劉文婷，王 偉，易華西*，章檢明，韓 雪，張?zhí)m威，何勝華

乳酸菌細(xì)菌素Lac-B23對(duì)熒光假單胞菌及其生物膜的抑制作用

劉文婷1，王 偉1，易華西2,*，章檢明1，韓 雪1，張?zhí)m威2，何勝華1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100）

細(xì)菌素Lac-B23是由植物乳桿菌Lactobacillus plantarum B23產(chǎn)生的具有廣譜抑菌活性的小分子肽，對(duì)嗜冷腐敗菌熒光假單胞菌具有明顯的抑制作用。細(xì)菌素Lac-B23對(duì)熒光假單胞菌的抑菌作用研究結(jié)果表明，細(xì)菌素Lac-B23可以使熒光假單胞菌胞內(nèi)無(wú)機(jī)磷和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）發(fā)生不同程度的泄漏；細(xì)菌素Lac-B23首先破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞外膜，然后消散了熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)膜跨膜電位（Δφ）和pH值梯度（ΔpH），細(xì)胞外膜滲透性增強(qiáng)，使細(xì)胞膜形成孔道。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡結(jié)果表明熒光假單胞菌細(xì)胞形態(tài)完整性發(fā)生改變，細(xì)胞膜破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)菌素Lac-B23能夠破壞熒光假單胞菌生物膜中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)生物膜具有明顯的破壞作用。

乳酸菌細(xì)菌素；熒光假單胞菌；生物膜；抑制

為保證食品的安全性和延長(zhǎng)食品的貨架期，通常向食品中添加化學(xué)防腐劑來(lái)抑制或殺死病原菌。但是，長(zhǎng)時(shí)間的使用化學(xué)防腐劑可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康產(chǎn)生負(fù)面影響。隨著消費(fèi)者對(duì)食品質(zhì)量與安全意識(shí)的不斷增強(qiáng)，食品行業(yè)正在積極尋找可以替代人工合成的化學(xué)防腐劑。近年來(lái)，乳酸菌細(xì)菌素引起了人們廣泛的關(guān)注，不僅可以作為食品生物防腐劑應(yīng)用于食品加工與貯藏中，而且有希望成為抗生素的替代品[1]。乳酸菌細(xì)菌素作為生物防腐劑，有望實(shí)現(xiàn)最少處理工序來(lái)提高食品質(zhì)量和安全性。Nisin是第一個(gè)商業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素，但Nisin存在抗菌譜窄、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用，尋找廣譜細(xì)菌素已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[2]。

