方紹培,劉晨龍,堯國榮,朱錢龍,文 虹,鄒志恒,熊立根*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,江西 南昌 330200;2.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院,江西 樟樹 331200;3.江西省獸藥飼料監(jiān)察所,江西 南昌 330029)

蛋殼膜對生產(chǎn)肉雞抗病力和免疫力的影響

方紹培1,劉晨龍1,堯國榮2,朱錢龍2,文 虹3,鄒志恒1,熊立根1*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,江西 南昌 330200;2.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院,江西 樟樹 331200;3.江西省獸藥飼料監(jiān)察所,江西 南昌 330029)

將蛋殼膜按不同比例添加于肉雞的日糧中,分析了其對肉雞免疫力和接種禽流感H5N1-H9N2二價(jià)疫苗后抗體水平的影響。結(jié)果表明：蛋殼膜能夠顯著提高雞血清總蛋白和白蛋白濃度以及H5N1-H9N2抗體水平。說明蛋殼膜對雞的免疫力有增強(qiáng)作用,能夠作為一種功能性飼料添加劑用于提高肉雞的抗病力和免疫力。

蛋殼膜；肉雞；抗病力；免疫力

蛋殼是種禽場的主要副產(chǎn)品之一,由表面鈣化的外殼和外殼下面的一層蛋白膜(殼膜)組成。蛋殼膜(Eggshell Membranes, ESM)是一種主要由膠原蛋白和角蛋白組成的纖維結(jié)構(gòu)蛋白。此外, 蛋殼膜還包括一些具有抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白或多肽,比如溶菌酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白、卵黏蛋白和防御素等[1]。其中許多蛋白質(zhì)在功能上類似于乳蛋白,可以對新生兒出生后起到保護(hù)作用,幫助腸道微生物的形成以及腸道的成熟等[2-3]?？咕嚯牟粌H可以抵御大部分的細(xì)菌和真菌等微生物,還可以發(fā)揮佐劑功能,增強(qiáng)對外源抗原的抵抗力[4]。本研究在肉雞日糧中添加不同量的ESM,分析了ESM對增強(qiáng)肉雞抗病力的作用；同時(shí)通過檢測接種禽流感H5N1-H9N2雙價(jià)疫苗后的抗體水平來分析ESM對肉雞免疫力的影響,以期為蛋殼膜功能性飼料添加劑探索更廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及其飼養(yǎng)

本研究隨機(jī)選取90日齡左右的地方雞種修水翻毛雞,于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所地方雞飼養(yǎng)中心進(jìn)行網(wǎng)上飼養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)雞隨機(jī)分為4組:對照組、試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ以及試驗(yàn)組Ⅲ,每組8只雞,并且每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組與對照組肉雞的基礎(chǔ)日糧相同,試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.25%、0.50%和0.75%的蛋殼膜。使用破碎機(jī)對蛋殼膜進(jìn)行破碎,破碎后蛋殼膜大小為60～80目。

1.2血清樣品的采集

首先對試驗(yàn)雞進(jìn)行7 d的預(yù)飼養(yǎng),在預(yù)飼期的日糧中不添加蛋殼膜。7 d預(yù)飼后開始在日糧中添加不同劑量的蛋殼膜進(jìn)入正式試驗(yàn)。在飼喂試驗(yàn)飼養(yǎng)7 d后對各組肉雞接種禽流感二價(jià)疫苗(H5N1-H9N2),按說明用量與方法接種。于接種疫苗后14 d、21 d和28 d分3次通過翅靜脈法進(jìn)行血液的采集。血液采集后在室溫下靜置2 h,待析出血清后在離心機(jī)內(nèi)用3000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心,將血清用移液槍吸出至新的1.5 mL離心管內(nèi),置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3血清生化指標(biāo)的檢測

本研究所測血清生化指標(biāo)有血清總蛋白、白蛋白和免疫球蛋白。使用南京建成生物工程研究所的檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

血清總蛋白采用BCA法進(jìn)行定量。首先將血清樣品用生理鹽水稀釋50倍,然后按照試劑盒說明書配制好工作液。在96孔V型微量反應(yīng)板中每孔加入250 μL工作液,然后在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和測定孔中分別加入雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)品(563 μg/mL)以及待測樣本各10 μL,混勻,在37 ℃下孵育30 min,最后使用酶標(biāo)儀在波長562 nm處測定各孔的吸光度值。總蛋白濃度的計(jì)算公式為:總蛋白濃度(μg/mL)=[(測定孔的OD值-空白孔的OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔的OD值-空白孔的OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度563 μg/mL×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

血清白蛋白使用微量酶標(biāo)儀法進(jìn)行測定。首先使用生理鹽水將血清樣品稀釋10倍,按照說明書配制好溴甲酚綠工作液。于96孔V型微量反應(yīng)板中每孔加入250 μL工作液,然后在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和測定孔中分別加入雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)品以及待測樣本各10 μL,混勻,在室溫下靜置10 min,最后使用酶標(biāo)儀在波長630 nm處測定各孔的吸光度值。白蛋白含量的計(jì)算公式為:白蛋白含量(g/L)=[(測定孔的OD值-空白孔的OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔的OD值-空白孔的OD值)]×白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度3.48 g/L。

