宋 佳，張 娜，李 晶，毛相朝，薛長(zhǎng)湖，唐慶娟

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探究新瓊四糖對(duì)過度疲勞性腸道損傷的保護(hù)作用

宋 佳，張 娜，李 晶，毛相朝，薛長(zhǎng)湖，唐慶娟*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

目的：運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究新瓊四糖對(duì)過度疲勞性腸道損傷的保護(hù)作用。方法：雄性BALB/c小鼠被隨機(jī)分為正常組、力竭運(yùn)動(dòng)組、陽(yáng)性對(duì)照低聚果糖組和新瓊四糖干預(yù)組，連續(xù)喂養(yǎng)16 d后，取小鼠結(jié)腸組織，應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)結(jié)腸組織RNA進(jìn)行完全測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果：過度疲勞引起小鼠結(jié)腸腫瘤標(biāo)志物Zfp521和Zmynd8等鋅指蛋白表達(dá)量極顯著增加（p＜0.01）、抑癌因子Casz1、Zfp346等的表達(dá)顯著降低（p＜0.05），新瓊四糖可緩解過度疲勞造成的腸道損傷，下調(diào)腫瘤相關(guān)鋅指蛋白的表達(dá)，上調(diào)抑癌鋅指蛋白的表達(dá)。結(jié)論：新瓊四糖可保護(hù)腸道、緩解過度疲勞引發(fā)的腸道損傷、預(yù)防腫瘤的發(fā)生。

新瓊四糖；過度疲勞；鋅指蛋白；RNA-seq；低聚果糖

現(xiàn)代人生活工作壓力大，過度勞累且缺少充分休息已成為常態(tài)。過度疲勞損傷器官組織、降低機(jī)體免疫力[1]，尤其會(huì)破壞腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、損傷腸道組織屏障、增加患病風(fēng)險(xiǎn)性。緩解過勞損傷，保障健康，已成為社會(huì)關(guān)注熱點(diǎn)。在眾多保健方法中，食療更健康、溫和，因此，功能食品研究便快速發(fā)展起來。

傳統(tǒng)的功能食品開發(fā)方法具有研究深入、目標(biāo)明確的優(yōu)勢(shì)，但是其所涉及的功能面窄、開發(fā)效率低下?；诠δ苄允称肪峭ㄟ^影響組織或細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白代謝水平等生理活動(dòng)實(shí)現(xiàn)其保健功效的本質(zhì)，研究者通過整體把握生物體內(nèi)所發(fā)生的事件、事件間的相關(guān)性及其對(duì)所涉及生物過程的意義，便能發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)功效。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目的有效工具。通過研究活細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型和拷貝數(shù)[2]，研究者能從RNA水平上詮釋組織或細(xì)胞內(nèi)的生物過程及其所執(zhí)行的功能。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)早已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品等研究領(lǐng)域，為探究食品功能的作用機(jī)理提供了有效指導(dǎo)，但極少用于發(fā)掘活性物質(zhì)的新功能。

低聚糖是關(guān)注度極高的功能性成分，具有益生元功能，可改善腸道菌群帶來降血脂、降膽固醇、增強(qiáng)免疫力等多種功效[3]。新瓊寡糖（neoagarooligosaccharides），是海藻中提取的多糖——瓊膠，降解而來的低聚糖[4]，利于人體吸收。新瓊寡糖的功能性研究剛剛起步，被認(rèn)為是一種有效的益生元[5]，有探索潛力。近年來，新瓊寡糖的制備工藝逐步得到提升，開發(fā)新瓊寡糖的新功能具有重要意義。

本研究以力竭運(yùn)動(dòng)小鼠構(gòu)建過度疲勞模型，以公認(rèn)的益生元——低聚果糖為陽(yáng)性對(duì)照，采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探究新瓊四糖對(duì)過度疲勞性腸道損傷的保護(hù)作用。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等多項(xiàng)功能，在腫瘤發(fā)生和機(jī)體免疫異常方面是有效的指示標(biāo)志物[6]。過度疲勞引發(fā)體內(nèi)多種腫瘤標(biāo)志鋅指蛋白表達(dá)異常增加，本實(shí)驗(yàn)研究新瓊四糖對(duì)腫瘤標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響，探究其保護(hù)機(jī)體、預(yù)防結(jié)腸腫瘤發(fā)生的功效，為功能食品研究提供新思路，并為新瓊四糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

