劉小燕 ，劉 珊 ，張麗娟 ，韓 倩 ，陳棉彪 ，黃楚珊 ，魏東洋 ，胡國(guó)成 *

六溴環(huán)十二烷對(duì)斑馬魚(yú)的甲狀腺激素干擾效應(yīng)研究

劉小燕1，2，3，劉 珊1，張麗娟2，3，韓 倩4，陳棉彪2，3，黃楚珊2，3，魏東洋2，3，胡國(guó)成2，3*

（1.長(zhǎng)安大學(xué)旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710064；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣州 510535；3.國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510535；4.深圳市環(huán)境科學(xué)研究院，廣東 深圳 518001）

作為添加型阻燃劑，六溴環(huán)十二烷（HBCDs）廣泛存在于環(huán)境介質(zhì)及生物體內(nèi)。為研究HBCDs飼料長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)的甲狀腺激素干擾效應(yīng)，設(shè)計(jì)HBCDs飼料暴露劑量為0、10、100、400 ng·g-1，對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)進(jìn)行為期56 d的長(zhǎng)期暴露，以其肝臟組織中三碘甲腺原氨酸（T3）、四碘甲腺原氨酸（T4）、游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和游離四碘甲腺原氨酸（FT4）含量及T3/T4比值作為生物標(biāo)志物，評(píng)價(jià)HBCDs飼料長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟組織甲狀腺功能的影響。結(jié)果表明，HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)T3和T4具有明顯抑制作用（P<0.05），隨著HBCDs暴露濃度的增加，T3和T4的含量水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在中濃度組（100 ng·g-1）和高濃度組（400 ng·g-1），HBCDs對(duì)FT3和FT4具有顯著性抑制作用（P<0.05）；隨著HBCDs暴露濃度增加，T3/T4的比值呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，表明HBCDs可誘導(dǎo)T4轉(zhuǎn)化為T(mén)3。研究表明，HBCDs對(duì)魚(yú)類(lèi)具有甲狀腺激素干擾效應(yīng)，從而影響魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育。

六溴環(huán)十二烷；斑馬魚(yú)；甲狀腺激素；干擾效應(yīng)

目前，六溴環(huán)十二烷（HBCDs）廣泛應(yīng)用于建筑材料、塑料橡膠產(chǎn)品以及電子設(shè)備中[1]。工業(yè)品HBCDs主要含有3種手性異構(gòu)體：α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD，其比例分別為10%～13%、1%～12%和75%～89%，其中γ-HBCD是工業(yè)品中最主要的異構(gòu)體[2]。研究資料顯示，HBCDs是除多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）和四溴雙酚A（TBBPA）之外的全球第三大溴代阻燃劑。至2010年，HBCDs的全球年產(chǎn)量已達(dá)到28 000 t，其中約64%的產(chǎn)量集中于中國(guó)山東省、江蘇省等HBCDs的生產(chǎn)地區(qū)[3-5]。隨著HBCDs生產(chǎn)量和使用量的增加，HBCDs在不同環(huán)境介質(zhì)（水、土壤、沉積物及空氣等）和生物體內(nèi)（銀鷗、鯽魚(yú)、田螺、斑馬貽貝和歐鯉等）均有不同程度的檢出[6-13]，且在水生物體內(nèi)可隨著食物鏈富集放大。He等[6]研究發(fā)現(xiàn)珠江流域水體中HBCDs的平均濃度為0.04 ng·L-1；Xian等[14]首次研究了中國(guó)環(huán)境中HBCDs的含量，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江流域魚(yú)體中HBCDs的含量范圍為12～330 ng·g-1，高于意大利高山湖泊斑馬貽貝和歐鯉體內(nèi)HBCDs的平均濃度（分別為72.4、31 ng·g-1）[15]，而低于歐洲工業(yè)區(qū)魚(yú)類(lèi)體內(nèi) HBCDs含量水平（9.1～1113 ng·g-1）[13]。

