倪麗娟，張白曦，陳 衛(wèi)，張 灝

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

生物工程

解脂耶氏酵母β氧化基因敲除菌的構(gòu)建及揮發(fā)性脂肪酸的利用

倪麗娟，張白曦，陳 衛(wèi)，張 灝

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

為了抑制解脂耶氏酵母長鏈脂肪酸的β氧化，使其穩(wěn)定地積累，通過基因調(diào)控途徑構(gòu)建了4株脂肪酸β氧化基因敲除菌株，并研究了重組菌株利用揮發(fā)性脂肪酸作為碳源合成長鏈脂肪酸的能力。結(jié)果表明：分別敲除pox2、pox3和pex10的3株單基因敲除菌株及同時敲除pox2和pox3的組合基因敲除菌株構(gòu)建成功，4株重組菌株均可以利用揮發(fā)性脂肪酸進(jìn)行生長。與原始菌株相比，polf-Δpox2Δpox3和polf-Δpex10總脂產(chǎn)量(長鏈脂肪酸總和)在發(fā)酵后期并未因脂肪酸的β氧化而出現(xiàn)明顯下降，是可以利用揮發(fā)性脂肪酸且可實現(xiàn)脂質(zhì)積累的重組菌株。

解脂耶氏酵母；β氧化；長鏈脂肪酸；揮發(fā)性脂肪酸

由于解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)具有生物合成相關(guān)的生理生化特性及成熟的分子操作系統(tǒng)，目前已開發(fā)用作有機酸、蛋白酶以及單一脂質(zhì)的生產(chǎn)菌[1]。作為一種典型的產(chǎn)油真菌，解脂耶氏酵母能夠積累大量的脂質(zhì)，主要以甘油三酯(TAG)和甾醇酯(SE)等中性脂的形式儲存在脂質(zhì)體中[2]。因此，解脂耶氏酵母的潛在應(yīng)用是合成具有生理活性功能的長鏈多不飽和脂肪酸，如γ-亞麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、EPA、DHA等[3]。目前，解脂耶氏酵母積累的脂質(zhì)占細(xì)胞干重的38%[4]，且脂質(zhì)會被降解利用，為了進(jìn)一步提高其穩(wěn)定積累脂質(zhì)尤其是長鏈脂肪酸的能力，本實驗通過基因調(diào)控手段構(gòu)建了4株切斷脂肪酸β氧化途徑的菌株，分別為polf-Δpox2、polf-Δpox3、polf-Δpox2Δpox3和polf-Δpex10菌株，其中pox基因是催化脂肪酸β氧化第一步限速步驟的6種?；o酶A的基因，pox2和pox3基因編碼的酰基輔酶A對長鏈脂肪酸具有底物特異性[5-6]，Δpox2和Δpox3可以抑制菌株對長鏈脂肪酸的降解作用；而pex10基因編碼蛋白參與過氧化物酶體基質(zhì)蛋白的運輸[7-9], 敲除pex10會導(dǎo)致過氧化物酶體變形受損，切斷脂肪酸的β氧化，從而積累更多的脂肪酸[10]。

解脂耶氏酵母可以利用正烷烴、脂肪酸和脂肪等多種形式的碳源進(jìn)行生長。為了降低實驗產(chǎn)脂成本，本實驗采用廉價的揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)作為唯一碳源對菌株進(jìn)行初步培養(yǎng)，比較不同重組菌株利用VFAs的差異性，實驗還測定了菌株的生物量和總脂產(chǎn)量(長鏈脂肪酸總和)，以亟選出可利用廉價碳源且積累脂質(zhì)的目標(biāo)菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌(DH5α)由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫提供；質(zhì)粒pBluescriptⅡKS+(DH5α)購自NEB公司；質(zhì)粒pINA1296(DH5α)[11]、pUB4-Cre (DH5α)[12]以及解脂耶氏酵母(polf)[13]由Catherine Madzak教授(法國)惠贈。

