周 波 ，孫亞娟 ，王進英 ，金 超 ，鐘海雁

（1. 中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.糧油深加工與品質控制湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；3. 經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

茶油揮發(fā)性成分指紋圖譜的構建及摻偽定量檢測方法研究

周 波1，2，3，孫亞娟1，2，3，王進英1，2，3，金 超1，2，3，鐘海雁1，2，3

（1. 中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.糧油深加工與品質控制湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；3. 經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

為探析茶油的揮發(fā)性成分指紋圖譜，以20種不同產地、制備方法的茶油為原料，利用頂空固相微萃?。⊿PME）和氣相色譜儀分析其揮發(fā)性成分。結果表明：（1）茶油揮發(fā)性成分的指紋圖譜由壬醛、2-反己烯醛等17個共有色譜峰構成，且經聚類分析和相似度分析得出茶油的產地、儲存時間，尤其是制備工藝對其影響較大；（2）選取一種茶油為研究對象，建立了菜籽油－茶油的摻偽模型：Y=-4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05（Y為菜籽油摻假比例%，X為夾角余弦cosθ），適用于菜籽油摻偽量25%以上的茶油。

茶油；揮發(fā)性成分；指紋圖譜；摻偽模型

油茶Camellia oleifera為山茶科山茶屬常綠灌木或小喬木，是中國特有的木本油料樹種，其籽所制備的油脂，即茶油，又名茶籽油、茶樹油或山茶油，具有顏色清澈、味道香濃、營養(yǎng)豐富、耐貯藏等優(yōu)點，不飽和脂肪酸含量高達90%，有“東方橄欖油”的稱號[1]，是一種深受消費者喜愛的食用油，因而價格普遍較高[2-3]。目前，有些非法商販以銷售摻假茶油來牟取暴利[4]。茶油的氣味、滋味是其質量控制的重要指標之一[5]。茶油具有區(qū)別其他常見食用油的特殊揮發(fā)性成分，主要由吡咯類、吡嗪類、吡啶類、噻唑類、噻吩類和呋喃類等化學成分組成[6]。對茶油的揮發(fā)性成分進行定性定量分析，已成為一種重要的質控手段[7]，但其大部分成分的濃度僅幾百萬分之幾，甚至更小低，因而要完全鑒別具有一定的困難，比較科學的方法是立足于其特征值。

固相微萃取(Solid Phase Microextraction,SPME)技術是依靠纖維頭從樣品中吸附待測物，并解吸于分析設備中的一種無溶劑樣品預處理技術，是當今色譜分析中使用極為廣泛的樣品前處理方法[8]。吳繼紅等[9]采用SPME-GC/MS技術分析了蘋果中的香氣成分，共鑒定出48 個成分。魏玉梅等人[10]將頂空固相微萃取和氣相色譜質譜聯用對花牛蘋果的香氣成分進行了分析，共分離鑒定出76 種化學成分。龍奇志等人[11]研究了茶油揮發(fā)性物質的固相微萃取的條件，認為當樣品量為1.00 g(15 mL樣品瓶)、攪拌速度為100 r/min、萃取溫度為40 ℃、吸附時間為25 min、解析溫度和時間分別為260℃和3 min時，萃取效果最好。

雖然指紋圖譜在中藥方面的應用比較普遍，但這并不妨礙指紋圖譜在其他領域的應用[12]。氣相色譜（Gas Chromatography, GC）對揮發(fā)性成分的分析能起到獨特的作用，因此利用氣相色譜法構建指紋圖譜具有別樣的意義。通過采用毛細管氣相色譜法，夏稷子等[13]發(fā)現14個不同產地艾納香藥材的GC指紋圖譜共有23個共有峰，不同產地艾納香藥材在所含成分的種類上差異不大，但在成分比例和數量上差異較大。張勝娜等[14]利用毛細管氣相色譜獲得了較為理想的鮮腫節(jié)風揮發(fā)油GC指紋圖譜。

本研究擬借助SPME結合GC來測定20種不同茶油原料的揮發(fā)性成分數據，并以此來構建茶油揮發(fā)性成分的指紋圖譜，以期為茶油的質量控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試樣及試劑

