孫一帆,梁新紅*,高瑩瑩

(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

自然發(fā)酵的葡萄醋中醋酸菌的分離鑒定

孫一帆,梁新紅*,高瑩瑩

(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

為了了解自然發(fā)酵葡萄醋中醋酸桿菌的生長特性,采用分離純化培養(yǎng)、定性試驗(yàn)等方法,從葡萄醋中篩選出優(yōu)勢菌株SP001,通過菌落和細(xì)胞形態(tài)、生理生化試驗(yàn)以及16S rRNA序列分析等方法對菌株進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明,菌株SP001被鑒定為巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus),其最大產(chǎn)酸量為2.31 g/100 mL,酒精轉(zhuǎn)化率為73.29%。

醋酸菌;分離純化;生長特性;鑒定

隨著人們生活水平的不斷提高,果醋的營養(yǎng)保健功能也越來越受到人們的重視。與食醋相比,果醋的營養(yǎng)成分更為豐富,含有十多種有機(jī)酸和人體必需的多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、碳水化合物、微量元素等[1],其中果醋發(fā)酵菌種是影響果醋品質(zhì)的關(guān)鍵因素。當(dāng)前我國用于液體醋生產(chǎn)的醋酸菌菌種主要有AS1.41和滬釀1.01醋酸桿菌,該菌種應(yīng)用于果醋生產(chǎn)不僅產(chǎn)酸能力低、耐酒精能力有待提高,而且形成的風(fēng)味也不佳。因此,為了提高果醋產(chǎn)量,改善產(chǎn)品風(fēng)味,當(dāng)前的研究工作主要集中于從自然界分離培養(yǎng)高效專一菌種和對現(xiàn)有菌種進(jìn)行誘變選育。周幗萍等[2]以大米糖化汁培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基,從市售的醋酸菌粉和武漢錦春調(diào)味品廠的醋醅中分離得到了8株產(chǎn)酸快,轉(zhuǎn)化率高的醋酸菌,并以其中的3株試制木瓜果醋取得了良好的效果。陳洋等[3]從工業(yè)醋醅中分離出5株耐乙醇、耐高溫的產(chǎn)醋酸菌株,利用生理生化試驗(yàn)和16S rDNA同源序列分析,初步認(rèn)定其為巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus),通過對其耐乙醇、耐高溫發(fā)酵特性的研究,發(fā)現(xiàn)菌株FY4具有高耐受性,可產(chǎn)生大量的醋酸,在工業(yè)生產(chǎn)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。吳越等[4]從杏皮渣汁自然發(fā)酵液、固態(tài)發(fā)酵醋醅和杏園的土壤中分離醋酸菌,對分離菌株進(jìn)行產(chǎn)酸曲線的測定及生理生化鑒定,對產(chǎn)酸量高的菌株進(jìn)行16SrDNA序列測定,在杏皮渣汁自然發(fā)酵液中分離得到的菌株Ac02為醋桿菌屬(Acetobacter)的Acetobacter pomorumLMG 18848,是一株在杏皮渣醋生產(chǎn)中有應(yīng)用潛力的醋酸菌。

本試驗(yàn)以自然發(fā)酵的葡萄醋為樣品,采用分離純化培養(yǎng)、定性試驗(yàn)等方法,從中篩選出醋酸菌菌種,再通過革蘭氏染色、菌種的形態(tài)特征、生理生化等特征以及16S rRNA對其進(jìn)行鑒定[5-7],并測定醋酸菌產(chǎn)酸量、醋酸菌生長曲線,對該菌種的生長特性進(jìn)行研究,為該菌種今后在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵的葡萄醋:實(shí)驗(yàn)室自制;葡萄糖、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、無水乙醇、瓊脂、蒸餾水、酚酞指示劑、溴甲酚紫、FeCl3、NaOH、結(jié)晶紫染色液、碘液、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、番紅染液、二甲苯、香柏油:天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;凝膠回收試劑盒、15 000+2 000 bp DNA Maker:上海生工生物有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒:北京Solarbio公司;pUCm-T載體試劑盒、脫氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTP):寶生物工程(大連)有限公司;10×PCR buffer、TAE buffer、TaqDNA聚合酶:歐瑞卡(北京)科技有限公司。