BALB/c小鼠（SPF級(jí)，雄性，4～6 周齡，體質(zhì)量18～22 g） 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001）。

低聚果糖（純度＞9 5%）、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）處理水 北京索萊寶科技有限公司；RNAase-free DNase Ⅰ 日本寶生物有限公司；乙醇、異丙醇（均為化學(xué)純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nanodrop 2000c超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Agilent公司；Miseq測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；YLS-10B小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀 山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院；薄層層析板 德國(guó)Merck公司；基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of fl ight，MALDI-TOF）質(zhì)譜儀美國(guó)AB SCIEX公司；超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型建立

雄性BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組，每組8 只，即正常組（N）、模型組（M，即力竭運(yùn)動(dòng)小鼠）、陽(yáng)性對(duì)照低聚果糖組（FOS）、新瓊四糖組（NAT）。小鼠自由攝食，室內(nèi)溫度保持21～24 ℃，相對(duì)濕度達(dá)到40%～55%，空氣流通，每日光照時(shí)間達(dá)12 h。正常組灌胃后自由活動(dòng)，不做過度疲勞干預(yù)；模型組、低聚果糖組和新瓊四糖組，利用小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀給予力竭運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)速20 r/min，首日運(yùn)動(dòng)3 h，次日運(yùn)動(dòng)2 h，連續(xù)運(yùn)動(dòng)2 d，間歇5 d。按照相同的力竭運(yùn)動(dòng)計(jì)劃持續(xù)16 d（3 次運(yùn)動(dòng)）。低聚果糖組和新瓊四糖組在處理周期16 d內(nèi)分別灌胃150 mg/（kg·d）的低聚果糖和新瓊四糖，模型組同正常組均灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 瓊脂糖制備

瓊脂糖由本課題組自行制備[7]。首先提取到瓊膠酶的基因，將其與質(zhì)粒pET-21（a+）構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21，實(shí)現(xiàn)瓊膠酶基因的重組原核表達(dá)，制備獲得重組瓊膠酶agWH50A。瓊膠酶和0.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖混合，加入50 mmol/L KH2PO4-NaOH緩沖液（pH 7.0），于30 ℃孵育12～48 h。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)下的酶解液進(jìn)行薄層色譜分析，結(jié)果表明，反應(yīng)僅產(chǎn)生一種寡糖產(chǎn)物。再對(duì)酶解液進(jìn)行4 ℃離心，去除多余瓊膠酶，取上清液凍干即得寡糖粉末。對(duì)純化的寡糖粉末以2,5-二羥基苯甲酸為輔助基質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF檢測(cè)，得其分子質(zhì)量為653 D，與四糖分子質(zhì)量相吻合（四糖630 D+Na+23 D，以及四糖630 D+K+39 D），證明是四糖。13C NMR分析顯示在化學(xué)位移δ 93、97處有顯著信號(hào)，結(jié)合文獻(xiàn)[8]推斷四糖的還原末端為半乳糖，上述兩處信號(hào)分別對(duì)應(yīng)半乳糖游離異頭碳的α-、β-構(gòu)象，由此表明所得寡糖為新瓊寡糖。

1.3.3 提取結(jié)腸組織RNA

取小鼠結(jié)腸組織（約0.1 g），加入1 mL Trizol試劑，進(jìn)行勻漿處理，勻漿液轉(zhuǎn)入EP管并靜置5 min后，加入0.2 mL氯仿（純度≥99.0%）充分混勻，靜置10 min以沉淀蛋白。之后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇溶液，充分混勻，室溫放置10 min以沉淀RNA。4 ℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清液，沉淀加入1 mL 75%的預(yù)冷乙醇，用滅酶槍頭溫和吹打進(jìn)行清洗。4 ℃、10 000 r/min離心5 min后吸棄上清液，沉淀于室溫條件下靜置晾干。根據(jù)沉淀產(chǎn)量添加適量DEPC處理水，充分溶解沉淀，即得到總RNA樣品。采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品含量，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品純度。