茶油20種，分別編號為S1～S20，S1～S6為實驗室自榨，S7～S20為市售，具體信息見表1。菜籽油，市售；十二烷（Dodecane，44010-5 mL，純度＞99.8%）、壬醛(442719-1G，純度＞98%)、2-反己烯醛(132659-5G，純度＞98%)均購自美國SIGMA-ALDRICH集團Fluka公司。

表1 茶油信息Table 1 The information of Camellia oil

1.2 儀器及設備

RCT basic型磁力加熱攪拌裝置，德國IKA儀器有限公司；CP224C型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SB-5200 DTDN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SPME手動進樣手柄、 DVB/CA/PDMS (2 cm, 50/30 μm)纖維頭、15 mL帶有PTFE/硅橡膠瓶墊的透明樣品瓶，美國Supelco公司；GC-2014型氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 茶油揮發(fā)性成分的頂空固相微萃?。⊿PME）

稱取0.2 g茶油油樣及0.01g內標溶液（濃度為0.033 05 mg/g的十二烷油溶液，33.05 mg的十二烷溶于1 000 g的精煉茶油）放入15 mL透明樣品瓶中。將磁力加熱攪拌裝置調至90℃，待溫度穩(wěn)定后，將SPME針管穿過樣品瓶的硅橡膠瓶墊，伸出纖維頭，頂空萃取10 min。待氣相色譜儀處于準備狀態(tài)后，將SPME迅速穿過進樣口硅膠隔墊，伸出纖維頭解析10 min。SPME纖維頭在下次萃取前應在進樣口200 ℃下洗脫10 min以上。

1.4 氣相色譜儀（GC）分析條件

采用美國supelco公司Capillary Column色譜柱（60 m×0.25 mm×0.2 μm）：氫火焰離子化檢測器（FID）；進樣口溫度為200℃；檢測器溫度為250 ℃；進樣量為1 μL；以氮氣為載氣：以氫氣為燃氣；以無油空氣為助燃氣；色譜柱升溫采用程序升溫，起始柱溫為40 ℃（保持2 min），以3℃/min的升溫速度升至160℃后保持2 min，繼續(xù)以12 ℃/min的升溫速度升至220℃保持5 min。

2 結果與分析

2.1 茶油揮發(fā)性成分指紋圖譜的構建

不同緯度分布的油茶籽出油率存在一定差異，所得茶油脂肪酸含量也不同[15]。茶油產地、制備工藝、貯藏環(huán)境等條件的差異均會導致其揮發(fā)性成分的復雜多樣，因而要建立能準確反映茶油揮發(fā)性成分的指紋圖譜的關鍵在于特征指標類型的選定[16]。本研究以來源不同的20種茶油樣品為原料，采用SPME獲得其揮發(fā)性成分，并借助GC進行檢測（在1.4條件下）。在對色譜峰數據進行分析時，先是去除峰面積過低（濃度較小）和保留時間長于54 min的峰（此類峰一般為高沸點化合物），然后從該定向圖譜中篩選出匹配數大于10的17個共有色譜峰，以此建立茶油揮發(fā)性成分的指紋圖譜，結果見圖1。

圖1 不同樣品茶油揮發(fā)性成分的GC指紋圖譜Fig. 1 The GCfingerprint of volatile components of different Camellia oil samples

在分析過程中，發(fā)現同一物質即使在同樣的GC檢測分析條件下，其色譜圖仍會出現保留時間漂移、響應值變遷等現象，這將極大程度地降低所建立茶油揮發(fā)性成分指紋圖譜的準確性。為解決此問題，本試驗選定十二烷為內標添加參考物，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對保留面積，從而對其進行定性和定量分析。同時，以共有峰中較為穩(wěn)定的6號和8號（見圖2）為對照，輔助定性各共有峰。該圖譜具有專屬性強、重復性好的特點，能夠較好地反映各茶油揮發(fā)性成分特征。

