羅婷，周坤，葉宏俊，李鴻杰，付永莉，文婷

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心，湖北 武漢 430022)

響應(yīng)面法優(yōu)化蒼耳子中綠原酸的提取工藝

羅婷，周坤*，葉宏俊*，李鴻杰，付永莉，文婷

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心，湖北 武漢 430022)

目的優(yōu)化蒼耳子中綠原酸的提取工藝。方法采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)，以綠原酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取溫度、液料比和提取時(shí)間3個(gè)影響因素進(jìn)行考察，以Design-Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果Box-Benhnken優(yōu)化蒼耳子中綠原酸最佳提取工藝條件為提取溫度89 ℃、9倍量50%乙醇、提取時(shí)間2 h，此工藝條件下綠原酸平均提取率可達(dá)1.94%。結(jié)論利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，對(duì)蒼耳子中綠原酸提取有較好的理論指導(dǎo)價(jià)值。

蒼耳子；響應(yīng)面法；綠原酸；提取工藝；高效液相

蒼耳子系菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實(shí)，有散風(fēng)寒、通鼻竅和祛風(fēng)濕等功能[1]。其主要含多酚類(lèi)、揮發(fā)油、倍半萜內(nèi)酯、水溶性苷、脂肪酸等[2]多種化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒼耳子具有殺蟲(chóng)、抗菌、抗病毒、消炎、鎮(zhèn)痛、抑制癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性[3]，而上述藥理活性的發(fā)揮與其所含有的酚酸類(lèi)成分綠原酸是密不可分的[4]。有研究[5]報(bào)道，炮制溫度對(duì)綠原酸的含量存在較大影響，故溫度為影響綠原酸含量的一大因素。目前，對(duì)蒼耳子的研究主要集中于其化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用方面，有關(guān)其提取工藝的研究報(bào)道相對(duì)較少[6]。為更加科學(xué)、合理和充分利用蒼耳子這一中藥資源，本研究以蒼耳子為對(duì)象，采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸含量，并以其得率為響應(yīng)值，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化蒼耳子中綠原酸的提取工藝，考察提取時(shí)間、提取溫度和液料比等因素之間交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響，為蒼耳子提取工藝的優(yōu)化及深入開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 儀器與試藥

DIONEX-Ultimate 3000高效液相色譜儀；Starsorius BSI型電子分析天平；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省榮華儀器制造有限公司)。

蒼耳子藥材(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司)，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.et Widd.的成熟帶總苞的果實(shí)；綠原酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-2015)；甲醇為色譜純(美國(guó)天地公司)；其他試劑均為分析純；水為三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.5%磷酸(A)-甲醇(B)；流速0.8 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按綠原酸色譜峰計(jì)應(yīng)不低于3600，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為0.02 mg·mL-1的溶液，搖勻即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取蒼耳子藥材粗粉100 g，精密稱(chēng)定，加50%乙醇回流提取(液料比、提取時(shí)間和溫度參照表4 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)方案的因素和水平)，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，回收溶劑，于烘箱中40 ℃干燥，即得蒼耳子浸膏粉。取浸膏粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，搖勻、密塞稱(chēng)定其重量。超聲處理30 min，冷卻至室溫再稱(chēng)定重量，以甲醇補(bǔ)足減失的量，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液、空白溶劑各進(jìn)樣10 μL，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分析結(jié)果見(jiàn)圖1～3。從圖中可以看出，在該條件下綠原酸與相鄰的峰基線分離度良好，其分離度大于1.5，且樣品中其他組分無(wú)干擾。

圖1 供試品的HPLC圖譜

圖2 綠原酸對(duì)照品的HPLC圖譜

圖3 空白溶液HPLC圖譜

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液2、4、8、10、12 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=45.325 3X-0.007 4，r=0.999 9。結(jié)果表明，綠原酸在0.04～0.24 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，經(jīng)計(jì)算得RSD為0.67%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，照2.1.1項(xiàng)色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h精密吸取10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，經(jīng)計(jì)算得RSD為1.25%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次蒼耳子藥材，按2.1.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，依法平行制備供試品溶液6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，經(jīng)計(jì)算得綠原酸含量的RSD為0.95%，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 各取6份已知含量的蒼耳子浸膏粉適量，精密稱(chēng)定，每份約0.5 g。向各樣品中分別準(zhǔn)確加入近等量的綠原酸對(duì)照品混勻，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2 提取工藝優(yōu)選