1.3.4 RNA-seq測(cè)序技術(shù)

1.3.4.1 RNA純化、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

RNA-seq測(cè)序參照文獻(xiàn)[9]的方法略有調(diào)整。采用Trizol試劑將組織中的全部RNA片段提出后，加入RNAase-free DNaseⅠ去除其中可能污染的基因組DNA。磁珠法提取mRNA并打碎成片段，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成雙鏈cDNA。依據(jù)Illumina工作手冊(cè)構(gòu)建mRNA-seq文庫(kù)。測(cè)序在Illumina HiSeq2000平臺(tái)上進(jìn)行，得到140 bp雙末端進(jìn)行讀長(zhǎng)。

1.3.4.2 基因拼接注釋

原始讀長(zhǎng)中去除含有載體或測(cè)序引物、含有多個(gè)N和低質(zhì)量的讀長(zhǎng)。通過Trinity進(jìn)行序列拼接。每個(gè)亞組分中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本，被稱之為unigene，用于功能注釋。4 組所有拼接得到的unigene，通過非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（nonredundant protein database）、非冗余序列（nonredundant nucleotide sequences）和SwissProt，運(yùn)用BLAST算法以E值10-5為限搜索，同時(shí)在真核生物的同源蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)以E值10-3為限進(jìn)行查找。Pfam蛋白家族聚類通過HMMER 3.0進(jìn)行。每個(gè)基因模型的GO聚類和KEGG聚類分別通過BLAST2GOv2.5、KASS和KEGG自動(dòng)注釋服務(wù)器完成。

1.3.4.3 基因表達(dá)分析

每個(gè)樣品中的單個(gè)基因無冗余讀長(zhǎng)，通過和Trinity轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)，以RSEM為準(zhǔn)則對(duì)匹配的讀長(zhǎng)總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。經(jīng)PRKM法篩選得到的匹配讀長(zhǎng)，通過歸一化計(jì)算處理，得到全部基因豐度。讀長(zhǎng)總量采用TMM法均一，組間差異表達(dá)分析采用DEGseq軟件進(jìn)行分析。GO和KO豐度分析均基于已識(shí)別的差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量控制

采用1.3.3節(jié)方法提取各組小鼠結(jié)腸組織RNA，各組OD260nm與OD280nm比值均介于1.9～2.2之間。4 組RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜由圖1可知，28S亞基和18S亞基條帶清晰，且各組RIN值均大于8，表明RNA完整，可用作轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析。測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建過程中，RNA均被打碎成（142.00±5.00）bp的片段（正常組（142.30±32.60）bp、模型組（1 4 5.6 0±3 2.7 0）b p、低聚果糖組（144.90±33.20）bp、新瓊四糖組（145.50±32.60）bp，均小于200 bp），可實(shí)現(xiàn)深度測(cè)序。采用DESeq2換算系數(shù)對(duì)原始讀取數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化制作MA圖（圖2），統(tǒng)計(jì)各組基因的表達(dá)情況。MA圖用來圖形化展示基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換成M和A的值，M為log2（fold change），其中fold change指兩組表達(dá)量的比值變化，A為平均表達(dá)值。MA圖以M作為y軸，A作為x軸，圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因。由圖2可知，模型組對(duì)正常組小鼠的每個(gè)基因平均標(biāo)準(zhǔn)化counts的變化值，模型組引起基因差異表達(dá)數(shù)量較大，1 053 個(gè)基因顯著變化。

圖1 各組小鼠結(jié)腸提取的RNA瓊膠糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total colon RNA from all mouse groups