血清免疫球蛋白(IgG)使用免疫比濁法進(jìn)行測定。先在96孔V型微量反應(yīng)板中每孔加入225 μL試劑R1,然后在空白、標(biāo)準(zhǔn)和測定孔中分別加入2 μL雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)液和樣品，混勻,在37 ℃下孵育3～5 min,使用酶標(biāo)儀讀取吸光度A0；然后分別加入75 μL試劑R2,在37 ℃下孵育5 min,讀取吸光度A1,計(jì)算ΔA=A1-A0。使用多點(diǎn)定標(biāo)曲線logit-log(4p)進(jìn)行處理,用測定管的ΔA計(jì)算IgG含量。

1.4血凝(HA)和血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)

按照常規(guī)血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)方法進(jìn)行禽流感H5和H9抗體的檢測,計(jì)算每個(gè)個(gè)體的效價(jià)。

1.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用EXCEL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理；使用R軟件(https://www.r-project.org/)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(t檢驗(yàn)),顯著性閾值設(shè)定為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1血清總蛋白測定結(jié)果

本研究在接種禽流感疫苗后第14、21和28天進(jìn)行血清總蛋白的測定,結(jié)果見圖1。

圖中“*”表示P≤0.05。下同。

從圖1中可以看出：在接種禽流感疫苗14 d后(A),3個(gè)添加殼膜試驗(yàn)組的總蛋白濃度均比對照組要高,而且隨著殼膜添加量的增加,總蛋白濃度也相應(yīng)增加,但是差異不顯著；接種21 d后(B),3個(gè)試驗(yàn)組的總蛋白濃度同樣都比對照組高,其中添加0.25%殼膜量的試驗(yàn)組濃度最高；接種28 d后(C),3個(gè)試驗(yàn)組的總蛋白濃度仍然比對照組高,且0.25%添加量和0.75%添加量試驗(yàn)組的總蛋白濃度均顯著高于對照組的(P=0.039和P=0.02)。說明添加不同量的殼膜能提高血清總蛋白濃度。

2.2血清白蛋白測定結(jié)果

從圖2可以看出,接種禽流感疫苗后第14、21和28天各試驗(yàn)組的血清白蛋白濃度均比對照組高。具體來說，在接種疫苗14 d后(A),0.25%殼膜添加量試驗(yàn)組的血清白蛋白濃度相對于對照組沒有顯著提高,而0.50%和0.75%殼膜添加量試驗(yàn)組均有顯著提高(P=0.015和P=3.76×10-5)；在接種疫苗21 d后(B),0.25%殼膜添加量試驗(yàn)組的血清白蛋白濃度較對照組沒有顯著提高,而0.50%和0.75%殼膜添加量試驗(yàn)組均有顯著提高(P=0.0041和P=0.0035)；在接種疫苗28 d后(C),0.25%和0.50%殼膜添加量試驗(yàn)組的血清白蛋白濃度較對照組沒有顯著提高,而0.75%殼膜添加量試驗(yàn)組有極顯著提高(P=0.00018)?？傮w來說,殼膜添加量越多,血清白蛋白濃度越高。

圖中“**”表示P≤0.01,“***”表示P≤0.001。下同。

2.3血清免疫球蛋白測定結(jié)果

本研究使用免疫比濁法測定血清IgG濃度，計(jì)算得到ΔA(即A1-A0)。從表1中可以看到,在免疫接種14 d、21 d和28 d后,3個(gè)試驗(yàn)組與對照組間的ΔA均無顯著性差異,說明添加殼膜對提高肉雞血清IgG濃度的作用不明顯。

2.4血清禽流感抗體H5N1和H9N2效價(jià)測定結(jié)果

使用HI和HA的方法進(jìn)行禽流感抗體的檢測,以抗體效價(jià)的log2的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如圖3和圖4所示。

表1 試驗(yàn)組與對照組的ΔA平均值

縱坐標(biāo)為抗體效價(jià)的log2計(jì)算值。

從圖3中可以看出：在接種疫苗14 d后(A),3個(gè)試驗(yàn)組的H5N1抗體效價(jià)均較對照組沒有顯著提高；在接種21 d后(B),0.75%殼膜添加組相比于對照組,H5N1抗體效價(jià)顯著提高(P=0.01944),說明殼膜在接種疫苗21 d后開始起到提高雞血清H5N1抗體水平的作用；在接種28 d后(C),3個(gè)試驗(yàn)組相比于對照組,H5N1抗體效價(jià)均有顯著提高(P值分別等于0.0121、0.0001968、0.003293)。上述結(jié)果說明殼膜能夠提高雞血清H5N1抗體水平,而且其效果隨著殼膜添加量(0.75%以內(nèi))的增加和使用時(shí)間的延長而提高。