目前，關(guān)于HBCDs毒性研究的資料相對(duì)較少。HBCDs對(duì)大鼠的口服最小致死劑量大于20 g·kg-1，吸入最小致死劑量大于200 mg·L-1；HBCDs對(duì)兔子的經(jīng)皮膚接觸暴露的最小致死劑量大于20 g·kg-1[15]。2008年，歐洲聯(lián)盟委員會(huì)對(duì)HBCDs的全面評(píng)估顯示：HBCDs可能會(huì)造成生殖毒性和慢性毒性。工業(yè)品HBCDs在等于或低于溶解度的條件下不會(huì)導(dǎo)致急性毒性，但該類(lèi)化合物具有較高的生物濃縮系數(shù)。這表明HBCDs的急性毒性并不顯著，但其慢性毒性及亞致死毒性效應(yīng)不容忽視[16]。研究資料表明HBCDs具有生殖發(fā)育、神經(jīng)毒性及內(nèi)分泌干擾等毒性[15-19]。由于HBCDs與多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）結(jié)構(gòu)相似，由此推測(cè)，HBCDs具有較為顯著的甲狀腺激素干擾效應(yīng)[20]。目前，HBCDs的甲狀腺毒性效應(yīng)研究主要集中于大鼠及魚(yú)類(lèi)的血清，如Van-Der-Ven等[21]研究發(fā)現(xiàn)HBCDs會(huì)使大鼠腦垂體和甲狀腺重量增加，促甲狀腺激素水平增加，但此現(xiàn)象只出現(xiàn)在雌鼠體內(nèi)，其影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。HBCDs對(duì)魚(yú)類(lèi)組織中甲狀腺激素水平的研究卻鮮有報(bào)道，因此研究HBCDs對(duì)魚(yú)類(lèi)甲狀腺激素水平的影響具有重要意義。本研究以斑馬魚(yú)為受試生物，研究了不同劑量HBCDs飼料暴露對(duì)斑馬魚(yú)甲狀腺激素水平的影響，選取T3、T4、FT3、FT4以及T3/T4的比值為甲狀腺激素的水平指標(biāo)，進(jìn)一步揭示HBCDs的甲狀腺激素干擾效應(yīng)，為篩選和甄別環(huán)境內(nèi)分泌干擾物提供基礎(chǔ)資料，為生態(tài)環(huán)境安全及人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論支撐和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

全自動(dòng)熒光及化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀（Synergy HT，寶特儀器有限公司）；勻漿機(jī)（FS-2，德國(guó)IKA公司）；-80℃超低溫冰箱（Revco Value Series，賽默飛世爾科技公司）；低溫冷凍離心機(jī)（Sorvall Stratos，賽默飛世爾科技公司）；超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（Agilent 1260 LC/AB SCIEX 4000trap MS，美國(guó)安捷倫科技有限公司（液相色譜）/SCIEX）。

六溴環(huán)十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD），純度97%（百靈威公司）；丙酮、正己烷、甲醇（HPLC級(jí)，CNW）購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；斑馬魚(yú)成魚(yú)專(zhuān)用飼料（250～450 Microns，Zeigler，USA）購(gòu)自上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PBS緩沖液、魚(yú)三碘甲狀腺原氨酸（T3）、魚(yú)游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、魚(yú)四碘甲狀腺原氨酸（T4）、魚(yú)游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚(yú)成魚(yú)，體長(zhǎng)3.10～3.60 cm，體重0.55～0.80 g，購(gòu)自廣州芳村花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)前將斑馬魚(yú)在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)至少14 d以上，實(shí)驗(yàn)魚(yú)應(yīng)無(wú)明顯的疾病和肉眼可見(jiàn)的畸形。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣24 h的自來(lái)水，空調(diào)控制水溫為25℃左右。隨機(jī)選取健康活潑的斑馬魚(yú)用于暴露實(shí)驗(yàn)，放入50 L的玻璃魚(yú)缸中。實(shí)驗(yàn)中包括3個(gè)暴露組和1個(gè)對(duì)照組，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)養(yǎng)殖缸中放養(yǎng)斑馬魚(yú)65尾。每日9：30和16∶30投喂自制餌料（含不同濃度HBCD）2次，投飼量為體重2%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日換1次水，并盡量清除食物殘?jiān)芭判刮铮瑩Q水前后測(cè)水溫及溶解氧含量，每周清洗魚(yú)缸1次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，用外掛式過(guò)濾器持續(xù)微量曝氣，光暗比為14 h∶10 h，溶解氧、溫度、pH值等水質(zhì)參數(shù)符合斑馬魚(yú)生長(zhǎng)需要，水溫為25℃左右，pH 值為 7.34±0.18，電導(dǎo)率為 182.08±2.46 μS·cm-1，溶解氧為 7.65±0.94 mg·L-1，每日觀察斑馬魚(yú)有無(wú)行為異常、疾病或死亡情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 飼料制備與測(cè)定