2.2 茶油揮發(fā)性成分指紋圖譜建立方法的驗證

對試驗2.1所建的茶油揮發(fā)性成分指紋圖譜方法分別進行精密度、重復性和樣品穩(wěn)定性實驗，以驗證其準確性。取茶油樣品（S1），進行揮發(fā)性成分固相微萃取，按照1.4色譜條件重復進樣5次，其色譜圖中各共有指紋峰相對保留時間的RSD為0.21%～0.36%，相對峰面積的RSD為0.87%～3.47%，均小于5.0%，符合指紋圖譜制訂的相關要求；取茶油樣品（S1）5份，進行揮發(fā)性成分固相微萃取，按1.4色譜條件進樣分析，其色譜圖中各共有指紋峰相對峰面積的RSD為0.16%～0.52%，相對峰面積的RSD為1.56%～4.26%，均小于5.0%，符合指紋圖譜制訂的相關要求；取茶油樣品（S1）6份，與內標溶液一起加入到透明樣品瓶中，于室溫下放置，分別進行0、2、4、8、12、24 h不同時間的揮發(fā)性成分固相微萃取，按1.4色譜條件進樣分析，各共有指紋峰與參比峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于4.0%，符合指紋圖譜制訂的相關要求。綜上所述，所建立的指紋圖譜方法能準確地應用于茶油揮發(fā)性成分的鑒別。

圖2 各批次茶油揮發(fā)性成分GC共有峰色譜圖Fig. 2 The GC chromatogram of volatile components common peak of camellia oil samples

2.3 不同產地茶油揮發(fā)性成分的聚類分析

對檢測到的20個不同茶油樣品的揮發(fā)性成分數據，采用夾角余弦作為測度，按組間聯接分析法對其進行聚類分析，結果以樹狀圖表示（見圖3）。

由圖3可知，樣品（S2）和樣品（S6）、樣品（S11）和樣品（S12）在聚類重新標定距離約為2的最小水平上形成兩個聚類，這表明S2和S6、S11和S12有最大的相似性，進一步對樣品進行分析發(fā)現：S2和S6的茶油種子均來自于廣西博白，而S11和S12均為冷榨的精煉成品油，可見不同的茶油原料和制備工藝均會對其的揮發(fā)性成分產生影響；隨著聚類重新標定距離的逐漸變大，其他樣品也隨之并入到不同的類別中，當聚類重新標定距離為25時，全部樣品的揮發(fā)性成分數據可并為一類，聚類重新標定距離的最大值和最小值相差了接近23，可見所選的20個樣品間的揮發(fā)性成分差異較大，樣品具有一定的代表性，需要較大的聚類重新標定距離才能將其聚為一類，這也從一定程度上說明所建立的茶油揮發(fā)性指紋圖譜有較廣的應用范圍；當聚類重新標定距離接近20時，仍可聚為4類，其中樣品（S1）和樣品（S18）、樣品（S14）和樣品（S17）及樣品（S10）和樣品（S16）分別聚為3類，其余14個樣品聚為同一類，可見要建立一個準確度較高的揮發(fā)性指紋圖譜需要盡可能保證所選茶油原料的一致性。

2.4 茶油揮發(fā)性成分相似度評價

相似度是國家藥典委員會確定的中藥指紋圖譜標準中的一項重要評價指標，適用于分析揮發(fā)性成分復雜多樣的茶油樣品[17]。本研究以2.1茶油揮發(fā)性成分指紋圖譜的構建數據為基礎，采用樣本間夾角余弦來計算相似度，結果見表2。

圖3 20批次茶油樣品聚類分析樹狀圖Fig. 3 The cluster analysis tree of 20 Camellia oil samples

表2 20個不同茶油樣品的相似度Table 2 The similarity of 20 Camellia oil samples

由表2可知，樣品S7、S8和S19、S20的相似度均大于0.9，說明其指紋圖譜具有較高的相似性。進一步分析發(fā)現，S7、S8和S19、S20均為采用熱榨法制備，該工藝使得一部分樣品的成分揮發(fā)，產生額外的香氣；樣品S1～S6、S11～S13、S18的相似度在0.7～0.9之間，這些樣品除S18外，其余均采用冷榨法制備。同時，除S12、S13、S18外，其余均為毛油。這說明，制油方法是否精煉均會對茶油揮發(fā)性成分的保留產生一定的影響；其余樣品相似度在0.7以下。這一結果提示，20個茶油樣品中因產地、加工方法、儲存方法、儲存時間有所不同，揮發(fā)性成分的組成、比例和數量也具有差異，其中加工方法起主要作用，這為茶油的規(guī)范化生產提供了一定的理論基礎。

