)序，所得序列輸入國家國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示有10 株菌與長(zhǎng)雙歧桿菌的同源性均達(dá)到99%。其余8 株分別為兩歧雙歧桿菌2 株、假小連雙歧桿菌1 株、動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種4 株、短雙歧桿菌1 株。

選取16S rDNA同源性99%以上的模式菌株序列，以Micrococcus luteus DSM 20030（GenBank序列號(hào)：AJ536198）作為16S rDNA基因進(jìn)化樹的根，對(duì)分離得到的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。發(fā)現(xiàn)有7 株菌（H3-R1、H9-5、H10-1、H16-2、H20-14、H27-10、H27-13）均與長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種ATCC15707 16S rDNA親緣關(guān)系最近，初步確定為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種；3 株菌（H5-19、H5-21、H11）與長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC15697 16S rDNA親緣關(guān)系最近，初步確定為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建長(zhǎng)雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of B. longum based on 16S rDNA gene sequences

2.2.2 hsp60同源性分析

上述10 株長(zhǎng)雙歧桿菌的hsp60基因PCR擴(kuò)增后電泳，在650 bp左右處均有明亮單一條（圖3），將樣品進(jìn)行測(cè)序。

圖3 長(zhǎng)雙歧桿菌hsp60基因的PCR電泳結(jié)果Fig. 3 Electrophotogram of PCR-amplified hsp60 gene from the B. longum strains

選取hsp60同源性99%以上的模式菌株序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建無根進(jìn)化樹（圖4）。同樣發(fā)現(xiàn)，7 株菌（H3-R1、H9-5、H10-1、H16-2、H20-14、H27-10、H27-13）與長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種JCM1217的親緣關(guān)系最近，并結(jié)合以上結(jié)果判定為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種；3 株菌（H5-19、H5-21、H11）與長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種JCM1222的親緣關(guān)系最近，并結(jié)合以上結(jié)果判定為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。

圖4 基于hsp60基因序列構(gòu)建長(zhǎng)雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of B. longum based on hsp60 gene sequences

2.3 長(zhǎng)雙歧桿菌多樣性的分析

2.3.1 RAPD分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用4 個(gè)隨機(jī)引物對(duì)10株長(zhǎng)雙歧桿菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次確保引物具有良好的重復(fù)性，以研究其遺傳多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳得到多態(tài)性圖譜（圖5），不同引物的擴(kuò)增片段數(shù)目為1～7 條之間，片段分子質(zhì)量大小在0～1 kb之間。綜合4 個(gè)隨機(jī)引物的擴(kuò)增圖譜可知，長(zhǎng)雙歧桿菌H3-1、H9-5、H10-1、H20-14、H16-2、H11分別具有差異條帶圖譜，屬于不同株型；H27-10和H27-13、H5-19和H5-21具有相同條帶圖譜，屬于同一株型。

圖5 基于引物A18（a）、L16（b）、E14（c）、OPU10（d）的長(zhǎng)雙歧桿菌基因組的RAPD圖譜Fig. 5 RAPD profiles of B. longum genome based on primers A18 (a),L16 (b), E14 (c) and OPU10 (d)

2.3.2 MLST的分析結(jié)果

2.3.2.1 等位基因電泳及測(cè)序

選取7 個(gè)等位基因，運(yùn)用設(shè)計(jì)好的等位基因引物對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌等位基因擴(kuò)增。10 株長(zhǎng)雙歧桿菌的7 個(gè)等位基因均擴(kuò)增成功，且有明亮單一條帶（圖6），滿足測(cè)序要求送樣品進(jìn)行測(cè)序。

圖6 長(zhǎng)雙歧桿菌菌株MLST基因PCR電泳圖Fig. 6 PCR electrophoresis bands of the MLST genes of B. longum

2.3.2.2 長(zhǎng)雙歧桿菌的等位基因分型

以ATCC15707為參考菌株，運(yùn)用7 個(gè)等位基因?qū)?0株長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行MLST分型。去除兩端誤差序列，在7 個(gè)等位基因的等位點(diǎn)上，賦予每個(gè)不同的等位基因以不同的數(shù)值，并指定7 個(gè)等位點(diǎn)中，每個(gè)不同的等位基因模式為一個(gè)ST型。最終將10 株長(zhǎng)雙歧桿菌分為8 個(gè)ST型，且均與ATCC15707為不同的ST型。

表2 長(zhǎng)雙歧桿菌7 個(gè)等位基因的MLST分型Table 2 MLST genotyping of B. longum strains based on seven allelic genes

7 個(gè)等位基因分型結(jié)果如表2所示，7 株長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種分為6 個(gè)基因型，其中菌株H3-R1、H9-5、H10-1、H20-14、H16-2分別屬于不同ST型，而菌株H27-10和H27-13屬于同一ST型。3 株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種分為2個(gè)基因型，其中H5-19和H5-21屬于同一ST型，且與H11為不同ST型。

2.3.2.3 長(zhǎng)雙歧桿菌等位基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將10 株菌的7 個(gè)等位基因序列連接起來（clpC-fusA-gyrB-ileS-purF-rplB-rpoB），拼接長(zhǎng)度約為3 834 bp，對(duì)菌株構(gòu)建聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖7所示，其結(jié)果與RAPD結(jié)果一致，相對(duì)于RAPD技術(shù)，MLST可以通過進(jìn)化樹體現(xiàn)不同株之間進(jìn)化距離關(guān)系。