增殖培養(yǎng)基:1%酵母膏、2%葡萄糖、0.3%K2HPO4、0.2%MgSO4·7H2O,在電爐上加熱攪拌至完全溶解后在121℃、0.1 MPa高壓滅菌鍋中滅菌25 min,待冷卻至70℃以下加6%vol的無水乙醇。

平板分離培養(yǎng)基:1%酵母膏、2%葡萄糖、0.3%K2HPO4、0.2%MgSO4·7H2O、2%瓊脂,121℃、在電爐上加熱攪拌至完全溶解后在121℃、0.1 MPa高壓滅菌鍋中滅菌25 min,待冷卻至70℃以下加3%vol的無水乙醇,pH值自然。

斜面保藏培養(yǎng)基:同分離培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:1%酵母膏、2%葡萄糖,pH自然,121℃滅菌25 min,冷卻至70℃加入3%vol無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

SH-250P生化培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器公司;HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器公司;BS223S電子天平:賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司;WFJ7200分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司;CX21FS1C生物顯微鏡:奧林巴斯(廣州)工業(yè)有限公司;DYY-6C恒流恒壓電泳儀:北京市六一儀器廠;D-37520型高速冷凍離心機(jī):德國Sigma公司;HH·W21·600-S電熱恒溫水溫箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;T-GradientPCR儀:德國Biometra公司;BIO-BEST 140E型凝膠圖像分析系統(tǒng):美國西盟公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酸菌株的篩選

(1)初篩:采用平板涂布分離法[8],取1 mL果醋,制成10-3至10-5稀釋度的樣品稀釋液,分別取0.3 mL稀釋液涂布到加有溴甲酚紫指示劑的平板上,每個(gè)稀釋度制2個(gè)平板,在30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d左右,然后挑取其中菌落長勢良好,分布均勻,透明圈大而清晰,且個(gè)數(shù)適中的1個(gè)平板中的全部單菌落進(jìn)行復(fù)篩。

(2)復(fù)篩:采用劃線分離法進(jìn)行復(fù)篩[9],分別挑1環(huán)活化好的初篩菌株轉(zhuǎn)接于分離培養(yǎng)基中,在30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d左右,然后挑取其中菌落長勢良好的菌種接種于斜面固體培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面保存。

(3)產(chǎn)酸定性試驗(yàn):各挑取1環(huán)復(fù)篩后的菌株,分別接種于含3%vol乙醇的100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃恒溫靜置培養(yǎng)72h。離心后取5 mL除去菌體的培養(yǎng)液于小燒杯中,用0.1 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0,煮沸后加入5%FeCl3溶液5～6滴,觀察現(xiàn)象,如形成紅褐色沉淀則為產(chǎn)醋酸細(xì)菌[10]。

(4)耐酒精能力測定:將發(fā)酵起始酒精度加水稀釋,分別調(diào)整為2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol,發(fā)酵溫度設(shè)為30℃,接種量10%,培養(yǎng)基pH為自然,發(fā)酵時(shí)間為10 d,測定醋酸含量。

1.3.2 菌種生長曲線測定

將保存的已鑒定菌株在斜面培養(yǎng)基上活化2次,然后各取1環(huán)接種于4個(gè)分別裝有100 mL增殖培養(yǎng)基的三角瓶中,標(biāo)號1#～4#,1#瓶作為對照放入冰箱保存。另3個(gè)三角瓶置于30℃、100 r/min搖床中培養(yǎng),用分光光度計(jì)在610 nm波長條件下每隔3 h測一次吸光度值,直至濁度不變?yōu)橹?。以?xì)菌菌懸液的吸光度值為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制其生長曲線[11]。