1.1.2 主要試劑

Taq酶、T4連接酶以及所需限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司； pfu酶、無縫克隆試劑盒均購自北京全式金；脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品以及酵母轉(zhuǎn)化試劑(PEG4000、DTT、DMSO、Trizma、EDTA等)購自Sigma公司；氨芐青霉素、卡那霉素、潮霉素B均購自上海生工。ura minus培養(yǎng)基、leu minus培養(yǎng)基購自北京泛基諾。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，需要時添加瓊脂粉20 g/L、卡那霉素50 mg/L、氨芐青霉素100 mg/L，以篩選帶有抗性的轉(zhuǎn)化子。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖 0 g/L，酵母提取物 10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 6.5，需要時添加瓊脂粉20 g/L。

YNB-leu培養(yǎng)基：leu minus 培養(yǎng)基 8 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0～6.5，需要時添加瓊脂粉20 g/L。

YPG培養(yǎng)基：D-L半乳糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L,需要時添加瓊脂粉20 g/L，潮霉素B用于轉(zhuǎn)化子篩選。

YNBD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母氮基(無氨基酸、無(NH4)2SO4)1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 5.5，需要時添加瓊脂粉 20 g/L，用于轉(zhuǎn)化子篩選。

YPO液體培養(yǎng)基：酵母提取物 10 g/L，胰蛋白胨 20 g/L，油酸10 g/L，pH 6.5。

YPV液體培養(yǎng)基：VFAs(乙酸、丙酸與丁酸質(zhì)量比為6∶1∶3[14])5.0 g/L，代替YPD中的葡萄糖，酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 6.5。

1.1.4 實驗儀器

GS00001型PCR儀(G-STROM公司)；Power PAC核酸電泳儀(Bio-Rad公司)；Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；NanoDrop2000分光光度計(Thermo公司)；GC-2010氣相色譜儀(島津公司)；氣質(zhì)聯(lián)用儀(Varian公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

參照Fickers等[12]方法，具體如下：

(1)構(gòu)建ML組件，以質(zhì)粒pINA1296(DH5α)為模板擴增leu2標(biāo)記基因，并連接在LPR組件(金斯瑞公司合成)loxR和loxP之間。構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含氨芐青霉素的 LB平板，挑選轉(zhuǎn)化子，酶切及PCR驗證正確后測序。

(2)構(gòu)建側(cè)翼片段啟動子-終止子組件，以polf為模板，分別擴增目標(biāo)基因pex10上下游片段P和T，并連接到載體pBluescriptⅡKS+(DH5α) 上，將構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并挑選單克隆，PCR以及測序驗證，得到重組載體PT-pex10。同理構(gòu)建PT-pox2，PT-pox3。

(3)構(gòu)建PLT組件，利用內(nèi)切酶I-SceI分別酶切質(zhì)粒ML、PT-pex10，T4連接酶將產(chǎn)物連接，構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并進(jìn)行篩選鑒定，得到載體PLT-pex10。同理構(gòu)建PLT-pox2，PLT-pox3。

1.2.2 敲除菌株的構(gòu)建

參照Fickers等[12]方法，具體如下：

(1)單基因敲除菌株的構(gòu)建：PCR擴增PLT敲除組件醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至出發(fā)菌株polf, 涂布于選擇性平板YNB-leu，3組PCR及測序驗證正確重組子，得到重組菌株polf-Δpex10、polf-Δpox2、polf-Δpox3。

(2)雙基因敲除菌株的構(gòu)建：以polf-Δpox2為出發(fā)菌株, 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PUB4-Cre，在YPG 培養(yǎng)基中半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)Cre酶切除leu2基因，驗證切除正確后，在YPD培養(yǎng)基中連續(xù)傳代丟失質(zhì)粒PUB4-Cre, 再轉(zhuǎn)入敲除pox3基因的PLT-pox3組件，在YNBD培養(yǎng)基中篩選，PCR驗證及測序正確，得到重組菌株polf-Δpox2Δpox3。

1.2.3 生長曲線測定

不同發(fā)酵時間點取樣，以空白培養(yǎng)基為對照，利用分光光度計測定發(fā)酵液在600 nm處的吸光度，以發(fā)酵時間為x軸，OD600為y軸繪制菌株生長曲線。

1.2.4 培養(yǎng)基中殘留VFAs的測定及分析

采用乙醚衍生化方法預(yù)處理并利用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定，具體參考賈益群等[15]的方法。