為了更好地開(kāi)發(fā)和利用乳酸菌細(xì)菌素控制食源性病原菌和腐敗菌[3]，需要深入了解細(xì)菌素的作用機(jī)制和抗菌特性[4]。目前大多數(shù)細(xì)菌素抑菌機(jī)理的研究主要是針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌抑菌機(jī)理的研究較少，可能是細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌、霉菌和酵母沒(méi)有抑制作用或作用效果不明顯[5]。細(xì)菌素作用機(jī)制與作用細(xì)菌的種類、生長(zhǎng)條件有關(guān)[6]?；谧饔脵C(jī)制的方法可以提高殺菌效果，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[7]。大多數(shù)乳酸菌細(xì)菌素的主要機(jī)制是形成細(xì)胞膜孔道，導(dǎo)致了細(xì)胞質(zhì)膜電位的變化[8]。也有一些學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)細(xì)菌素結(jié)合于目標(biāo)細(xì)菌的細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)受體時(shí)，這種機(jī)制就會(huì)被引發(fā)，受體蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)菌素有結(jié)合作用[9-10]。目前，細(xì)菌的作用機(jī)理被認(rèn)為主要存在2 種模型。第1種是“barrel-stave”模型（“桶-板”模型），細(xì)菌素疏水部分與細(xì)胞膜的疏水核心互相作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面上孔道的形成[11]。比如植物乳桿菌Lactobacillus plantarum K25產(chǎn)生的細(xì)菌素plantaricin K25作用于蠟樣芽孢桿菌時(shí)，可定位于靶向細(xì)菌細(xì)胞上，在細(xì)胞質(zhì)膜上形成孔洞[12]；第2種機(jī)制是“carpet”模型（“地毯”模型），細(xì)菌素不插入到質(zhì)膜疏水核心，使細(xì)胞膜崩解而不造成孔道的形成。比如細(xì)菌素PlnEF抑制植物乳桿菌L. plantarum pl2的生長(zhǎng)繁殖的作用模式主要是誘導(dǎo)使細(xì)胞膜的通透性增大導(dǎo)致電解質(zhì)流出，PlnEF的積累引起細(xì)胞膜損傷[13]。Goh等[14]利用熒光法發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素會(huì)引起指示菌細(xì)胞膜的破裂。本課題組前期分離獲得了一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的植物乳桿菌L. plantarum B23，并對(duì)其發(fā)酵合成進(jìn)行了研究。嗜冷菌是食品在低溫貯藏下的主要腐敗微生物，可以產(chǎn)生耐熱的蛋白酶或脂肪酶，在食品加工設(shè)備及管道以生物膜形式存在，使得對(duì)加熱、消毒等殺菌方式的耐受性增強(qiáng)，導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)。目前關(guān)于利用乳酸菌細(xì)菌素抑制嗜冷菌及其生物膜形成的研究報(bào)道鮮為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)以典型嗜冷菌熒光假單胞菌為作用對(duì)象，以細(xì)胞內(nèi)外無(wú)機(jī)磷濃度、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）濃度、細(xì)胞外膜滲透性、細(xì)胞跨膜電位、pH值梯度、細(xì)胞外膜完整性以及細(xì)胞形態(tài)為指標(biāo)，從細(xì)胞水平上研究了細(xì)菌素Lac-B23對(duì)熒光假單胞菌及其生物膜的抑菌作用，為細(xì)菌素Lac-B23在食品中的應(yīng)用提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指示菌熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，CGMCC 1.1802）購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，分離自預(yù)過(guò)濾池；植物乳桿菌L. plantarum B23由本實(shí)驗(yàn)室分離自青海耗牛乳（GenBank登錄號(hào)為KC292491.1）。細(xì)菌素Lac-B23由L. plantarum B23的發(fā)酵液經(jīng)SP Sepherose Fast Flow陽(yáng)離子交換柱層析和Superdex Peptide 10/300 GL分子篩進(jìn)行分離純化。細(xì)菌素Lac-B23的最終純化倍數(shù)為2 187.5，質(zhì)量濃度為0.234 mg/mL。

熒光探針BCECF-AM、DiSC3（5） 美國(guó)Sigma公司；纈氨霉素、尼日利亞菌素 美國(guó)Merk Millipore公司；萘氨基苯（N-phenyl-1-naphthylamine，NPN）阿拉丁試劑（上海）有限公司；ATP含量測(cè)定盒、磷（Pi）測(cè)試盒 南京建成生物研究所；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES） 北京Coolaber試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2700熒光分光光度計(jì)、H-7650透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；UV-5100紫外分光光度計(jì) 上海廣譜儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌特性的測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定乳酸菌細(xì)菌素Lac-B23對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性。無(wú)菌條件下在瓊脂培養(yǎng)基中放置5 個(gè)牛津杯，將半固體TSB培養(yǎng)基融化，待其冷卻至50 ℃，加入熒光假單胞菌（接種量1%），將其傾倒到含牛津杯的瓊脂平皿中，冷卻25 min，將牛津杯取出，在形成的孔中加入100 μL發(fā)酵上清液和不同純化處理的乳酸菌細(xì)菌素Lac-B23溶液，28 ℃培養(yǎng)16 h，根據(jù)抑菌圈大小判斷乳酸菌細(xì)菌素Lac-B23抑菌活性。

1.3.2 菌懸液的制備

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的熒光假單胞細(xì)菌，6 000 r/min離心10 min，用緩沖液洗滌2 次后，重新懸浮在緩沖液中，制成108CFU/mL的菌懸液，不同緩沖液的制備如下：