圖2 模型組對(duì)正常組小鼠的基因MA圖Fig. 2 MA plot of M vs N

2.2 過度疲勞對(duì)腸道基因表達(dá)的影響

分析過度疲勞小鼠結(jié)腸組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，研究基因表達(dá)情況。通過和基因文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，模型組中18 804 個(gè)表達(dá)基因的名稱及功能得到確認(rèn)。其中2 987 個(gè)基因顯著表達(dá)（p＜0.05），44.66%基因表達(dá)上調(diào)（fold change≥1.10，其中22.67%的基因fold change＞1.2），35.99%的基因表達(dá)下調(diào)（fold change≤0.90，其中5.79%基因fold change＜0.8）。在眾多基因中，有89 個(gè)基因確定為鋅指蛋白家族基因（p＜0.05，|1－fold change|≥0.05），為顯著表達(dá)中所含個(gè)體最多的一類蛋白（表2）。其中，有20 個(gè)鋅指蛋白功能集中在腫瘤相關(guān)方面（圖3c，p＜0.05），12 個(gè)鋅指蛋白促進(jìn)腫瘤增殖或在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量增加[10-19,28-29]（圖3c，以下稱腫瘤正相關(guān)蛋白），6 個(gè)鋅指蛋白可抑制腫瘤增殖或在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[20-25]（圖3c），2 個(gè)鋅指蛋白可能與腫瘤有關(guān)，表達(dá)的改變尚不明確或因環(huán)境而變[26-27]。通過比較模型組和低聚糖（包括低聚果糖組和新瓊四糖組，后同）組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低聚糖引起的模型組中表達(dá)量改變的基因個(gè)體，和模型組對(duì)正常組基因引起表達(dá)改變的基因個(gè)體有重合（圖3a，p＜0.05，|1－fold change|≥0.05），進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，模型組中上調(diào)的基因，在低聚糖組中會(huì)發(fā)生下調(diào)；模型組中下調(diào)的基因在低聚糖組中會(huì)發(fā)生上調(diào)（圖3b，p＜0.05，|1－fold change|≥0.05）。因而提出過度疲勞引發(fā)腫瘤相關(guān)的鋅指蛋白表達(dá)的改變，低聚糖通過影響此類蛋白的表達(dá)保護(hù)機(jī)體。在低聚果糖組中，25 種顯著變化的鋅指蛋白中有9 種，即Zfp521、Zfr、Zmynd8、Zbtb38、Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp512、Zmat2均涉及腫瘤發(fā)生（圖3b）。鋅指蛋白Zfp521，在小鼠B細(xì)胞過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血癌的發(fā)生[10]，模型組中其表達(dá)上調(diào)1.2 倍（P＝0.004）。Kuroyanagi等[11]發(fā)現(xiàn)Zmynd8可促進(jìn)斑馬魚前列腺腫瘤中的血管生成，Lin Xiao等[12]將腫瘤特異性內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)脫離腫瘤環(huán)境的細(xì)胞中仍存在Zfp503的過表達(dá)，認(rèn)為Zfp503可作為哺乳動(dòng)物癌癥的穩(wěn)定信號(hào)，孟瑩瑩等[13]發(fā)現(xiàn)ZBTB38在卵巢漿液性囊腺癌等癌癥中有較高程度的擴(kuò)增。上述2 種鋅指蛋白Zmynd8和Zfp503，模型組中其表達(dá)量均上調(diào)（P值分別為7.56×10-5和0.009），上調(diào)程度均為1.20 倍。

表2 模型組小鼠結(jié)腸中表達(dá)顯著的蛋白Table 2 Top ten proteins signif i cantly differentially expressed in colon tissues of model mice

圖3 各組結(jié)腸基因表達(dá)韋恩圖及熱圖Fig. 3 Venn map and heat map showing gene expression in colon tissues from different groups

新瓊四糖組中，11 種顯著變化的鋅指蛋白涉及腫瘤增殖、神經(jīng)傳遞、T細(xì)胞免疫等多種功能，其中有5 種，即Zmynd12、Zfp521、Zmynd8、Zfr、Zbtb7c鋅指蛋白與腫瘤形成相關(guān)。模型組中，前3 種鋅指蛋白顯著過表達(dá)，上調(diào)程度分別為1.23、1.20 倍和1.20 倍。對(duì)于這些在模型組中表達(dá)顯著增加的腫瘤正相關(guān)鋅指蛋白，新瓊四糖和低聚果糖都表現(xiàn)出抑制或緩解增加的作用，提示它們可能具有抵抗腫瘤發(fā)生的功效，值得進(jìn)一步研究。

2.3 轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)預(yù)測(cè)低聚糖功能特性的可行性分析