1.3.3 產(chǎn)酸量的測定

將菌種連續(xù)活化2次后,接種于增值培養(yǎng)基中,于(30±0.5)℃、100 r/min搖床培養(yǎng)8 d,采用堿式滴定法(以醋酸計(jì))[12]。每隔24 h測定一次產(chǎn)酸量。測定其最大產(chǎn)酸量及出現(xiàn)時(shí)間,并計(jì)算酒精轉(zhuǎn)化率。產(chǎn)酸量、醋酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下[13]:

式中:V為NaOH滴定樣品的末讀數(shù),mL;V0為NaOH滴定樣品的初讀數(shù),mL;CNaOH為標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的濃度,mol/L;L為樣品體積,mL;60為醋酸相對分子質(zhì)量。

1.3.4 產(chǎn)酸菌株的形態(tài)特征

將復(fù)篩得到的產(chǎn)酸最高的一株菌,接種于平板培養(yǎng)基中30℃恒溫培養(yǎng)2 d后,觀察單菌落形態(tài),取單菌落,涂片并用革蘭氏染色法[14]在油鏡下觀察該菌株菌體形態(tài)。

1.3.5 生理生化試驗(yàn)

主要包括乙醇氧化、乙酸氧化、接觸酶、乳酸氧化、產(chǎn)葡萄糖酸檢驗(yàn)、甘油生酮實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)纖維素實(shí)驗(yàn)等[15-17]。

1.3.6 菌株的分子生物學(xué)鑒定

(1)PCR引物

16SrRNA正向引物:5'-AGG AAG CGG AAGAAT G-3'

16SrRNA反向引物:5'-TAGCCT TGCCCT CAA T-3'

(2)醋酸菌活化培養(yǎng)

將保存于-80℃冰箱的實(shí)驗(yàn)室前期分離、純化獲得的醋酸菌轉(zhuǎn)接至裝有已高壓滅菌處理后的液體培養(yǎng)基中(接種量按1∶50進(jìn)行活化培養(yǎng))?；罨? h后用,采用劃線培養(yǎng)的方式分離單菌落。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于高壓滅菌的液體培養(yǎng)基中(100 mL三角瓶中含有25 mL液體培養(yǎng)基)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。

(3)醋酸菌基因組的提取

取1 mL上述培養(yǎng)好的醋酸菌菌液放入1.5 mL的Eppendorf管中,室溫、5 000 r/min條件下離心2 min,棄上清;沉淀用1.0 mL含量為0.85%的NaCl溶液進(jìn)行重懸,4℃、13000r/min離心5min,棄上清;沉淀物用520μLTE緩沖液進(jìn)行重懸,向菌液中加入17μL的溶菌酶裂解細(xì)菌,裂解條件為:37℃水浴30min;向反應(yīng)溶液中加蛋白酶K(20 mg/mL)

至終質(zhì)量濃度為100 ng/mL,充分混勻裂解蛋白,裂解條件為:30℃水浴30 min;加30 μL10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)使蛋白進(jìn)一步變性,反應(yīng)條件為:30℃水浴30 min;繼續(xù)加入100 μL 5 mol/L NaCl溶液,務(wù)必充分混勻;加80 μL十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)/NaCl溶液混勻,并繼續(xù)反應(yīng),反應(yīng)條件為:保持65℃水浴10 min;加等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1,V/V)混勻,抽提細(xì)菌DNA;4 ℃、13 000 r/min,離心10 min,去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì);用移液器緩慢吸取上清液至1.5 mL離心管中,加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)進(jìn)一步抽提細(xì)菌DNA,混勻、離心;用移液器緩慢吸取1.5 mL上清液至新離心管,加0.6倍體積異丙醇混勻,沉淀DNA,反應(yīng)條件為:室溫,靜置60 min;離心,棄上清,加500 μL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇混勻,洗滌DNA;離心、重新懸浮、重復(fù)3次,充分洗滌抽提的DNA;洗滌結(jié)束后,倒置離心管,干燥DNA沉淀20min;最后,將通過該方法抽提獲得的DNA溶于60μL TE緩沖液,-20℃條件下保存?zhèn)溆肹18]。