緩沖液1：用于測(cè)定熒光假單胞菌細(xì)胞外膜滲透性的變化，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)含有NaN3（5 mmol/L）的HEPES（5 mmol/L）溶液pH值至7.0[15]。緩沖液2：用于測(cè)定胞內(nèi)外無(wú)機(jī)磷和ATP濃度的變化，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)含有葡萄糖（10 mmol/L）的HEPES（2.5 mmol/L）溶液pH值至7.0。緩沖液3：用于測(cè)定細(xì)胞跨膜電位的變化（Δφ），用40%KOH溶液調(diào)節(jié)含0.6 mmol/L KCl 0.2%葡萄糖的HEPES（50 mmol/L）溶液pH值至7.0。緩沖液4：用于測(cè)定胞內(nèi)外pH值梯度的變化（ΔpH），用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)含有葡萄糖（10 mmol/L）Kpi緩沖液pH值至7.0。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)外無(wú)機(jī)磷濃度的測(cè)定

吸取緩沖液2菌懸液，每份2 mL，靜置90 min，每隔15 min取樣，4 ℃、10 000 r/min離心7 min，吸取上清液測(cè)定細(xì)胞外無(wú)機(jī)磷的濃度；菌體細(xì)胞用1 mL、5 g/100 mL的三氯乙酸懸浮，-20 ℃冷凍過(guò)夜。解凍后，95 ℃溫育10 min。10 000 r/min離心15 min，吸取上清液測(cè)定胞內(nèi)無(wú)機(jī)磷濃度。用磷（Pi）測(cè)試盒比色法（磷鉬酸法）對(duì)無(wú)機(jī)磷濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)外ATP濃度的測(cè)定

吸取緩沖液2菌懸液，每份2 mL，加入100 μL細(xì)菌素Lac-B23，靜置90 min，每隔15 min取樣，4℃、10 000 r/min離心7 min，吸取上清液用于測(cè)定細(xì)胞外ATP濃度；收集菌體用細(xì)胞破碎儀破碎，10 000 r/min離心7 min后，吸取上清液用ATP含量測(cè)定盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP濃度。

1.3.5 細(xì)胞外膜滲透性的測(cè)定

向1.82 mL緩沖液1菌懸液中加入100 μL細(xì)菌素，迅速加入終濃度分別為30、40、50、60 μmol/L的熒光探針NPN，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，確定熒光探針NPN的最適濃度。另取2 份1.82mL緩沖液1菌懸液，分別加入100 μL和50 μL細(xì)菌素，迅速加入最適濃度的熒光探針NPN，檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化。陰性對(duì)照：向1.82 mL菌懸液加入100 μL ddH2O，迅速加入最適濃度的熒光探針NPN。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，使用全掃描模式進(jìn)行掃描，激發(fā)波長(zhǎng)350.0 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420.0 nm，掃描時(shí)間12 min。

1.3.6 細(xì)胞跨膜電位（Δφ）的測(cè)定

Δφ用熒光探針DiSC3（5）進(jìn)行測(cè)定。使用緩沖液3菌懸液，首先加入5 μmol/L纈氨霉素，其目的是為了消除ΔpH對(duì)Δφ的影響。作用30 min，加入5 μmol/L DiSC3（5）作用10min后，加入5 μmol/L纈氨霉素或細(xì)菌素Lac-B23，立即用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，全掃描模式，掃描時(shí)間10 min，激發(fā)波長(zhǎng)622 nm，發(fā)射波長(zhǎng)670 nm。

1.3.7 胞內(nèi)外pH值梯度（ΔpH）的測(cè)定

ΔpH用熒光探針BCECF-AM進(jìn)行測(cè)定。使用緩沖液4菌懸液，取菌懸液2 mL加入10 μL BCECF-AM熒光探針，室溫下靜置5 min。進(jìn)行酸應(yīng)激[16]，加入20～30 μL 0.5 mol/L HCl溶液充分旋渦混合，使探針定位于細(xì)胞內(nèi)。12 000 r/min離心1 min后，可觀察到黃色沉淀。之后，加入1 mL緩沖液洗滌，洗滌4 次后，用2 mL緩沖液懸浮細(xì)菌。加入5 μmol/L纈氨霉素，作用30 min，加入5 μmol/L尼日利亞菌素或細(xì)菌素Lac-B23，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 SEM與TEM分析