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素考察基礎(chǔ)上選取提取溫度、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)4個(gè)影響因素作為自變量，鑒于其中提取次數(shù)為非連續(xù)型變量，可不考慮回歸分析，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際情況及文獻(xiàn)[7]，擬設(shè)定為2次。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，取提取溫度、液料比、提取時(shí)間每個(gè)因素下各設(shè)定3個(gè)水平，依次用代碼值-1、0、+1表示。Box-Behnken設(shè)計(jì)中心組合設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表3，以蒼耳子提取物中綠原酸的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken 試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.2 模型擬合與方差分析 運(yùn)用 Design-Expert軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)作回歸分析，得液料比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)與綠原酸得率(Y)之間的線性回歸擬合方程：Y=-19.195+1.137 5A+0.405 0B+0.46C+0.012 5AB+0.03AC-0.05BC-0.17A2-0.002 85B2-0.06C2(決定系數(shù)R2=0.988 1)。方差分析結(jié)果表明，擬合得到的回歸方程P<0.01，說(shuō)明該模型在本研究所選定的因素范圍內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B、AB、A2、B25個(gè)因素對(duì)綠原酸得率的線性效應(yīng)有極顯著影響(P<0.01)；因素C2對(duì)綠原酸得率的線性效應(yīng)有顯著影響(P<0.05)；因素A、B交互作用對(duì)綠原酸得率的線性效應(yīng)有極顯著影響(P<0.05)，響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)中心組合設(shè)計(jì)因素水平

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果

表5 響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果

注：P<0.01 為極顯著；P<0.05為顯著。

本模型擬合極顯著(P<0.01)、失擬項(xiàng)P值(0.872 1)大于0.05說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)誤差小且實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間不存在失擬，因而該數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測(cè)性，故可以采用該模型對(duì)其作響應(yīng)面分析。Design-Expert軟件繪制液料比、提取溫度和提取時(shí)間因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲面見(jiàn)圖4～6、響應(yīng)值的等高線見(jiàn)圖7～9。

圖4 液料比、提取時(shí)間交互作用對(duì)于響應(yīng)值的三維曲面圖

圖5 液料比、提取溫度交互作用對(duì)于響應(yīng)值的三維曲面圖

圖6 提取溫度、提取時(shí)間交互作用對(duì)于響應(yīng)值的三維曲面圖

圖7 液料比、提取時(shí)間交互作用對(duì)于響應(yīng)值的等高線圖

圖8 提取溫度、提取時(shí)間交互作用對(duì)于響應(yīng)值的等高線圖

圖9 液料比、提取溫度交互作用對(duì)于響應(yīng)值的等高線圖

比較3組曲面響應(yīng)圖可知，液料比(A)與提取溫度(B)的響應(yīng)曲面圖呈現(xiàn)較陡峭的曲面，故此二者的交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響最為顯著。其他兩個(gè)交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響較??；響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸面，等高線為橢圓形，響應(yīng)值中心位于考察區(qū)域范圍內(nèi)，可知在所考察的范圍內(nèi)存在綠原酸得率最大值；響應(yīng)面為高度卷曲的曲面，說(shuō)明響應(yīng)因素與相應(yīng)值之間的關(guān)系不是簡(jiǎn)單的一次線性方程所能解釋的。由Design-Expert軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，給出蒼耳子中提取綠原酸的參考工藝：液料比為8.6倍、提取溫度為88.68 ℃、提取時(shí)間為2 h，理論計(jì)算最優(yōu)綠原酸得率可達(dá)1.942%。為方便提取實(shí)際操作，將此工藝條件進(jìn)一步調(diào)整：液料比9倍、提取溫度為89 ℃、提取時(shí)間為2 h進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取蒼耳子細(xì)粉3份，每份100 g，按優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行綠原酸提取，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 %