如圖3b所示，低聚果糖的加入抑制了腫瘤正相關(guān)鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。鋅指蛋白Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp521、Zmat2、Zbtb38、Zfr、Zmynd8表達(dá)量均顯著降低（p＜0.05），且相較于模型組，表達(dá)量下降不低于10%（圖4和圖3b）。Zfp521是編碼一種含有N端轉(zhuǎn)錄抑制基序的轉(zhuǎn)錄因子，在軟骨細(xì)胞中間接靶向Cyclin D1，推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入到S期。鋅指蛋白Zfr[17]，作為一種哺乳動(dòng)物體內(nèi)高保留的RNA-binding轉(zhuǎn)錄因子，也可作用于細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)。

圖 4 低聚果糖和新瓊四糖對(duì)腫瘤增殖相關(guān)的鋅指蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of FOS and NAT on the expression of zinc fi nger proteins related to tumor proliferation

圖5 低聚果糖和新瓊四糖對(duì)抑癌因子及周期蛋白表達(dá)的調(diào)控作用Fig. 5 Effect of FOS and NAT on the expression of tumor suppressors and cyclin proteins

如圖5所示，模型組Cyclin A1、Cyclin A2、Cyclin D1表達(dá)顯著上調(diào)（fold change分別為1.25、1.22、1.33，p＜0.05，p＜0.01），在低聚果糖組其表達(dá)均與模型組相比極顯著降低（fold change分別為 0.84、0.82、0.86，p＜0.01）。該結(jié)果提示，低聚果糖可能通過影響鋅指蛋白，間接抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，延緩細(xì)胞進(jìn)程，從而降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，低聚果糖對(duì)抑癌因子有促表達(dá)作用。Casz1和Zfp346是重要的抑癌鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中，Casz1通過抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，激活其分化成正常功能細(xì)胞，而減少細(xì)胞的數(shù)量，阻止其擴(kuò)散[20]。模型組中Casz1的表達(dá)顯著降低（p＜0.05），顯著上調(diào)Casz1蛋白的表達(dá)（P＝4.99×10－3）。Zfp346，又稱為JAZ[21]，通過介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡來抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)。細(xì)胞周期蛋白是與真核細(xì)胞的細(xì)胞周期呈同步周期性濃度升降的蛋白質(zhì)，包括S期周期蛋白Cyclin A，G1期周期蛋白Cyclin C、Cyclin D、Cyclin E和M期周期蛋白Cyclin B。Yang Mingli等[22]發(fā)現(xiàn)JAZ抑制了A型周期蛋白，但對(duì)E型周期蛋白和D型周期蛋白沒有顯著影響。Dallal等[10]則發(fā)現(xiàn)Zfp521敲除后D型周期蛋白表達(dá)減少，腫瘤癥狀減輕。低聚果糖降低了Zfp346、Cyclin A、Cyclin D（圖5）周期蛋白的表達(dá)，但對(duì)Cyclin E型周期蛋白（數(shù)據(jù)未顯示）沒有顯著影響。

2.4 新瓊四糖對(duì)鋅指蛋白基因表達(dá)的影響

圖6 低聚果糖和新瓊四糖對(duì)鋅指蛋白基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of FOS and NAT on the expression of zinc fi nger proteins