將熒光假單胞菌28 ℃培養(yǎng)12 h，菌懸液在4 ℃8 000 r/min離心10 min。菌體細(xì)胞重新懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中，用100 μL細(xì)菌素Lac-B23處理1 h。SEM與TEM處理參照Lü Xin等[17]的方法。細(xì)胞用磷酸緩沖液清洗2 次后，用2.5%戊二醛-磷酸緩沖液重新懸浮固定，4 ℃過(guò)夜。磷酸緩沖液清洗固定的菌體3 次，每次10 min。用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，每次脫水10 min。用100%乙醇和100%丙酮分別處理20min。最后用乙酸異戊酯代替乙醇處理10 min，處理2 次后干燥，用SEM進(jìn)行觀察。

1.3.9 最佳成膜時(shí)間篩選

活化熒光假單胞菌2 次，將載玻片切成1 cm×1 cm大小，用無(wú)水乙醇滅菌，并輔以超聲清洗，去除表面雜質(zhì)后滅菌。將無(wú)菌載玻片置于12 孔板中，加入3 mL無(wú)菌TSB培養(yǎng)基，每孔以2%的接種量將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的熒光假單胞菌接入，并做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，28 ℃分別培養(yǎng)12、24、48 h。以培養(yǎng)12 h為例，其他操作與其相同。從孔板中取出載玻片，注意避免損傷已形成的生物膜，對(duì)照組加入2 mL磷酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)組加入等量的細(xì)菌素，然后在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.10 結(jié)晶紫染色觀察成膜情況

取出孔板中的載玻片，用蒸餾水或磷酸緩沖液洗掉生物膜上的雜質(zhì)，然后將其干燥，在每個(gè)載玻片上滴1滴結(jié)晶紫，15 min后，用蒸餾水或磷酸緩沖液沖洗結(jié)晶紫并使其干燥。然后將干燥的載玻片置于顯微鏡下，在10 倍和40 倍顯微鏡下觀察，然后對(duì)形成的生物膜情況進(jìn)行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以熒光假單胞菌為指示菌，利用瓊脂擴(kuò)散法分別對(duì)L. plantarum B23發(fā)酵上清液、SP Sepherose Fast Flow陽(yáng)離子交換柱與Superdex Peptide 10/300 GL分子篩分離純化的細(xì)菌素Lac-B23組分進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。發(fā)酵上清液顯示出明顯的抑菌活性，隨著純化倍數(shù)的增加，其抑菌活性也隨之增加。

圖1 細(xì)菌素Lac-B23的抑菌實(shí)驗(yàn)Fig. 1 Antibacterial activity of Lac-B23

2.2 細(xì)胞內(nèi)外無(wú)機(jī)磷濃度的變化

圖2 細(xì)菌素Lac-B23對(duì)胞內(nèi)外無(wú)機(jī)磷濃度的影響Fig. 2 Effect of Lac-B23 on intracellular inorganic phosphorus concentration

由圖2可以看出，細(xì)菌素Lac-B23引起熒光假單胞細(xì)菌胞內(nèi)無(wú)機(jī)磷濃度的大幅度下降，相應(yīng)胞外無(wú)機(jī)磷濃度快速增加。無(wú)機(jī)磷在1h內(nèi)降到較低水平，可見(jiàn)細(xì)菌素Lac-B23可以快速引起熒光假單胞菌株胞內(nèi)物質(zhì)的泄露。

2.3 細(xì)胞內(nèi)外ATP濃度的變化

圖3 細(xì)菌素Lac-B23對(duì)胞內(nèi)外ATP濃度的影響Fig. 3 Effect of Lac-B23 on intracellular ATP concentration

如圖3所示，經(jīng)細(xì)菌素Lac-B23作用后的熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)外ATP與無(wú)機(jī)磷濃度變化趨勢(shì)幾乎一致。在15 min內(nèi)ATP濃度急劇下降。1 h后，ATP濃度幾乎降到最低，濃度幾乎不再改變，驗(yàn)證了細(xì)菌素Lac-B23對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜的破壞作用。

2.4 細(xì)胞外膜滲透性的變化

利用NPN攝入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌素破壞革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜的能力[18]。首先確定發(fā)射波長(zhǎng)和NPN的最佳濃度。如圖4所示，固定激發(fā)波長(zhǎng)為350.0 nm時(shí)，不同濃度的NPN溶液均顯示發(fā)射波長(zhǎng)為420.0 nm時(shí)熒光強(qiáng)度最高。因此確定實(shí)驗(yàn)條件為全掃描模式，激發(fā)波長(zhǎng)為350.0 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420.0 nm。當(dāng)NPN濃度為50 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。同時(shí)也顯示并不是NPN濃度越高，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。其原因可能是NPN在細(xì)胞疏水表面達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，其熒光強(qiáng)度不再增加。但當(dāng)NPN濃度為50 μmol/L時(shí)，超過(guò)了有效測(cè)量范圍，所以選擇40 μmol/L NPN-丙酮溶液作為檢測(cè)細(xì)菌素對(duì)細(xì)胞外膜滲透性變化的最終濃度。