從圖4中可以看出：在接種疫苗14 d后(A),0.50%和0.75%殼膜添加組的H9N2抗體效價(jià)均較對照組顯著提高(P=0.006128和P=0.002476)；在接種21 d后(B)和28 d后(C),只有0.75%殼膜添加組的H9N2抗體效價(jià)較對照組有顯著提高(P=0.01105和P=0.0283)。表明添加低劑量水平的殼膜對H9N2抗體水平的提高作用不大,只有較高劑量(0.75%)的添加量才能提高雞血清H9N2抗體水平。

縱坐標(biāo)為抗體效價(jià)的log2計(jì)算值。

3 討論

已有研究表明,有生長缺陷的雞的雞蛋副產(chǎn)品能夠改善家畜的營養(yǎng)水平[7-8]。目前對ESM的利用主要在化妝品[9]、蛋殼膜美容保健奶[10]、中醫(yī)藥(即鳳凰衣)[11]以及治療角膜潰瘍[12]等方面,而作為功能性飼料添加劑研究其對家禽抗病力和免疫力的影響尚未見報(bào)道。ESM含有大量的免疫調(diào)節(jié)蛋白或多肽[1,13-14]。從本研究試驗(yàn)結(jié)果來推測,ESM作為飼料添加劑對雞的生理機(jī)能具有調(diào)節(jié)作用,可以作為一種功能性飼料添加劑，用于提高肉雞的抗病力和免疫力。

在本研究所檢測的5個(gè)指標(biāo)(總蛋白、白蛋白、IgG、H5N1效價(jià)和H9N2效價(jià))中, ESM除了對提高血清IgG濃度無作用外,對其余4個(gè)指標(biāo)均有不同程度的提高。血清總蛋白與雞體的免疫功能有著密切的關(guān)系；本研究在接種禽流感滅活疫苗后21 d內(nèi)都未檢測到血清總蛋白濃度的提高,只是在接種后28 d檢測到有提高,說明ESM對提高接種禽流感疫苗后雞體內(nèi)的總蛋白濃度的作用不大。血清白蛋白具有物質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)功能,能結(jié)合許多內(nèi)源性和外源性化合物,與藥物、營養(yǎng)物質(zhì)的給予和療效、解毒和抗氧化作用密切相關(guān),其能結(jié)合的藥物有抗生素和免疫抑制劑等[15]。因此雞體血清白蛋白濃度的增加有利于結(jié)合抗生素或免疫抑制劑,減少抗生素對雞體的影響或者防止雞體免疫力被抑制。本研究發(fā)現(xiàn),在接種疫苗28 d后,3個(gè)試驗(yàn)組的H5N1效價(jià)都顯著高于對照組的,其中0.50%添加量組的效價(jià)最高,說明0.50%的殼膜添加量是合適添加量；另外，蛋殼膜對雞體內(nèi)H9N2抗體水平的提高只在接種疫苗后的前期有較明顯的作用,隨著時(shí)間的推移,其作用越來越小?？傮w來說，蛋殼膜能夠提高雞體H5N1、H9N2抗體水平,抵抗禽流感的感染。

綜上所述，蛋殼膜在一定程度上可以增強(qiáng)雞體的抗病力和免疫力，可以作為一種功能性飼料添加劑用于肉雞的飼養(yǎng)。但本研究只分析了蛋殼膜對H5N1型禽流感的防御力,是否會對其它型的禽流感具有相同作用,還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

EffectsofEggshellMembraneonDiseaseResistanceandImmunityofChickens

FANG Shao-pei1, LIU Chen-long1, YAO Guo-rong2, ZHU Qian-long2,WEN Hong3, ZOU Zhi-heng1, XIONG Li-gen1*

(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2. Jiangxi Vocational College of Agricultural Engineering, Zhangshu 331200, China; 3. Jiangxi Provincial Institute of Veterinary Medicine and Feed Supervision, Nanchang 330029, China)

Different ratios of eggshell membrane (ESM) was added into the diet of chickens, and the effects of ESM on the immunity of chickens and their antibody level after inoculating avian influenza H5N1-H9N2 bivalent vaccines were analyzed. The results showed that ESM could significantly enhance the concentration of serum total protein and serum albumin, as well as the H5N1-H9N2 antibody level in chickens. Therefore, ESM can strengthen the immunity of chickens, and can be used as functional feed supplement to improve the disease resistance and immunity of chickens.

Eggshell membrane; Chicken; Disease resistance; Immunity

S831.9

A

1001-8581(2017)12-0077-05

2017-08-15

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20151BBF60065)。

方紹培(1972─),男,畜牧獸醫(yī)師,研究方向?yàn)樾笄萁】叼B(yǎng)殖與疾病防治。*通訊作者:熊立根。