1.3.1.1 飼料制備

本研究暴露劑量的設(shè)計(jì)以反映實(shí)際環(huán)境中HBCDs的暴露水平為原則，根據(jù)Du等[22]和Law等[23]實(shí)驗(yàn)中設(shè)置飼料濃度（5、50 ng·g-1）基本接近環(huán)境濃度的暴露劑量，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)較為接近環(huán)境濃度的暴露劑量：低濃度組（10ng·g-1）和中濃度組（100ng·g-1）。同時(shí)綜合考慮HBCDs的毒性資料，設(shè)置高濃度組（400 ng·g-1），與低濃度組和中濃度組進(jìn)行比較，觀察HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)的甲狀腺激素干擾及氧化應(yīng)激效應(yīng)。首先，將HBCDs工業(yè)品溶于丙酮，配制1 g·L-1的HBCDs丙酮溶液，并根據(jù)需要稀釋至不同梯度。暴露實(shí)驗(yàn)中所用飼料選取美國(guó)Zeigler公司生產(chǎn)的斑馬魚(yú)成魚(yú)專(zhuān)用飼料，將魚(yú)飼料置于圓底燒瓶中，然后加入不同濃度的HBCDs丙酮溶液，使飼料中HBCD的劑量分別為 10、100、400 ng·g-1，振蕩 1 h 使 HBCDs充分混勻于飼料中，混合物過(guò)夜風(fēng)干，使溶劑蒸發(fā)。對(duì)照組飼料用未添加HBCDs的丙酮作同樣處理。將飼料置于棕色瓶中，并存放于4℃冰箱中保存，以免光解。為考察投喂飼料后水中HBCDs的含量水平，保證飼料在斑馬魚(yú)攝食前未釋放到水中，將制備好的3組飼料（10、100、400 ng·g-1）均取 1 g分別投入至 1 L 超純水中，黑暗中靜置1 h后測(cè)定超純水中HBCDs的含量水平。

1.3.1.2 飼料中HBCDs的測(cè)定

飼料配制完成后，經(jīng)索氏抽提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、凝膠滲透色譜柱除脂肪以及氧化鋁硅膠柱凈化等前處理過(guò)程，利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）測(cè)定飼料中HBCDs的含量。飼料靜置后的超純水樣品經(jīng)過(guò)HLB柱富集萃取、濃縮凈化等過(guò)程后，同樣利用LC-MS/MS測(cè)定HBCDs的含量。每分析一批樣品同時(shí)分析質(zhì)量保證/質(zhì)量控制（QA/QC）樣品，包括方法空白、空白加標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)和樣品平行樣。甲醇空白樣品用來(lái)檢查實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有無(wú)來(lái)自溶劑或玻璃器皿的干擾或污染，其中均沒(méi)有HBCDs檢出或低于檢測(cè)限。空白加標(biāo)中 α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 的回收率分別為98%～118%、105%～116%、109～113%；基質(zhì)加標(biāo)中目標(biāo)物 α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 的回收率分別為87%～96%、86%～94%、83%～93%。

檢測(cè)可知，對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組飼料中HBCDs的實(shí)際含量水平分別為5.23、15.03、98.29、388.30 ng·g-1，與設(shè)定的濃度劑量基本接近。對(duì)照組中檢出HBCDs可能與飼料成分的背景值有關(guān)。對(duì)照組飼料中α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的含量分別為 0.80、0.64、3.78 ng·g-1。因?yàn)?α-HBCD為生物體內(nèi)主要的異構(gòu)體形式，且毒性較高，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組飼料中HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)的影響基本可以忽略。飼料溶解實(shí)驗(yàn)的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明：水中γ-HBCD未檢出，α-HBCD和β-HBCD有檢出，且濃度水平均較低（ND～0.023 ng·L-1和 ND～0.011 ng·L-1），基本可以忽略水體溶解的HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)的影響。

1.3.2 斑馬魚(yú)樣品前處理

斑馬魚(yú)暴露56 d后，每缸魚(yú)中隨機(jī)選取6尾，解剖取肝臟，每3尾魚(yú)混合為一個(gè)樣品，準(zhǔn)確稱(chēng)取肝臟組織重量，按照重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，加入9倍體積預(yù)冷的PBS緩沖溶液，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制成10%的組織勻漿液，以2500 r·min-1，離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.3.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.3.1 測(cè)定指標(biāo)及原理