1.2.5 菌體生物量的測定

全發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用0.85%的NaCl溶液洗滌菌體2次，冷凍干燥，稱量干菌重，減去胞內(nèi)脂質(zhì)總量，即為生物量。

1.2.6 菌體脂質(zhì)提取及分析

菌體脂肪酸含量的測定參照文獻(xiàn)[16]，實驗所提到的總脂(TFA)為長鏈脂肪酸總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除質(zhì)粒的驗證

本實驗使用Cre-lox方法可以定向切除營養(yǎng)標(biāo)記，以保證標(biāo)記基因可以重復(fù)利用[12]。酶切驗證見圖1。

注：M.Marker；A(PLT-pex10).1為敲除質(zhì)粒，2為SphI和 NotI雙酶切后片段；B(PLT-pox2).1為敲除質(zhì)粒，2為EcoRI單酶切后片段；C(PLT-pox3).1為敲除質(zhì)粒，2為ApaI單酶切后片段。

圖1敲除質(zhì)粒酶切驗證結(jié)果

由圖1可知，理論序列長度與實驗?zāi)z電泳結(jié)果一致，且測序結(jié)果與理論值相同，證明敲除質(zhì)粒PLT-pex10、PLT-pox2、PLT-pox3構(gòu)建成功。

2.2 單基因敲除菌株的驗證

PLT敲除組件利用leu2作為標(biāo)記基因通過同源重組分別刪除1 100 bp pex10 ORF、2.1kb pox2 ORF、1 100 bp pox3 ORF序列，得到polf-Δpex10、polf-Δpox2、 polf-Δpox3重組菌株。重組菌株一般培養(yǎng)2 d即形成菌落，轉(zhuǎn)化率1 200～1 500個/μg。實驗設(shè)計了3對引物以充分排除假陽性菌株存在：①上游引物F1在P片段中，下游引物F2在leu2 CDS序列以證明敲除片段整合到基因組上；②上游引物L(fēng)1在P片段上游，下游引物L(fēng)2在leu2 CDS序列以證明敲除片段整合到目的基因位點；③上游引物R1在P片段中，下游引物R2在敲除基因CDS序列以證明目的基因不存在基因組。單基因敲除菌株3組PCR驗證結(jié)果見圖2。

注: M.Marker； A(polf-Δpox2). F1中pox2-F1/F2為引物，L1中pox2-L1/L2為引物，R1中pox3-R1/R2為引物；B(polf-Δpox3).F2中pox3-F1/F2為引物，L2中pox3-L1/L2為引物，R2中pox3-R1/R2為引物；C(polf-Δpex10).F3為pex10-F1/F2為引物，L3為pex10-L1/L2為引物，R3為pex10-R1/R2為引物；Ⅰ.假陽性菌株；Ⅱ.正確敲除菌株；Ⅲ.陽性對照菌株polf-pINA1296，下同。

圖2單基因敲除菌株3組PCR驗證結(jié)果

由圖2可知，相對于Ⅰ系列假陽性菌株，Ⅱ系列菌株敲除組件整合到目的基因的位點，是正確基因交換的轉(zhuǎn)化子polf-Δpox2。綜上，polf-Δpex10、polf-Δpox2、 polf-Δpox3 3株缺陷型菌株構(gòu)建成功。

2.3 pox2和pox3雙基因敲除菌株的驗證

在polf-Δpox2菌株基礎(chǔ)上再敲除pox3基因，實驗需要先切除polf-Δpox2菌株中的標(biāo)記基因leu2，即轉(zhuǎn)入Cre酶表達(dá)質(zhì)粒使2個lox位點發(fā)生重組來切除標(biāo)記基因。Cre表達(dá)質(zhì)粒帶有潮霉素B抗性，所以首先要確定菌株對潮霉素B抗性質(zhì)量濃度，為300 μg/mL。polf-Δpox2Δpox3重組菌株P(guān)CR驗證結(jié)果見圖3。