圖4 不同濃度NPN所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度Fig. 4 Fluorescence intensity corresponding to different concentrations of NPN

在親水環(huán)境中，NPN分子熒光強(qiáng)度低，當(dāng)它進(jìn)入疏水性環(huán)境，如生物膜，熒光強(qiáng)度迅速升高。通常情況下，NPN被革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜上的脂多糖層隔離在外，但是當(dāng)細(xì)胞外膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后，NPN就可以滲透進(jìn)入細(xì)胞，定位于細(xì)胞外膜的疏水環(huán)境，NPN分子作為一個(gè)典型的能夠研究生物膜特性的靈敏度較高的熒光探針?lè)肿颖粡V泛運(yùn)用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜滲透性的測(cè)定。慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要通過(guò)能量依賴性攝取階段（EDPⅠ和EDPⅡ）進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，從而控制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。NaN3是一種能量抑制劑與KCN的作用相似，可以抑制EDPⅠ和EDPⅡ這2 個(gè)階段。Loh等[15]進(jìn)行慶大霉素的NPN滲透性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)緩沖液中加入NaN3可以有效抑制慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌的破壞作用，使NPN熒光強(qiáng)度保持平穩(wěn)。然而當(dāng)細(xì)菌素Lac-B23作用于熒光假單胞菌時(shí)，緩沖液中加入NaN3并沒(méi)有使熒光強(qiáng)度保持平穩(wěn)，而是逐步下降，說(shuō)明細(xì)菌素的作用機(jī)理與抗生素的作用不同，細(xì)菌素通過(guò)破壞細(xì)胞膜而達(dá)到抑菌的效果。如圖5所示，陰性對(duì)照有較低的熒光強(qiáng)度，因?yàn)榇藭r(shí)熒光假單胞菌的細(xì)胞外膜處于完整的狀態(tài)。將100 μL細(xì)菌素Lac-B23加到細(xì)胞懸浮液后，熒光強(qiáng)度迅速增加，表明細(xì)菌素Lac-B23可以迅速破壞熒光假單胞的細(xì)胞外膜的脂多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的急劇增加。之后熒光強(qiáng)度逐漸下降，說(shuō)明細(xì)菌素Lac-B23在破壞細(xì)胞外膜后，可能進(jìn)一步破壞了細(xì)胞內(nèi)膜導(dǎo)致，細(xì)胞部分裂解，從而使NPN無(wú)法定植在細(xì)胞外膜的疏水環(huán)境中，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。當(dāng)細(xì)菌素Lac-B23的加入量減少一半，熒光強(qiáng)度有所降低，說(shuō)明細(xì)菌素濃度會(huì)影響抑菌效果。

圖5 細(xì)菌素Lac-B23對(duì)細(xì)胞外膜滲透性的影響Fig. 5 Effect of Lac-B23 on extracellular membrane permeability

2.5 細(xì)胞跨膜電位（Δφ）的變化

圖6 細(xì)菌素Lac-B23對(duì)細(xì)胞跨膜電位的影響Fig. 6 Effect of Lac-B23 on transmembrane potential

如果細(xì)胞膜受到破壞，膜電勢(shì)將消散，DiSC3（5）釋放到緩沖液中，可引起熒光量上升[19-20]。如圖6所示，K＋/H＋離子交換劑尼日利亞菌素（5 μmol/L）可以維持最大的Δφ，K＋離子載體纈氨霉素（5 μmol/L）作為陽(yáng)性對(duì)照，可以完全破壞Δφ。加入100 μL的細(xì)菌素Lac-B23后，熒光強(qiáng)度迅速增加，說(shuō)明細(xì)菌素Lac-B23迅速破壞了細(xì)胞膜，膜電勢(shì)消散。將細(xì)菌素Lac-B23的加入量減少一半時(shí)，總體的趨勢(shì)是一致的，但熒光強(qiáng)度下降了，再次證明細(xì)菌素的濃度會(huì)影響對(duì)熒光假單胞菌的破壞程度。