利用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)斑馬魚(yú)肝臟中三碘甲狀腺原氨酸（T3）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）的含量水平。其工作原理為向預(yù)先包被了甲狀腺激素單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入甲狀腺激素，溫育；隨后加入生物素標(biāo)記的抗甲狀腺激素抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶；然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中甲狀腺激素濃度呈正相關(guān)。

1.3.3.2 測(cè)定方法

正式測(cè)定前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。首先挑選2～3例樣品10%的組織勻漿液，稀釋成不同濃度（5%、2%、1%、0.5%、0.25%）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，再選取甲狀腺激素含量接近標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度的組織勻漿液（保證實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，減小測(cè)定誤差），并將所有樣品稀釋至此濃度，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。具體操作過(guò)程參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。T3、T4、FT3和FT4的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以10%肝臟組織勻漿液中T3、T4、FT3和FT4的含量表示，每一暴露濃度組均設(shè)6個(gè)平行，表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SD）。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，利用單因素方差分析（ANOVA）比較不同濃度組的差異，并用最小極差法（LSD）多重比較法判斷差異顯著性，顯著性水平為0.05。當(dāng)P<0.05時(shí)，判定存在顯著性差異，圖中用*表示；當(dāng)P<0.01時(shí)，判定差異性極顯著，圖中用**表示。

圖1 魚(yú)類(lèi)組織中甲狀腺激素測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curves of thyroid hormones in fish tissues

2 結(jié)果與分析

2.1 HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中T3和T4的含量的影響

不同HBCDs飼料暴露濃度對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中T3和T4含量的影響如圖2所示。斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（56 d），隨著暴露濃度的增加，斑馬魚(yú)肝臟組織中T3和T4的含量逐漸降低，呈現(xiàn)較明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組相比，低濃度暴露組肝臟中T3和T4的含量顯著降低（P<0.05），中、高濃度暴露組肝臟中T3和T4的含量均極顯著降低（P<0.01）；HBCDs對(duì)高濃度暴露組肝臟中T3和T4的最高抑制率分別達(dá)到52.08%和60.15%。

圖3表示HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中T3/T4比值的影響。從圖中可以看出，長(zhǎng)期暴露情況下，隨著暴露濃度的增加，斑馬魚(yú)肝臟組織中T3/T4比值呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。經(jīng)56 d暴露后，低濃度暴露組斑馬魚(yú)肝臟中T3/T4比值與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而中濃度暴露組和高濃度暴露組中T3/T4比值顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

圖2 HBCDs對(duì)肝臟中T3和T4含量的影響（暴露時(shí)間56 d）Figure 2 Effects of exposure to HBCDs on T3 and T4 of liver in zebrafish（exposure for 56 days）

圖3 HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中T3/T4比值的影響（暴露時(shí)間56 d）Figure 3 Effects of exposure to HBCDs on the ratio of T3 to T4 of liver in zebrafish（exposure for 56 days）

2.2 HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中FT3和FT4的含量的影響

圖4表示不同HBCDs暴露濃度對(duì)斑馬魚(yú)肝臟組織中FT3和FT4含量的影響。從圖4中可以看出，與對(duì)照組相比，低濃度暴露組斑馬魚(yú)肝臟中FT3的含量水平略有增加，但差異不明顯（P>0.05）；中濃度暴露組FT3含量極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），抑制率為25.2%；高濃度暴露組FT3含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。從劑量效應(yīng)來(lái)看，斑馬魚(yú)肝臟組織中FT3的含量水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而后隨著暴露濃度的升高逐漸趨于與對(duì)照組水平相當(dāng)。從圖中可以看出，低濃度暴露組肝臟組織中FT4含量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），中濃度暴露組和高濃度暴露組中FT4含量水平均極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。上述結(jié)果表明：中濃度暴露組和高濃度暴露組中，HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中FT3和FT4均產(chǎn)生明顯的抑制作用，其中最高抑制率達(dá)到66.7%。