由圖3A1可知，9個轉(zhuǎn)化子在500 bp左右均有條帶，說明Cre表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入。由圖3A2可知，相對于陽性對照菌，9株菌在1 500 bp處均沒有條帶，說明YPG培養(yǎng)基誘導(dǎo)Cre重組酶表達(dá)，切除leu2基因。之后將重組菌在YPD培養(yǎng)基中傳代5～10次，丟失Cre表達(dá)質(zhì)粒。得到菌株polf-Δpox2/leu-，在此菌株上轉(zhuǎn)入PLT-pox3敲除組件以敲除pox3基因。由3對引物的PCR圖譜(圖3B)可知，相對于Ⅰ系列假陽性菌株，Ⅱ系列菌株是正確基因交換的轉(zhuǎn)化子。因此，polf-Δpox2Δpox3雙基因敲除菌株構(gòu)建成功。

注: A1.轉(zhuǎn)入Cre表達(dá)質(zhì)粒驗證；A2.leu2切除后驗證;B(polf-Δpox2Δpox3).F2中pox3-F1/F2為引物，L2中pox3-L1/L2為引物，R2中pox3-R1/R2為引物；Ⅰ為假陽性菌株；Ⅱ為正確敲除菌株；Ⅲ為陽性對照菌株polf-pINA1296;M.Marker；NC.陰性對照；PC.陽性對照。

圖3polf-Δpox2Δpox3重組菌株P(guān)CR驗證結(jié)果

2.4 基因敲除菌株培養(yǎng)基水平鑒定

以油酸為唯一碳源在相同條件下分別培養(yǎng)5株重組菌株，對基因敲除菌株培養(yǎng)基水平進(jìn)行鑒定，其生物量水平見表1。

表1 菌株在 YPO中生物量

由表1可知，polf-Δpox2、polf-Δpox3、 polf-Δpox2Δpox3均可以利用油酸作為碳源進(jìn)行生長，但利用油酸的能力有差異，相對于陽性對照菌株生物量分別減少了0.6、2.5、4.6 g/L。而polf-Δpex10不能利用油酸，這說明敲除pex10基因切斷了油酸的β氧化。這與前人實驗結(jié)果一致[10]。因此，推測polf-Δpex10對于脂質(zhì)的積累效果更好。

2.5 基因敲除菌株生長特性分析

基因敲除對酵母細(xì)胞的生長情況具有一定的影響[17]，為了比較不同重組菌株的生長特性，本文對其生長曲線分別進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，基因敲除菌株在生長初期生長速度較慢，且進(jìn)入穩(wěn)定期時間也較正常菌株延遲了5 h左右，這說明基因的敲除使得酵母的生長能力減弱。其中polf-Δpex10菌株達(dá)到穩(wěn)定期的OD600為11，低于其他菌株，主要是因為該菌株敲除的基因是過氧化物酶體相關(guān)因子，使得菌株的細(xì)胞器過氧化物酶體受損[9]。因此，pox2和pox3基因的敲除影響了菌株的生長速度，而pex10基因的敲除使菌體的生長速度和菌體總量都受到了干擾。

圖4 菌株生長曲線

2.6 基因敲除菌株利用揮發(fā)性脂肪酸的能力分析

來源于食品廢棄物以及各種可生物降解有機廢棄物中的VFAs作為一種潛在的廉價碳源可以替代葡萄糖用于產(chǎn)油微生物積累脂質(zhì)。耶氏解脂酵母能夠利用VFAs作為唯一碳源進(jìn)行生長，胞內(nèi)乙酰輔酶A合成酶將VFAs直接轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，然后用于脂肪酸的生物合成[14]。但是VFAs初始質(zhì)量濃度若高于5 g/L將對菌體生長產(chǎn)生抑制效應(yīng)[14, 18-19]，因此本實驗在培養(yǎng)基中添加5 g/L的VFAs替代YPD中的葡萄糖進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。結(jié)果見圖5。