由圖6可知，與低聚果糖組相似，鋅指蛋白基因Zfp521、Zmynd8、Zfr在新瓊四糖組中與模型組相比也呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(shì)（fold change分別為0.88、0.89、0.92，p＜0.05，p＜0.01）。Zmynd12為轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞異化生成腫瘤時(shí)過表達(dá)[16]，模型組基因表達(dá)量為正常組的1.23 倍（p＜0.01）。新瓊四糖組與模型組相比其表達(dá)顯著降低（fold change為0.93，p＜0.05 ）。除此之外，對(duì)于其他腫瘤正相關(guān)鋅指蛋白均有下調(diào)的影響趨勢(shì)（圖4），同時(shí)增加了抑癌因子的表達(dá)。抑癌因子Casz1和Zfp346的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)明顯被抑制（fold change為0.91），對(duì)Cyclin A1、Cyclin A2也起到抑制效果（圖5）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠力竭運(yùn)動(dòng)模擬過度疲勞損傷，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)提取基因信息。通過對(duì)基因表達(dá)變化信息的分析，從獲得的眾多數(shù)據(jù)中，鎖定鋅指蛋白，發(fā)現(xiàn)多種結(jié)腸組織腫瘤標(biāo)志物鋅指蛋白表達(dá)異常。鋅指蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，可以激活相關(guān)靶基因的表達(dá)，執(zhí)行相應(yīng)功能。模型組中促進(jìn)腫瘤發(fā)生或腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著增加的一類鋅指蛋白表達(dá)的一致性增加，提示組織內(nèi)細(xì)胞增殖活動(dòng)加強(qiáng)，腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)性增加。低聚果糖是功能豐富的低聚糖，已有文獻(xiàn)證明其有減肥、抗炎等眾多功效[3]，本實(shí)驗(yàn)中，以低聚果糖作為樣本，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)功能預(yù)測(cè)分析方法的建立。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，低聚果糖通過抑制腫瘤增殖鋅指蛋白Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp521、Zmat2、Zbtb38、Zfr、Zmynd8的表達(dá)，激活抑癌因子基因Casz1和Zfp346表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞分化進(jìn)程，而減少細(xì)胞數(shù)量，延緩腫瘤增殖趨向，展現(xiàn)了其對(duì)腫瘤的抵抗?jié)摿Α６饲坝形墨I(xiàn)證明其確有抗腫瘤、抗癌功效[30-32]。這提示轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法可用于預(yù)測(cè)活性物質(zhì)的功能，低聚果糖功能預(yù)測(cè)結(jié)果和文獻(xiàn)[30-32]成果相吻合便是很好的佐證。

新瓊四糖作為一種新型益生元，其功能尚未完全闡明，用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行功能性研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)顯著增加的腫瘤正相關(guān)鋅指蛋白Zfp521、Zmynd8和Zfr等有明顯的抑制作用，并且同樣促進(jìn)了抑癌因子Casz1、Zfp346表達(dá)量的增加，降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)性，起到有效預(yù)防保護(hù)作用。為確定此功效及作用機(jī)制，仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。此外，新瓊四糖也引起炎癥等鋅指蛋白表達(dá)的改變，提示其可能具有抗炎功效。

綜上所述，本研究嘗試建立轉(zhuǎn)錄組技術(shù)輔助功能成分功效預(yù)測(cè)新方法，為功能食品研究提供了技術(shù)參考。采用此方法對(duì)新瓊四糖進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)過度疲勞引發(fā)的腸道損傷具有保護(hù)作用，預(yù)防腫瘤的發(fā)生，挖掘新瓊四糖的潛在價(jià)值，為未來的研究提供方向。

[1] 郭婷婷. 過度疲勞狀態(tài)下連續(xù)負(fù)重游泳大鼠心肌Bax、Bcl-2、LDH-2變化規(guī)律的研究[D]. 成都: 成都體育學(xué)院, 2015: 9-16.

[2] 陳梅麗. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究人腫瘤細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和大熊貓基因組重注釋[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所, 2013: 15-25.

[3] 陳臣. 植物乳桿菌ST-Ⅲ全基因組序列分析及其對(duì)低聚果糖代謝通路的解析[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2014: 16-19.

[4] 胡斌. 新瓊寡糖的益生元效應(yīng)研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2006:1-15. DOI:10.7666/d.y989172.

[5] 劉美英, 梅建鳳, 易喻, 等. 瓊膠寡糖生物活性的研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù), 2008, 15(6): 493-496. DOI:10.3969/j.issn.1005-8915.2008.06.019.

[6] 李榮平, 李偉毅. 鋅指蛋白在免疫學(xué)研究中的進(jìn)展[J]. 免疫學(xué)雜志,2009, 25(3): 357-360. DOI:10.13431/j.cnki.immunol.j.20090096.

[7] LIU N, MAO X, DU Z, et al. Cloning and characterisation of a novel neoagarotetraose-forming-β-agarase, AgWH50A from Agarivorans gilvus WH0801[J]. Carbohydrate Research, 2014, 388: 147-151.DOI:10.1016/j.carres.2014.02.019.

[8] LAHAYE M, YAPHE W, VIET M T P, et al.13C-NMR spectroscopic investigation of methylated and charged agarose oligosaccharides and polysaccharides[J]. Carbohydrate Research, 1989, 190(2): 249-265.DOI:10.1016/0008-6215(89)84129-1.