3 討論

甲狀腺激素對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育、生殖繁育及能量代謝等生理過(guò)程具有重要的調(diào)節(jié)與控制作用，魚(yú)類(lèi)甲狀腺受下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調(diào)節(jié)，通過(guò)下丘腦合成腎上腺釋放激素，刺激垂體產(chǎn)生和釋放促甲狀腺激素，促進(jìn)甲狀腺合成大量T4和少量T3。由于T4能夠同血液中的運(yùn)載蛋白結(jié)合，運(yùn)輸至肝臟、腦、腎臟等外周組織中，在脫碘酶的作用下，脫碘轉(zhuǎn)化形成生物活性更強(qiáng)的三碘甲腺原氨酸（T3）；一般結(jié)合型的激素不具有生物活性，只有游離的激素才能進(jìn)入細(xì)胞，且結(jié)合型和游離型激素之間保持動(dòng)態(tài)平衡[24]。研究表明，溴代阻燃劑（PBDEs、HBCDs等）內(nèi)分泌干擾物均能影響生物體內(nèi)甲狀腺激素水平及轉(zhuǎn)化過(guò)程[25]。

圖4 HBCDs對(duì)肝臟中FT3和FT4含量的影響（暴露時(shí)間56 d）Figure 4 Effects of exposure to HBCDs on FT3 and FT4 of liver in zebrafish（exposure for 56 days）

本研究中，與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期暴露下低濃度HBCDs飼料暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中的T3和T4產(chǎn)生抑制作用，中、高濃度水平HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中的甲狀腺激素T3和T4產(chǎn)生明顯的干擾作用；低濃度組斑馬魚(yú)肝臟中T3/T4比值與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而中、高濃度組呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)。這表明，長(zhǎng)期暴露下HBCDs可誘導(dǎo)甲狀腺激素T4向T3轉(zhuǎn)化。隨著暴露濃度的增加，斑馬魚(yú)肝臟組織中游離甲狀腺激素FT3和FT4的含量均呈現(xiàn)稍有升高后降低的趨勢(shì)，其中FT3在中濃度暴露組達(dá)到最低值，F(xiàn)T4在高濃度暴露組中達(dá)到最低值。Palace等[26]在研究HBCDs對(duì)虹鱒甲狀腺代謝的影響中，發(fā)現(xiàn)HBCDs可以減少虹鱒對(duì)碘的吸收，加快甲狀腺激素的轉(zhuǎn)化效率，從而增加暴露組中甲狀腺激素T4的轉(zhuǎn)化速率，促進(jìn)甲狀腺激素T3的合成，影響機(jī)體的代謝平衡，與本文研究結(jié)果基本一致。劉園園等[27]研究發(fā)現(xiàn)，HBCDs暴露42 d后，大鼠血清中TT4、TT3、FT4、FT3濃度隨著暴露劑量增大呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其中低劑量組的FT3濃度顯著性升高，高劑量組的FT4濃度顯著性下降，與本研究甲狀腺激素變化趨勢(shì)基本一致。冀秀玲等[28]研究HBCDs發(fā)育期暴露對(duì)甲狀腺激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)新生大鼠暴露于HBCDs 21 d后血清中TT4、FT4下降而TT3、FT3和TSH升高的趨勢(shì)，且低劑量暴露組也會(huì)對(duì)腦發(fā)育期新生大鼠產(chǎn)生甲狀腺激素干擾，T4和FT4的含量變化與本研究相似，其余指標(biāo)呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。這可能與受試生物不同相關(guān)。Palace等[29]研究了HBCDs異構(gòu)體對(duì)虹鱒血清中FT3和FT4的影響，發(fā)現(xiàn)暴露于HBCD的3種異構(gòu)體56 d后，虹鱒血清中FT4含量降低，F(xiàn)T3含量上升，與本文中FT3的變化趨勢(shì)相反。這可能由于物種及檢測(cè)組織不同所導(dǎo)致。在陳海剛等[30]的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HBCDs短期暴露，使低、中暴露組紅鰭笛鯛幼魚(yú)肝臟中T3和T4的含量顯著上升，而高濃度暴露組隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；肝組織中T3/T4比值低于對(duì)照組，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這一研究結(jié)果與本研究的結(jié)果不一致，可能與暴露時(shí)間、魚(yú)種類(lèi)不同有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，攝入飼料暴露HBCDs對(duì)魚(yú)類(lèi)甲狀腺激素產(chǎn)生干擾效應(yīng)，影響甲狀腺激素的內(nèi)穩(wěn)態(tài)水平。本研究中部分研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致，可能與暴露時(shí)間、受試物種、檢測(cè)組織、代謝轉(zhuǎn)化等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

（1）飼料長(zhǎng)期暴露HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中的T3和T4具有顯著性影響，隨著暴露濃度的增加，T3和T4具有明顯抑制作用；中、高濃度組暴露HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中T3/T4比值具有顯著影響。