對(duì)所有長(zhǎng)雙歧桿菌菌株等位基因序列分型結(jié)果可以看出，分離于H5嬰兒個(gè)體的H5-19和H5-21菌株為相同ST型，分離于H27嬰兒個(gè)體的H27-10和H27-13號(hào)菌株為相同ST型。

圖7 長(zhǎng)雙歧桿菌菌株等位基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of B. longum based on allelic genes

3 討 論

本研究在分離菌株分子鑒定中，hsp60基因同源性分析結(jié)果與16S rDNA同源性分析結(jié)果一致，但hsp60基因同源性更進(jìn)一步展示出分離株進(jìn)化距離上的差異[19-20]。從圖4可以看出長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種H3-R1與其他分離菌株及JCM1217之間進(jìn)化距離上存在差異；H5-19、H5-21、H11都在長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種聚類中，但存在進(jìn)化距離的差異，且H5-19與H5-21進(jìn)化距離無差異。此結(jié)果顯示hsp60基因序列分析優(yōu)于16S rDNA基因分析。已有研究表明保守基因hsp60具有高度保守的結(jié)構(gòu)，可以對(duì)雙歧桿菌在種或亞種水平上進(jìn)行鑒定[21]，更能有效地揭示出親緣關(guān)系較高菌株之間系統(tǒng)發(fā)育的差異[22-23]。

長(zhǎng)雙歧桿菌RAPD多樣性分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)雙歧桿菌菌株間擴(kuò)增圖譜存在共有帶，也存在特異性條帶，擴(kuò)增出的譜帶大小及條數(shù)差異可作為區(qū)分各長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的依據(jù)[24]。如引物L(fēng)16擴(kuò)增譜圖（圖5b）在4 000 bp左右所有長(zhǎng)雙歧桿菌均有一條明亮條帶，該條帶可能是長(zhǎng)雙歧桿菌種內(nèi)特征性條帶，在1 000～2 000 bp之間泳道10和11均有一條其他泳道未出現(xiàn)的特異性條帶；引物E14擴(kuò)增譜圖（圖5c）顯示：泳道6與7、泳道10與11條帶相同，除此之外的其余泳道條帶均不相同。

長(zhǎng)雙歧桿菌MLST多樣性分析發(fā)現(xiàn)，單個(gè)等位基因的進(jìn)化樹只能反映物種間進(jìn)化關(guān)系，多個(gè)基因系統(tǒng)發(fā)育分析才能更好地表現(xiàn)物種之間的關(guān)系[25-28]。已有研究結(jié)果表明長(zhǎng)雙歧桿菌在人體中定植的影響因素包括環(huán)境和宿主基因型[29]，這為解釋同一宿主體內(nèi)定植的長(zhǎng)雙歧桿菌具有相同的ST型提供了理論依據(jù)。同時(shí)，不同嬰兒個(gè)體（H3、H5、H9、H10、H11、H16、H20、H27）的長(zhǎng)雙歧桿菌形成了8 個(gè)不同的ST型，也表明長(zhǎng)雙歧桿菌之間存在較大的遺傳多樣性[30]。

綜上所述，本研究從11 個(gè)健康嬰兒體內(nèi)分離鑒定得到10 株長(zhǎng)雙歧桿菌，7 株為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種，3 株為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)：7 株長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種為6 個(gè)基因型，3 株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種為2 個(gè)基因型，說明嬰兒腸道中長(zhǎng)雙歧桿菌存在較大的遺傳多樣性。

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Isolation and Diversity Analysis of Bifidobacterium longum from Infant Faeces

ZHANG Qiuxue, LIU Xiaochan, ZHU Zongtao, WAN Feng, SUN Sirui, JIA Fangfang, MENG Xiangchen*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The aim of this experiment was to study the diversity of Bifidobacterium longum isolated from infant feces.Using modified MRS medium, bifidobacterial strains were isolated from the feces of healthy infants in Harbin. To identify and analyze the diversity of B. longum strains, we used physiological and biochemical experiments, 16S rDNA homology analysis, heat-shock protein 60 gene (hsp60) homology analysis, random amplified polymorphism DNA (RAPD) and multilocus sequence typing (MLST). Eighteen anaerobic strains were isolated, among which, 7 were identified as B. longum subsp. longum, and 3 as B. longum subsp. infantis according to morphology, physical and biochemical properties, 16S rDNA homology analysis and hsp60 homology analysis. The results of RAPD and MLST showed that the 7 strains of B. longum subsp. longum belonged to 6 genotypes while the 3 strains of B. longum subsp. infantis belonged to 2 genotypes. Overall,these results showed that there were differences in the diversity of B. longum isolated from infant feces.

Bifidobacterium longum; heat-shock protein 60 gene (hsp60); random amplified polymorphism DNA (RAPD);multilocus sequence typing (MLST)

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724002

TS201.3

A

1002-6630（2017）24-0008-07

張秋雪, 劉曉嬋, 朱宗濤, 等. 嬰兒糞便長(zhǎng)雙歧桿菌的分離與多樣性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24)∶ 8-14. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724002. http∶//www.spkx.net.cn

ZHANG Qiuxue, LIU Xiaochan, ZHU Zongtao, et al. Isolation and diversity analysis of Bifidobacterium longum from infant faeces[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 8-14. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724002.http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-25

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31671917）

張秋雪（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：zqx823@163.com

*通信作者：孟祥晨（1970—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：xchmeng@163.com