[9] SUN Z, CHEN Y, DU J, et al. Elevated CO2improves lipid accumulation by increasing carbon metabolism in Chlorella sorokiniana[J]. Plant Biotechnology Journal, 2015, 14(2): 557-566.DOI:10.1111/pbi.12398.

[10] DALLAL S A, WOLTON K, HENTGES K E. Zfp521, promotes B-cell viability and cyclinD1, gene expression in a B cell culture system[J]. Leukemia Research, 2016, 46: 10-17. DOI:10.1016/j.leukres.2016.03.013.

[11] KUROYANAGI J, SHIMADA Y, ZHANG B, et al. Zinc finger MYND-type containing 8 promotes tumour angiogenesis via induction of vascular endothelial growth factor-A expression[J]. FEBS Letters,2015, 589(7): 870-870. DOI:10.1016/j.febslet.2014.07.033.

[12] LIN Xiao, HARRELL J C, PEROU C M, et al. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro[J]. Angiogenesis, 2014, 17(3): 1-8. DOI:10.1007/s10456-013-9409-y.

[13] 孟瑩瑩, 許興智, 廖薊. 轉(zhuǎn)錄因子ZBTB家族與腫瘤[J]. 生命科學(xué),2015, 27(4): 477-485. DOI:10.13376/j.cbls/2015062.

[14] SUN M P, THORNTON A, VU L P, et al. IKZF2, a novel target of MSI2 RNA-binding protein plays an oncogenic role in myeloid leukemia[J]. Blood, 2015, 126(23): 440.

[15] TAMURA K, FURIHATA M, TSUNODA T, et al. Molecular features of hormone-refractory prostate cancer cells by genome-wide gene expression profiles[J]. Cancer Research, 2007, 67(11): 5117-5125.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-06-4040.

[16] CHAUHAN L, JENKINS G D, BHISE N, et al. Genome-wide association analysis identif i ed splicing single nucleotide polymorphism in CFLAR predictive of triptolide chemo-sensitivity[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1): 1-18. DOI:10.1186/s12864-015-1614-1.

[17] ZHAO X L, CHEN M, TAN S. Knockdown of ZFR suppresses cell proliferation and invasion of human pancreatic cancer[J]. Biological Research, 2016, 49: 26. DOI:10.1186/s40659-016-0086-3.

[18] LEE D, WALSH M J, AGUILO F, et al. ZNF217/ZFP217 meets chromatin and RNA[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2016, 41(12):986. DOI:10.1016/j.tibs.2016.07.013.

[19] CHUDNOVSKY Y, KIM D, ZHENG S Y, et al. ZFHX4 interacts with the NuRD core member CHD4 and regulates the glioblastoma tumorinitiating cell state[J]. Cell Reports, 2014, 6(2): 313-324. DOI:10.1016/j.celrep.2013.12.032.

[20] LIU Z, YANG X, LI Z, et al. CASZ1, a candidate tumor-suppressor gene, suppresses neuroblastoma tumor growth through reprogramming gene expression[J]. Cell Death and Differentiation, 2011, 18(7): 1174-1183. DOI:10.1038/cdd.2010.187.

[21] YANG M, WU S, SU X, et al. JAZ mediates G1 cell-cycle arrest and apoptosis by positively regulating p53 transcriptional activity[J]. Blood, 2006, 108(13): 4136-4145. DOI:10.1182/blood-2006-06-029645.

[22] YANG Mingli, WU Song, JIA Jinghua, et al. JAZ mediates G1 cell cycle arrest by interacting with and inhibiting E2F1[J]. Cell Cycle,2011, 10(14): 2390-2399. DOI:10.4161/cc.10.14.16587.

[23] 劉悅芳. 原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因的研究[D]. 南京: 南京醫(yī)科大學(xué), 2008: 22-128. DOI:10.7666/d.y1331518.

[24] YESTEVELASCO M, MAO X, GROSE R, et al. Identification of ZDHHC14 as a novel human tumour suppressor gene[J]. The Journal of Pathology, 2014, 232(5): 566-577. DOI:10.1002/path.4327.