2.6 胞內(nèi)外pH值梯度（ΔpH）的變化

圖7 細(xì)菌素Lac-B23對(duì)細(xì)胞ΔpH的影響Fig. 7 Effect of Lac-B23 on ΔpH

BCECF-AM可以作為一種熒光探針監(jiān)測(cè)跨膜pH值的變化[19-20]。如圖7所示，K＋離子載體纈氨霉素（5 μmol/L）將ΔpH轉(zhuǎn)化成最大ΔpH，K＋/H＋離子交換劑尼日利亞菌素（5 μmol/L）作為陽(yáng)性對(duì)照，可迅速破壞胞內(nèi)外ΔpH。加入100 μL細(xì)菌素Lac-B23后，熒光強(qiáng)度逐漸增加，說(shuō)明細(xì)菌素Lac-B23破壞了細(xì)胞膜，導(dǎo)致跨膜pH值的變化。但這種變化相比較細(xì)菌素對(duì)膜電勢(shì)的變化而言是逐步變化的。將細(xì)菌素Lac-B23的加入量減少一半時(shí)，總體的趨勢(shì)是一致的，但熒光強(qiáng)度仍然下降，表明不同細(xì)菌素濃度會(huì)影響熒光假單胞菌的破壞程度。

2.7 SEM與TEM分析

由圖8A可以看出，正常的熒光假單胞菌具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。從圖8B可以看出，當(dāng)細(xì)菌素Lac-B23作用后，熒光假單胞菌細(xì)胞膜上有多個(gè)孔道形成和胞內(nèi)物質(zhì)收縮，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏到細(xì)胞外，細(xì)菌素Lac-B23可能使細(xì)胞膜形成孔道，導(dǎo)致熒光假單胞菌死亡；從圖9可以看出，經(jīng)細(xì)菌素Lac-B23作用后，有的細(xì)胞膜發(fā)生破碎。因此當(dāng)細(xì)菌素Lac-B23作用后，熒光假單胞菌的細(xì)胞變形、細(xì)胞膜上孔道形成和細(xì)胞滲透性增大與其他報(bào)道的細(xì)菌素相似，例如細(xì)菌素LXA[21]和細(xì)菌素L10[22]。

圖8 熒光假單胞菌TEM圖Fig. 8 TEM observation of Pseudomonas fluorescens

圖9 熒光假單胞菌SEM圖Fig. 9 SEM observation of Pseudomonas fluorescens

2.8 熒光顯微鏡觀察生物膜形態(tài)結(jié)果

圖10 不同質(zhì)量濃度Lac-B23對(duì)熒光假單胞菌生物膜的作用Fig. 10 Effect of Lac-B23 on biofilm formed by Pseudomonas fluorescens

為進(jìn)一步研究細(xì)菌素對(duì)生物膜的影響，觀察生物膜形態(tài)的變化。如圖10所示，對(duì)照組的生物膜在24h形成后具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，更為規(guī)則和平滑，具有蛛網(wǎng)覆蓋的結(jié)構(gòu)，并且形成的生物膜較清晰。結(jié)果與普通顯微鏡觀察到的結(jié)果相似，當(dāng)向生物膜中加入一定量的細(xì)菌素處理24h（實(shí)驗(yàn)組），觀察到生物膜開(kāi)始發(fā)生破裂，形態(tài)變化與對(duì)照組相比較為顯著，生物膜被破碎成小塊并發(fā)生完全崩解。