（2）與對(duì)照組相比，低濃度暴露組HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中FT3和FT4的含量影響不明顯；而中、高濃度暴露組中HBCDs對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中FT3和FT4的含量水平具有顯著影響，呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)。

（3）通過(guò)飼料長(zhǎng)期攝入HBCDs，對(duì)魚(yú)類(lèi)甲狀腺激素（T3、T4、FT3、FT4）具有干擾效應(yīng)，干擾甲狀腺的調(diào)節(jié)機(jī)制，可能影響脫碘酶的活性而誘導(dǎo)甲狀腺激素T4向T3轉(zhuǎn)化，從而影響魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育。

[1]Koch C,Rupp R,Sures B.Review of hexabromocyclododecane（HBCD）with a focus on legislation and recent publications concerning toxicokinetics and dynamics[J].Environmental Pollution,2015,199：26-34.

[2]韓 倩.工業(yè)區(qū)土壤中六溴環(huán)十二烷的污染特征及熱轉(zhuǎn)化機(jī)理模擬研究[D].廣州：中國(guó)科學(xué)院大學(xué),2014.

HAN Qian.The simulation of thermal transformation of hexabromocyclododecane diastereoisomers and their pollution characteristics in soil samples from industrial areas[D].Guangzhou：University of the Chinese Academy of Sciences,2014.

[3]Mai B,Chen S,Luo X,et al.Distribution of polybrominated diphenyl ethers in sediments of the Pearl River Delta and adjacent South China Sea[J].Environmental Science&Technology,2005,39（10）：3521-3527.

[4]Koch C,Rupp R,Sures B.Review of hexabromocyclododecane（HBCD）with a focus on legislation and recent publications concerning toxicokinetics and dynamics[J].Environmental Pollution,2015,199：26-34.

[5]Ueno D,Alaee M,Marvin C,et al.Distribution and transportability of hexabromocyclododecane（HBCD） in the Asia-Pacific region using skipjack tuna as a bioindicator[J].Environmental Pollution,2006,144（1）：238-247.

[6]He M J,Luo X J,Yu L H,et al.Diasteroisomer and enantiomer-specific profiles of hexabromocyclododecane and tetrabromobisphenol A in an aquatic environment in a highly industrialized area,South China：Vertical profile,phase partition,and bioaccumulation[J].Environmental Pollution,2013,179（8）：105-110.

[7]Li H,Zhang Q,Wang P,et al.Levels and distribution of hexabromocyclododecane（HBCD）in environmental samples near manufacturing facilities in Laizhou Bay area,East China[J].Journal of Environmental Monitoring,2012,14（10）：2591-2597.

[8]Jin J,Yang C Q,Wang Y,et al.Determination of Hexabromocyclododecane diastereomers in soil by ultra performance liquid chromatographyelectrospray ion source/tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2009,37（4）：585-588.

[9]劉藝凱,王景芝,唐建輝,等.萊州灣河流表層沉積物中六溴環(huán)十二烷的含量水平、分布及組成特征[J].地球化學(xué),2014,43（1）：55-63.

LIU Yi-kai,WANG Jing-zhi,TANG Jian-hui,et al.Levels,distributions and isomer profiles of hexabromocyclododecanes in the riverine sediments of the Laizhou Bay area,East China[J].Geochimica,2014,43（1）：55-63.

[10]Feng A H,Chen S J,Chen M Y,et al.Hexabromocyclododecane（HBCD）and tetrabromobisphenol A（TBBPA）in riverine and estuarine sediments of the Pearl River Delta in Southern China,with emphasis on spatial variability in diastereoisomer-and enantiomer-specific distribution of HBCD[J].Marine Pollution Bulletin,2012,64（5）：919-925.

[11]Drage D S,Newton S,de Wit C A,et al.Concentrations of legacy and emerging flame retardants in air and soil on a transect in the UK West Midlands[J].Chemosphere,2016,148：195-203.

[12]張艷偉.六溴環(huán)十二烷異構(gòu)體及其對(duì)映體的環(huán)境分布與生物富集[D].天津：南開(kāi)大學(xué),2014.

ZHANG Yan-wei.Environmental distribution and bioaccumulation of hexabromocyclododecane diastereomers and enantiomers[D].Tianjin：Nankai University,2014.