(4)16S rRNA PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物檢測

以上述方法制備的醋酸菌菌種基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板,采用總反應(yīng)體系為50.0 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。試驗(yàn)中所采用的PCR反應(yīng)程序?yàn)?先于98℃保持5 min進(jìn)行預(yù)變性,然后于98℃保持10 s使模版變性,然后將溫度降到56℃保持15 s使引物與模版充分退火,在72℃保持2 min使引物在模版上延伸,該反應(yīng)程序循環(huán)次數(shù)為28次,PCR產(chǎn)物與10℃保存。

PCR反應(yīng)體系(50 μL):5×Prime STAR Buffer(反應(yīng)緩沖液)10.0 μL,dNTP Mixture(原料)4.0 μL,上、下游引物各1.0 μL,Primer STAR HS DNA Polymerase(聚合酶)0.5 μL,ddH2O 32.5 μL,基因組DNA 1 μL。將PCR反應(yīng)體系分成3組,2個(gè)為試驗(yàn)組,另一組為陰性對照組(模板用ddH2O替代)。

電泳膠體制備:取200 mg的瓊脂糖加入20 mL電泳緩沖液中(1×TAE),利用微波爐加熱溶解瓊脂糖(要求溶液透明、無顆粒狀物),將試驗(yàn)溶液冷卻至55℃左右,使用移液器滴加1 μL的EB試劑,充分混勻,并將其倒入制膠板中。等待凝膠凝固,放入電泳槽中,緩沖液液面需高于膠體,檢查電泳電極放置情況,加樣孔務(wù)必位于電泳槽的負(fù)極。取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer上樣緩沖液均勻混合,然后用移液器緩慢加入到膠體加樣孔中進(jìn)行電泳分析,電泳條件為:電壓220 V,電流300 mA,電泳液為1×TAE,時(shí)間為20 min。如果PCR擴(kuò)增成功,將膠體放入凝膠成像系統(tǒng)后,可獲取1 670 bp的條帶圖像。

(5)16S rRNA基因片段的測序及分析

將獲得的PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體按照試劑盒說明書上的操作要求就行連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并驗(yàn)證為陽性的重組質(zhì)粒,通過相關(guān)公司進(jìn)行基因序列片段測序。測序結(jié)果數(shù)據(jù)輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中,利用網(wǎng)站中提供的在線BLAST功能組件對本試驗(yàn)測序獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)上傳的序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

2.1.1 產(chǎn)酸醋酸菌初篩結(jié)果

從自然發(fā)酵的葡萄醋中選取樣品,利用平板涂布法,分離得到單菌落醋酸菌菌株,涂布法培養(yǎng)后平板內(nèi)出現(xiàn)大而清晰的透明圈,隨著醋酸菌的生長,醋酸菌產(chǎn)生的酸不斷增多,形成的透明圈也不斷變大。如圖1所示,在相同的時(shí)間內(nèi),由于產(chǎn)酸量的不同,菌落周圍透明圈的大小也有明顯的差別。挑取其中菌落長勢良好,透明圈大而清晰,菌落分布均勻的菌種繼續(xù)分離培養(yǎng)。

圖1 醋酸菌初篩后的透明圈示意圖Fig.1 Sketch map of transparent circle of acetic acid bacteria after preliminary screening