3 討 論

嗜冷菌污染是現(xiàn)代乳制品加工冷藏中常見(jiàn)的問(wèn)題[23]。目前原料乳中分離出的嗜冷菌多為熒光假單胞菌。本實(shí)驗(yàn)研究了乳酸菌細(xì)菌素對(duì)熒光假單胞菌及其生物膜的抑制作用。細(xì)菌素Lac-B23的作用導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)無(wú)機(jī)磷離子的泄露，釋放ATP，消散了質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)能，增加了細(xì)胞膜的通透性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞膜形成孔道，最終導(dǎo)致細(xì)胞的破碎。SEM和TEM分析表明細(xì)菌素Lac-B23引起了熒光假單胞菌的變形和細(xì)胞膜孔道的形成。這與目前關(guān)于其他細(xì)菌素的研究報(bào)道一致。Herranz等[24]運(yùn)用DiSC3（5）和BCECF-AM發(fā)現(xiàn)Enterocin P可以消散L. monocytogenes的Δφ，但不能破壞其ΔpH。Vasilchenk等[25]使用熒光探針和原子顯微鏡表明由Enterococcus faeciun ICIS產(chǎn)生的一種新型細(xì)菌素的抑菌機(jī)制，該細(xì)菌素通過(guò)改變Escherichia coli和Listeria monocytogenes細(xì)胞膜的通透性而達(dá)到抑菌的效果。Brogdenk等[26]研究了源于Leuconostoc mesenteroides subsp.的Ⅱa類細(xì)菌素Mesenterocin 52A對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌的作用模式，并發(fā)現(xiàn)Mes 52A在細(xì)胞膜的不同位置相互作用，有或沒(méi)有孔形成，暗示Mes 52A可能存在2 種不同的抑菌機(jī)制。Zhao Shengming等[27]研究表明細(xì)菌素Pantaricin JLA-9阻止Bacillus spp.氧化代謝和破壞細(xì)胞膜的完整性來(lái)發(fā)揮抑菌作用。Céliz等[28]為了確定prunin的抗菌潛力，用SEM和TEM來(lái)確定其作用模式。Rybal’Chenko等[29]通過(guò)SEM研究表明，Lactobacillus acidophilus產(chǎn)生的細(xì)菌素作用于Shigella flexneri會(huì)引起其種群和細(xì)胞的形態(tài)變化破壞其結(jié)構(gòu)。Vijayakumar等[30]研究發(fā)現(xiàn)盡可能多地混合不同作用機(jī)制的細(xì)菌素可以獲得強(qiáng)效天然抗菌混合物，以解決熟肉制品容易被L. monocytogenes污染的問(wèn)題。本研究中同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素Lac-B23會(huì)使熒光假單胞菌生物膜崩解，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

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Anti-Biofilm and Antimicrobial Activity of Bacteriocin Lac-B23 from Lactic Acid Bacteria against Pseudomonas fluorescens

LIU Wenting1, WANG Wei1, YI Huaxi2,*, ZHANG Jianming1, HAN Xue1, ZHANG Lanwei2, HE Shenghua1
(1. College of Chemical Engineering and Chemistry, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China;2. School of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)

The aim of this study was to elucidate the mode of action of a novel bacteriocin Lac-B23 from Lactobacillus plantarum B23, a small peptide with broad-spectrum antimicrobial activity, on Pseudomonas fluorescens. P. fluorescens was susceptible to bacteriocin Lac-B23 action, leading to the release of intracellular ATP and inorganic phosphate.Bacteriocin Lac-B23 first destroyed the extracellular membrane and then dissipated both transmembrane potential (Δφ)and transmembrane pH gradient (ΔpH), leading to the formation of channels in the cell membrane. Clear changes in the morphological integrity of P. fluorescens were observed under scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). The cell membrane was destroyed, leading to the death of cells. Bacteriocin Lac-B23 could affect the network structure of the biofilm produced by P. fluorescens and exhibited anti-biofilm activity.

lactic acid bacteria; bacteriocin; Pseudomonas fluorescens; biofilm; inhibition

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724001

TS252.4

A

1002-6630（2017）24-0001-07

劉文婷, 王偉, 易華西, 等. 乳酸菌細(xì)菌素Lac-B23對(duì)熒光假單胞菌及其生物膜的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24)∶1-7. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724001. http∶//www.spkx.net.cn

LIU Wenting, WANG Wei, YI Huaxi, et al. Anti-biofilm and antimicrobial activity of bacteriocin Lac-B23 from lactic acid bacteria against Pseudomonas fluorescens[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 1-7. (in Chinese with English abstract)

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724001. http∶//www.spkx.net.cn

2017-04-26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571850；31771988）；中國(guó)海洋大學(xué)“青年英才工程”項(xiàng)目（201712002）

劉文婷（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。E-mail：1280896605@qq.com

*通信作者：易華西（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：yihx@ouc.edu.cn