由圖5可知，5株菌株在YPV液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均可以利用VFAs作為唯一碳源進(jìn)行生長。polf-Δpox2、polf-Δpox2Δpox3和陽性對照菌株在發(fā)酵72 h左右VFAs基本耗盡，而polf-Δpex10、polf-Δpox3在接近發(fā)酵末期時出現(xiàn)此現(xiàn)象，說明pox3、pex10基因的敲除影響了解脂耶氏酵母對短鏈脂肪酸的吸收利用，這主要是由于pox3基因表達(dá)的?；o酶A(Aox3)對短鏈脂肪酸(C4～C10)有活性[20]；而pex10基因調(diào)控的是過氧化物酶體(脂肪酸β氧化的場所)的合成因子，基因敲除后影響了重組菌株利用短鏈脂肪酸能力。

圖5 菌株在YPV培養(yǎng)基中VFAs含量

菌體利用VFAs的效率不同，其生物量和總脂產(chǎn)量也有所區(qū)別，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，菌體生物量均隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先增長后穩(wěn)定的趨勢，polf-Δpox3菌株的生物量明顯低于其他菌株，為6.0 g/L左右。總脂方面，polf-Δpox2，polf-Δpox3總脂產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間延長先增長后下降，表明pox2、pox3基因分別敲除不能抑制脂肪酸的β氧化作用；而polf-Δpox2Δpox3、polf-Δpex10總脂產(chǎn)量在達(dá)到最高點之后下降的趨勢并不明顯，分別穩(wěn)定在0.4 g/L和0.3 g/L左右。主要由于pox2和pox3基因的雙敲除抑制菌株對胞內(nèi)長鏈脂肪酸的降解[20]，而pex10的敲除破壞了過氧化物酶體，抑制了菌株對胞內(nèi)脂肪酸的利用[10]。

3 結(jié) 論

本實驗成功構(gòu)建了4株解脂耶氏酵母β氧化基因敲除菌株。其中polf-Δpex10相對于另外3株菌株，生長能力較弱，且無法在油酸培養(yǎng)基上生長。說明pex10基因敲除雖影響了自身生長，但對長鏈脂肪酸β氧化抑制效果更佳。

以揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)作為唯一碳源進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，4株重組菌株均可以利用VFAs作為唯一碳源進(jìn)行生長，但是吸收能力有所區(qū)別，polf-Δpox2、polf-Δpox2Δpox3吸收效率較高，polf-Δpox2Δpox3和polf-Δpex10總脂產(chǎn)量在發(fā)酵后期沒有明顯下降，更有利于脂質(zhì)的積累。

綜上所述，polf-Δpox2Δpox3, polf-Δpex10可以利用揮發(fā)性脂肪酸生長并可以積累大量的脂質(zhì)而不被迅速降解，是理想的菌株。

[1] BARTH G, GAILLARDIN C. Physiology and genetics of the dimorphic fungusYarrowialipolytica[J]. Fems Microbiol Rev, 1997, 19(4): 219-237.

[2] BEOPOULOS A, MROZOVA Z, THEVENIEAU F, et al. Control of lipid accumulation in the yeastYarrowialipolytica[J]. Appl Environ Microb, 2008, 74(24): 7779-7789.

[3] LIU H H, JI X J, HUANG H. Biotechnological applications ofYarrowialipolytica: past, present and future [J]. Biotechnol Adv, 2015, 33(8): 1522-1546.

[4] BEOPOULOS A, CESCUT J, HADDOUCHE R, et al.Yarrowialipolyticaas a model for bio-oil production [J]. Prog Lipid Res, 2009, 48(6): 375-387.

[5] LUO Y S, NICAUD J M, VAN VELDHOVEN P P, et al. The acyl-CoA oxidases from the yeastYarrowialipolytica: characterization of Aox2p [J]. Arch Biochem Biophys, 2002, 407(1): 32-38.

[6] LUO Y S, WANG H J, GOPALAN K V, et al. Purification and characterization of the recombinant form of acyl CoA oxidase 3 from the yeastYarrowialipolytica[J]. Arch Biochem Biophys, 2000, 384(1): 1-8.

[7] SUMITA T, IIDA T, HIRATA A, et al. Peroxisome deficiency represses the expression ofn-alkane-inducible YIALK1 encoding cytochrome P450ALK1 inYarrowialipolytica[J]. Fems Microbiol Lett, 2002, 214(1): 31-38.