[13]Poma G,Binelli A,Volta P,et al.Evaluation of spatial distribution and accumulation of novel brominated flame retardants,HBCD and PBDEs in an Italian subalpine lake using zebra mussel（Dreissena polymorpha）[J].Environmental Science and Pollution Research,2014,21（16）：9655-9664.

[14]Xian Q,Ramu K,Isobe T,et al.Levels and body distribution of polybrominated diphenyl ethers（PBDEs） and hexabromocyclododecanes（HBCDs）in freshwater fishes from the Yangtze River,China[J].Chemosphere,2008,71（2）：268-276.

[15]王雅靜.六溴環(huán)十二烷（HBCD）對(duì)黑點(diǎn)青鳉仔魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)影響的研究[D].廈門(mén)：廈門(mén)大學(xué),2014.

WANG Ya-jing.Effects of hexabromocyclododecane on nervous system and movement ability of Oryzias melastigma larvae[D].Xiamen：Xiamen University,2014.

[16]高永飛.氯化石蠟（CPs）和六溴環(huán)十二烷（HBCD）暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

GAO Yong-fei.Toxicity effects on zebrafish larvae following embryonic exposure of chlorinated parffins and hexabromocyclododecanes[D].Wuhan：Central China Agricultural University,2012.

[17]Fernie K J,Marteinson S C,Bird D M,et al.Reproductive changes in American kestrels（Falco sparverius）in relation to exposure to technical hexabromocyclododecane flame retardant[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2011,30（11）：2570-2575.

[18]Letcher R J.Diet exposure to technical hexabromocyclododecane（HBCD）affects testes and circulating testosterone and thyroxine levels in American kestrels（Falco sparverius）[J].Environmental Research,2011,111（8）：1116-1123.

[19]Saegusa Y,Fujimoto H,Woo G H,et al.Transient aberration of neuronal development in the hippocampal dentate gyrus after developmental exposure to brominated flame retardants in rats[J].Archives of Toxicology,2012,86（9）：1431-1442

[20]Capone,Francesca,Branchi,et al.Developmental exposure to polybrominated diphenyl ether（PBDE 99）alters thyroid homeostasis and induces neurobehavioural effects in CD-1 mice[J].Minerva Pediatrica,1954,6（2）：75-78.

[21]Van-Der-Ven L,Verhoef A D K T,Slob W,et al.A 28-day oral dose toxicity study enhanced to detect endocrine effects of hexabromocyclododecane in Wistar rats[J].Toxicological Sciences,2006,94（2）：281-292.

[22]Du M M,Lin L,Yan C,et al.Diastereoisomer-and enantiomer-specific accumulation,depuration,and bioisomerization of hexabromocyclododecanes in zebrafish（Danio rerio）[J].Environmental Science&Technology,2012,46（20）：11040-11046.

[23]Law K,Palace V P,Halldorson T,et al.Dietary accumulation of hexabromocyclododecane diastereoisomers in juvenile rainbow trout（Oncorhynchus mykiss） I：Bioaccumulation parameters and evidence of bioisomerization[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2006,25（7）：1757-1761.

[24]瞿璟琰,施華宏,劉青坡,等.污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)的甲狀腺激素干擾效應(yīng)及其作用機(jī)制[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2007,2（4）：375-380.

QU Jing-yan,SHI Hua-hong,LIU Qing-po,et al.Thyroid hormone disrupting effects of contaminants on fish and their mechanisms of action[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2007,2（4）：375-380.

[25]杜苗苗,張 嫻,顏昌宙.溴系阻燃劑的毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2012,7（6）：575-584.

DU Miao-miao,ZHANG Xian,YAN Chang-zhou.Advance in researches on toxicology of brominated flame retardants[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2012,7（6）：575-584.

[26]Palace V,Park B,Pleskach K,et al.Altered thyroxine metabolism in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）exposed to hexabromocyclododecane（HBCD）[J].Chemosphere,2010,80（2）：165-169.

[27]劉園園,冀秀玲,沈群輝,等.六溴環(huán)十二烷及其復(fù)合污染腦發(fā)育期暴露對(duì)大鼠甲狀腺激素代謝過(guò)程的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2012（9）：1614-1619.

LIU Yuan-yuan,JI Xiu-ling,SHEN Qun-hui,et al.Disrupting effects of hexabromocyclododecane（HBCD） and its complex compounds on rat thyroid hormone metabolism after developmental exposure[J].Ecology and Environmental Sciences,2012,21（9）：1614-1619.