2.5 菜籽油—茶油的摻偽定量檢測

為了避免不同茶油原料對結果的干擾，選定其中一種茶油作為菜籽油-茶油摻偽模型的研究基礎。對9份菜籽油-茶油摻偽樣品的揮發(fā)性成分氣相色譜圖數據進行直觀分析與特征色譜峰分析。由于上述特征色譜峰峰面積均呈線性變化，因而選取色譜峰面積大于5%的色譜峰峰面積作為向量計算夾角余弦。利用公式來計算各摻假茶油對純茶油的相似度，結果見表3。

表3 茶油摻菜籽油揮發(fā)性成分指紋圖譜相似度與相對誤差Table 3 The camellia oil mixed with canola oil volatile components fingerprint similarity and relative error

由表3可知，摻假量越多，指紋圖譜相似度越小，二者呈線性遞減曲線，線性方程式可擬和為Y=-4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05（Y為菜籽油摻假比例%，X為夾角余弦cosθ）。通過線性方程式計算摻假量，與實際摻假量進行比較，并計算相對誤差，相對誤差平均值為4.49%；摻假量在25%～100%范圍內的相對誤差平均值為3.32%，且該摻假范圍內的檢測相對誤差均小于10%。這從一定程度上說明，摻假量越大，相對誤差越小。因而，該模型可用于檢驗茶油摻假菜籽油的比例（以25%～100%為宜），以維護消費者權益。

3 結 論

采用SPME-GC建立了20種不同茶油的揮發(fā)性成分指紋圖譜，該圖譜具有專屬性強、重復性好的特征，可用于茶油質量評價鑒定。通過聚類分析，發(fā)現當聚類重新標定距離達到約25時，才能夠將所有樣品聚為一類，表明所選茶油樣品揮發(fā)性成分差異較大，具有一定的代表性，應用范圍較廣。相似度分析結果表明，20個茶油樣品中相似度大于0.9的樣品有4個，相似度在0.7～0.9之間的樣品有10個，其余6個樣品相似度均低于0.7，該結果進一步說明油茶的產地、儲存時間，尤其是加工方法會影響其揮發(fā)性成分的組分。因此，生產規(guī)范化是保證茶油質量的關鍵。研究茶油-菜籽油摻偽模型揮發(fā)性成分并利用指紋圖譜計算其相似度，建立了菜籽油-茶油摻偽模型：Y= -4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05（Y為 菜籽油摻假比例%，X為夾角余弦cosθ），適用于檢驗菜籽油摻偽量25%以上的茶油。

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[本文編校：謝榮秀]

Detection method research on adulteration ofCamelliaseed oil based onfingerprint of volatile components

ZHOU Bo1,2,3, SUN Yajuan1,2,3, WANG Jinying1,2,3, JIN Chao1,2,3, ZHONG Haiyan1,2,3
(1.College of Food Sciences and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Province Key Laboratory of Grain, Oil Processing and Quality Control, Changsha 410004, Hunan, China;3. Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Education Ministry, Changsha 410004, Hunan, China)

To build afingerprint based on volatile component forCamelliaseed oil adulteration detection in this paper, 20 kinds of differentCamelliaseed oil were used as material to analysis volatile components by headspace solid phase microextraction (SPME)and GC. The results showed that theCamelliaseed oilfingerprint of volatile component was consists of 17 common chromatographic peaks including nonanal and trans-2-hexenal etc., which is strongly effected by the producing area, storage time, especially the preparation technology according to the similarity and cluster analysis; Choosing one kind of camellia oils as the study object, we built the adulteration model for rapeseed oil,Camelliaseed oil which is that:Y=-4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05 (Yfor rapeseed oil adulteration ratio %,Xfor the included Angle cosine cosine theta), and this can be applied to the identification of more than 25% of the amount of adulteration camellia oil.

Camelliaseed oil; volatile profiles;fingerprint; Adulteration model

S789；TS229

A

1673-923X(2017)09-0118-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.09.020

2016-03-10

湖南省科技計劃農林領域重點開發(fā)項目（2016NK2145）；湖南省林業(yè)廳項目（XLB201618）

周 波，副教授，博士；E-mail：zhbo78@126.com

周 波，孫亞娟，王進英，等.茶油揮發(fā)性成分指紋圖譜的構建及摻偽定量檢測方法研究[J].中南林業(yè)科技大學學報，2017,37(9): 118-123.