[8] PRESTELE J, HIERL G, SCHERLING C, et al. Different functions of the C3HC4zinc RING finger peroxins PEX10, PEX2, and PEX12 in peroxisome formation and matrix protein import [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(33): 14915-14920.

[9] TITORENKO V I, SMITH J J, SZILARD R K, et al. Peroxisome biogenesis in the yeastYarrowialipolytica[J]. Cell Biochem Biophys, 2000, 32(2):1-6.

[10] XUE Z X, SHARPE P L, HONG S P, et al. Production ofomega-3 eicosapentaenoic acid by metabolic engineering ofYarrowialipolytica[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 734-741.

[11] MADZAK C, GAILLARDIN C, BECKERICH J M. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeastYarrowialipolytica: a review [J]. J Biotechnol, 2004, 109(1/2): 63-81.

[12] FICKERS P, GAILLARDIN C, NICAUD J M, et al. New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeastYarrowialipolytica[J]. J Microbiol Meth, 2004, 55(3): 727-737.

[13] MADZAK C, TRéTON B, BLANCHIN-ROLAND S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeastYarrowialipolytica[J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2000, 2(2): 207-216.

[14] FEI Q, CHANG H N, SHANG L A, et al. The effect of volatile fatty acids as a sole carbon source on lipid accumulation byCryptococcusalbidusfor biodiesel production [J]. Bioresour Technol, 2011, 102(3): 2695-2701.

[15] 賈益群, 葉福媛, 王雙，等. 生物樣品中短鏈脂肪酸的快速提取與分析方法 [J]. 實驗室研究與探索, 2012 (7): 262-264.

[16] ZHANG B X, RONG C C, CHEN H Q, et al. De novo synthesis oftrans-10,cis-12 conjugated linoleic acid in oleaginous yeastYarrowiaLipolytica[J]. Microb Cell Fact, 2012, 11(1):51-59.

[17] WINZELER E A, LIANG H, SHOEMAKER D, et al. Functional analysis of the yeast genome by precise deletion and parallel phenotypic characterization [J]. Novart Found Symp, 2000, 229:105.

[18] FONTANILLE P, KUMAR V, CHRISTOPHE G, et al. Bioconversion of volatile fatty acids into lipids by the oleaginous yeastYarrowialipolytica[J]. Bioresour Technol, 2012, 114(3):443-449.

[19] YAHARA G A, JAVIER M A, TULIO M J M, et al. Modeling of yeastBrettanomycesbruxellensisgrowth at different acetic acid concentrations under aerobic and anaerobic conditions [J]. Bioproc Biosyst Eng, 2007, 30(6): 389-395.

[20] WANG H J, LE DALL M T, WACHE Y, et al. Evaluation of acyl coenzyme A oxidase (aox) isozyme function in then-alkane-assimilating yeastYarrowialipolytica[J]. J Bacteriol, 1999, 181(17): 5140-5148.

ConstructionofYarrowialipolyticamutantwithβ-oxidationgeneknockoutandutilizationofvolatilefattyacids

NI Lijuan，ZHANG Baixi，CHEN Wei，ZHANG Hao

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

In order to inhibit theβ-oxidation of long-chain fatty acids inYarrowialipolyticaand accumulate fatty acids stably, four recombinant strains withβ-oxidation gene knockout were constructed by gene regulatory pathway. The ability of recombinant strains accumulating large amount of long-chain fatty acids with volatile fatty acids as carbon source was studied. The results showed that pox2, pox3, pex10，pox2 and pox3 were successfully knocked out, and four recombinant strains could grow with volatile fatty acids. Compared with the original strain, the total yield of lipid (long-chain fatty acids) of polf-Δpox2Δpox3 and polf-Δpex10 did not decrease significantly byβ-oxidation of long-chain fatty acids in the later stage of fermentation, so they could utilize volatile fatty acids and achieve lipid accumulation.

Yarrowialipolytica;β-oxidation; long-chain fatty acid； volatile fatty acid

Q93;TQ92

A

1003-7969(2017)11-0083-06

2017-02-17；

2017-07-17

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(31501457)

倪麗娟(1991)，女，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)(E-mail)lijuanicole@163.com。

張 灝，教授，碩士(E-mail)zhanghao@jiangnan.edu.cn。