[28]冀秀玲,劉 洋,劉 芳,等.六溴環(huán)十二烷轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白結(jié)合活性及其發(fā)育期暴露的甲狀腺激素干擾效應(yīng)研究[J].環(huán)境科學(xué),2010,31（9）：2191-2195.JI Xiu-ling,LIU Yang,LIU Fang,et al.Transthyretin-binding activity of hexabromocyclododecanes（HBCDs） and its thyroid hormone disrupting effects after developmental exposure[J].Environmental Sciences,2010,31（9）：2191-2195.

[29]Palace V P,Pleskach K,Halldorson T,et al.Biotransformation enzymes and thyroid axis disruption in juvenile rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）exposed to hexabromocyclododecane diastereoisomers[J].Environmental Science&Technology,2008,42（42）：1967-1972.

[30]陳海剛,孫立偉,張林寶,等.六溴環(huán)十二烷短期暴露對(duì)紅鰭笛鯛幼魚(yú)甲狀腺激素T3和T4含量的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2016,35（7）：1257-1263.

CHEN Hai-gang,SUN Li-wei,ZHANG Lin-bao,et al.Effects of short-term exposure to hexabromocyclododecane（HBCD）on T3 and T4 of liver and brain in juvenile crimson snapper（Lutjanus erythopterus）[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（7）：1257-1263.

Thyroid hormone-disrupting effects of hexabromocyclododecane in zebrafish（Danio rerio）

LIU Xiao-yan1,2,3,LIU Shan1,ZHANG Li-juan2,3,HAN Qian4,CHEN Mian-biao2,3,HUANG Chu-shan2,3,WEI Dong-yang2,3,HU Guo-cheng2,3*
（1.Key Laboratory of Subsurface Hydrology and Ecological Effects in Arid Region of Ministry of Education,Chang’an University,Xi’an 710064,China;2.South China Institutes of Environmental Sciences,Ministry of Environmental Protection,Guangzhou 510535,China;3.State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Pollution Health Risk Assessment,Guangzhou 510535,China;4.Shenzhen A－cademy of Environmental Sciences,Shenzhen 518001,China）

Hexabromocyclododecane（HBCD）is a brominated flame retardant,and has become a ubiquitous pollutant of the environment.To explore the thyroid hormone-disrupting effects of long-term dietary exposure to HBCD,adult zebrafish were exposed to different concentrations of the chemical（0,10,100 ng·g-1,and 400 ng·g-1）for 56 days to determine triiodothyronine（T3）,tetraiodothyronine（T4）,free triiodothyronine（FT3）,and free tetraiodothyronine（FT4）levels,and T3/T4 ratios in the liver tissues of zebrafish.The results showed that HBCD disrupted the action of the thyroid hormone in zebrafish.The levels of T3 and T4 in the liver tissues of the zebrafish decreased significantly with increasing concentrations of HBCD.Significant inhibitory effects on FT3 and FT4 were observed in the 100 ng·g-1and 400 ng·g-1exposure groups（P<0.01）.Moreover,the T3/T4 ratio in the liver tissues increased with increasing HBCD concentration.This result indicated that HBCD could transform T4 into T3.In summary,our findings showed that HBCD could affect thyroid function and homeostatic levels in zebrafish,and could further influence the growth and development of zebrafish.

hexabromocyclododecane;zebrafish;thyroid hormone;disruption

X503.225

A

1672-2043（2017）11-2192-07

10.11654/jaes.2017-0509

劉小燕，劉 珊，張麗娟,等.六溴環(huán)十二烷對(duì)斑馬魚(yú)的甲狀腺激素干擾效應(yīng)研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（11）：2192-2198.

LIU Xiao-yan,LIU Shan,ZHANG Li-juan,et al.Thyroid hormone-disrupting effects of hexabromocyclododecane in zebrafish（Danio rerio）[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）:2192-2198.

2017－04－08 錄用日期：2017-07-13

劉小燕（1992—），女，山東聊城人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)及水污染控制工程。E-mail：gengjiayanzi@163.com

*通信作者：胡國(guó)成 E-mail：huguocheng@scies.org

廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313790，2015A030313863，2014A030310002）；環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目

Project supported：The Natural Science Foundation of Guangdong Province,China（2015A030313790，2015A030313863，2014A030310002）；The Basic Research Foundation of National Commonwealth Research Institute