2.1.2 產(chǎn)酸醋酸菌復(fù)篩結(jié)果

采用劃線分離法將所挑選的初篩菌種進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后得到大小一致、長勢良好的醋酸菌菌落。該醋酸菌菌落以乳白色為主,呈圓形,突起,表面較光滑,然后挑取其中一株菌落長勢良好的菌種做產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)和鏡檢,將其命名為SP001。

2.1.3 菌株產(chǎn)酸定性結(jié)果

取5 mL除去菌體的發(fā)酵液,用0.1 mol/L NaOH溶液中和至中性,煮沸后用5%三氯化鐵溶液滴定,部分發(fā)酵瓶內(nèi)的菌液產(chǎn)生磚紅色沉淀,說明該發(fā)酵液中有醋酸產(chǎn)生,證明此菌株為產(chǎn)醋酸菌株;未出現(xiàn)磚紅色沉淀,則說明該發(fā)酵液中沒有醋酸產(chǎn)生,證明此菌株不產(chǎn)醋酸或活性太低。

2.2 菌株產(chǎn)酸能力測定

將菌株連續(xù)活化2次后,接種于增值培養(yǎng)基中,于30℃、100 r/min搖床培養(yǎng)7 d,采用堿式滴定法(以醋酸計(jì))每隔24 h測定一次產(chǎn)酸量,對該菌株的產(chǎn)酸特性進(jìn)行研究,結(jié)果見圖2。

由圖2可知,醋酸菌SP001產(chǎn)酸量在第7天達(dá)到最大,最大產(chǎn)酸量為2.31 g/100 mL,此時(shí)酒精轉(zhuǎn)化率為73.29%。

圖2 醋酸菌SP001產(chǎn)酸曲線Fig.2 Acid production curve of acetic acid bacteria SP001

2.3 菌株耐酒精能力測定

將發(fā)酵起始酒精度分別設(shè)定為2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol,發(fā)酵溫度設(shè)為30℃,接種量10%,培養(yǎng)基pH為自然,發(fā)酵時(shí)間為10 d。結(jié)果見圖3。

圖3 醋酸菌SP001耐酒精能力Fig.3 Ethanol tolerance of acetic acid bacteria SP001

由圖3可知,當(dāng)酒精度為6%vol時(shí),醋酸含量達(dá)到最大值為(5.86±0.11)g/100 mL。在酒精度＞6%vol時(shí),醋酸含量出現(xiàn)下降趨勢,在酒精度為10%vol時(shí),醋酸含量下降至(1.43±0.09)g/100 mL。由此推斷,醋酸菌SP001的最佳耐受酒精度為6%vol。

2.4 菌株鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)觀察結(jié)果

經(jīng)過篩選得到的醋酸桿菌在瓊脂平板上的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果見圖4。

圖4 醋酸菌SP001的菌落(A)及細(xì)胞(B)形態(tài)Fig.4 Morphology of colonial(A)and cell(B)of acetic acid bacteria SP001

由圖4A可知,醋酸菌SP001菌落以乳白色為主,呈圓形、突起,表面較光滑,然后挑取其中菌落長勢良好的菌株做鏡檢。由圖4B可知,該醋酸桿菌革蘭氏染色為陽性,細(xì)胞為短桿狀或橢圓狀,單生或成對或成鏈生長;同時(shí)也可看出該菌種活性較強(qiáng),顯微鏡下菌種數(shù)目為多不可計(jì)。

2.4.2 生理生化試驗(yàn)

對已分離的醋酸菌SP001進(jìn)行生理生化試驗(yàn),測定結(jié)果見表1。由表1可知,所分離的菌株SP001的乙醇氧化、乙酸氧化及乳酸氧化試驗(yàn)、接觸酶、產(chǎn)葡萄糖酸、甘油生酮、產(chǎn)5-酮葡萄糖酸試驗(yàn)結(jié)果呈陽性;產(chǎn)纖維素、葡萄糖發(fā)酵、氧化酶、淀粉水解、產(chǎn)γ-吡喃酮試驗(yàn)結(jié)果呈陰性,符合醋酸菌所具備的生化特征。