試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程的預(yù)測(cè)值較接近，驗(yàn)證了該數(shù)學(xué)模型的準(zhǔn)確性，故采用其優(yōu)化蒼耳子中綠原酸提取工藝是有指導(dǎo)意義的。

3 討論

目前，綠原酸的提取工藝研究中多采用正交設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)是對(duì)孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析的一種優(yōu)化多變量系統(tǒng)的有效試驗(yàn)設(shè)計(jì)工具，能給出最佳因素水平組合，卻無(wú)法找出整個(gè)區(qū)域上因素最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值[8]。而響應(yīng)面法則通過(guò)對(duì)響應(yīng)面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，將多因素試驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用二次多項(xiàng)式擬合的一種統(tǒng)計(jì)方法；研究因素與響應(yīng)值之間、因素之間的交互作用，獲得的預(yù)測(cè)模型多為曲面，在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中，可以連續(xù)地對(duì)實(shí)驗(yàn)各水平進(jìn)行分析[9]；能快速、有效地從影響綠原酸得率因素中篩選出最顯著的因素，避免次要因素帶來(lái)的資源和時(shí)間浪費(fèi)，同時(shí)以較少實(shí)驗(yàn)次數(shù)和較短時(shí)間對(duì)所選的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面考察[10]。

本研究采用效應(yīng)面法優(yōu)化蒼耳子提取工藝，對(duì)液料比、提取溫度和提取時(shí)間等因素及其交互作用進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液料比、提取溫度對(duì)蒼耳子中綠原酸的提取有極顯著性影響；影響次序?yàn)橐毫媳?提取溫度>提取時(shí)間，而提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響不顯著(p<0.001)；液料比和提取溫度的交互作用對(duì)綠原酸得率有顯著影響。在規(guī)模化提取過(guò)程中從溶劑消耗、生產(chǎn)效率和降低成本等角度考慮，提取次數(shù)定為2次完全滿足生產(chǎn)需要，充分結(jié)合本研究所優(yōu)化的工藝參數(shù)，確定蒼耳子最優(yōu)工藝條件為提取溫度89 ℃、9倍量50%乙醇、提取時(shí)間2 h、提取2次，為蒼耳子中綠原酸提取提供了參考和依據(jù)。

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ExtractionofChlorogenicacidinFructusXanthiibyResponseSurfaceMethod

LUOTing，ZHOUKun*，YEHongjun*，LIHongjie，F(xiàn)UYongli，WENTing

(AffiliatedMentalHealthCenter,tongjiMedicialofHuazhonguniversityofscience&Technology，HubeiWuhan，430022，China)

Objective：To optimize extraction of chlorogenic acid in Fructus Xanthii.MethodsWith the content of chlorogenic acid yield in Fructus Xanthii as an index，the effect of three factors，i.e.extraction temperature，solvent-solid ratio and extraction time was designed by Box-Behnken central composite.Design-Expert 8.05 software was used for the statistical processing of the experimental data.ResultsThe optimizing extraction conditions of Fructus Xanthii were as follows：ethanol concentration was 50%，extracting time was two hours extracting temperature was 79 ℃ and solvent-solid ratio was 9.Under the conditions，the average chlorogenic acid yield was 1.94%.ConclusionThe optimized extraction of chlorogenic acid in Fructus Xanthii by application of response surface methodology is stable and feasible and the result can provide theoretical guidance for large-scale extraction chlorogenic acid in Fructus Xanthii.

Fructus Xanthii；response surface methodology；chlorogenic acid；extraction；HPLC

*

周坤，藥師，研究方向：制劑研究，E-mail：822733781@qq.com；葉宏俊，藥師，研究方向：制劑研究，E-mail：822733781@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.025

2017-01-18)