[25] WONG J C, GOKGOZ N, ALON N, et al. Cloning and mutation analysis of ZFP276 as a candidate tumor suppressor in breast cancer[J].Journal of Human Genetics, 2003, 48(12): 668-671. DOI:10.1007/s10038-003-0088-1.

[26] 成紅霞. ZBTB蛋白家族成員-ZBTB9的生物學(xué)功能初探[D]. 蘇州:蘇州大學(xué), 2012: 1-7. DOI:10.7666/d.y2134070.

[27] TAN L P, SEINEN E, DUNS G, et al. A high throughput experimental approach to identify miRNA targets in human cells[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 37(20): 137. DOI:10.1093/nar/gkp715.

[28] YANG L, ZHANG L, WU Q, et al. Unbiased screening for transcriptional targets of ZKSCAN3 identifies integrin β4 and vascular endothelial growth factor as downstream targets[J]. Journal of Biological Chemistry,2008, 283(50): 35295-35304. DOI:10.1074/jbc.M806965200.

[29] CHENG W S, TAO H, HU E P, et al. Both genes and lncRNAs can be used as biomarkers of prostate cancer by using high throughput sequencing data[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences, 2014, 18(22): 3504-3510.

[30] HUXLEY R R, WOODWARD M, CLIFTON P. The epidemiologic evidence and potential biological mechanisms for a protective effect of dietary fi ber on the risk of colorectal cancer[J]. Current Nutrition Reports, 2013, 2(1): 63-70. DOI:10.1007/s13668-012-0030-2.

[31] BRUNO-BARCENA J M, AZCARATE-PERIL M A. Galactooligosaccharides and colorectal cancer: feeding our intestinal probiome[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 12(12): 92-108.DOI:10.1016/j.jff.2014.10.029.

[32] PIERRE F, PERRIN P, CHAMP M, et al. Short-chain fructo-oligosaccharides reduce the occurrence of colon tumors and develop gut-associated lymphoid tissue in min mice[J]. Cancer Research, 1997, 57(2): 225-228.

Protective Effect of Neoagarotetraose against Over-Exhaustion-Induced Gut Injury in Mice Revealed by RNA-Seq

SONG Jia, ZHANG Na, LI Jing, MAO Xiangzhao, XUE Changhu, TANG Qingjuan*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Purpose: To explore the protective effect of neoagarotetraose against over-exhaustion-induced gut injury by RNA-seq analysis. Methods: Male BALB/c mice were randomly divided into normal control group,over-exhaustion model group (both the groups were gavaged with saline), over-exhaustion plus fructooligosaccharide (FOS)group (positive control), and over-exhaustion plus neoagarotetraose (NAT) group. After sixteen days of administration,colon tissues from the mice in each group were collected, and then RNA was extracted for RNA-seq analysis. Results:Over-exhaustion resulted in signif i cantly increased expression of zinc fi nger proteins Zfp521 and Zmynd8, associated with inflammation and tumor proliferation (P ＜ 0.01), and significantly reduced expression of tumor suppressors Casz1 and Zfp346 (P ＜ 0.05). NAT could relieve over-exhaustion-induced gut injury by downregulating the expression of zinc fi nger proteins related to tumor proliferation and upregulating the expression of tumor-suppressing zinc fi nger proteins. Conclusion:NAT can protect against over-exhaustion-induced gut injury in mice and prevent the occurrence of tumors.

neoagarotetraose; over-exhaustion; zinc fi nger protein; RNA-seq; fructooligosaccharide

10.7506/spkx1002-6630-201723022

TS201.4

A

1002-6630（2017）23-0135-06

宋佳, 張娜, 李晶, 等. 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探究新瓊四糖對(duì)過度疲勞性腸道損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23):135-140.

10.7506/spkx1002-6630-201723022. http://www.spkx.net.cn

SONG Jia, ZHANG Na, LI Jing, et al. Protective effect of neoagarotetraose against over-exhaustion-induced gut injury in mice revealed by RNA-seq[J]. Food Science, 2017, 38(23): 135-140. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723022. http://www.spkx.net.cn

2016-10-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271923）；國(guó)家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1406402）

宋佳（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：nianhua_letter@163.com

*通信作者：唐慶娟（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：tangqingjuan@ouc.edu.cn