2.4.3 分子生物學(xué)鑒定

醋酸菌SP001的16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖5。由圖5可知,在15000bp處得到了一條清晰且無彌散的條帶,說明擴(kuò)增成功,可以進(jìn)行16S rRNA基因序列測定。

圖5 醋酸菌SP001的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.5 Agarose electrophoresis of PCR amplification products of acetic acid bacteria SP001

圖6 醋酸菌SP001系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of acetic acid bacteria SP001

由圖6可知,將擴(kuò)增產(chǎn)物序列測定后,結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中利用BLAST軟件進(jìn)行分析[19-21],可以得出分離菌株SP001和NBRC14818是同屬菌株。根據(jù)鑒定結(jié)果,分離醋酸桿菌SP001為巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)。

3 結(jié)論

篩選出的醋酸菌確定為革蘭氏陽性菌,無芽孢。對其16S rRNA片段克隆與序列分析鑒定及前期對醋酸菌生物學(xué)特征的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),該菌株與網(wǎng)上公布的醋酸菌菌株NBRC14818有97%的序列同源性,因此可以判斷這兩種菌是同屬菌種屬于同一個(gè)屬,但是因其序列相似性未達(dá)到99%以上,且16S rRNA序列種間變化很大,因此極有可能非同一個(gè)種,鑒定獲得的醋酸菌為巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)SP001,該菌株培養(yǎng)前12 h為延滯期,12～36 h為該菌株的生長對數(shù)期。以自然發(fā)酵的葡萄醋為樣品,經(jīng)過多次分離純化,最終篩選出純化醋酸菌,其醋酸產(chǎn)量為2.31g/100mL,酒精轉(zhuǎn)化率為73.29%。由于試驗(yàn)所采用的樣品是自然發(fā)酵的果醋,所以篩選出的醋酸菌株產(chǎn)酸能力不高,因此還需進(jìn)一步誘變育種,以提高發(fā)酵中醋酸的產(chǎn)量。

[1]牛蕾,楊幼慧.健康食品——果醋[J].中國釀造,2004,23(2):9-11.

[2]周幗萍,汪芳安,高 冰.醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究[J].中國釀造,2004,23(6):20-21.

[3]陳 洋,汪 超,高 冰,等.高耐受性醋酸菌的篩選及發(fā)酵特性研究[J].中國釀造,2015,34(12):34-39.

[4]吳 越,張富縣,艾乃吐拉·馬合木提,等.杏皮渣醋酸發(fā)酵醋酸菌的分離篩選和鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,50(7):1297-1303.

[5]TZORTZAKIS N,CHRYSARGYRIS A,SIVAKUMAR D,et al.Vapour or dipping applications of methyl jasmonate,vinegar and sage oil for pepper fruit sanitation towards grey mould[J].Postharvest Biol Tech,2016,118(4)：120-127.

[6]ESCALANTE A,RODRíGUEZ M E,MARTíNEZ A,et al.Characterization of bacterial diversity in Pulque,a traditional Mexican alcoholic fermented beverage,as determined by 16S rDNA analysis[J].FEMS Microbiol Lett,2004,235(2)：273-279.

[7]LOONGSK,KHORCS,JAFARFL,et al.Utilityof16SrDNAsequencing for identification of rare pathogenic bacteria[J].J Clin Lab Anal,2016,30(6)：1056-1060.

[8]威 晉,劉鳳霞,李永祥,等.高產(chǎn)醋酸菌的分離選育[J].中國釀造,1999,18(5):20-22.

[9]張 贊,梁關(guān)霞,席 超,等.優(yōu)勢醋酸菌株QA-9號選育及其初步鑒定[J].中國釀造,2010,29(3):46-48.

[10]宮 強(qiáng),關(guān)道明,王耀兵,等.大腸桿菌總DNA快速提取方法的比較研究[J].海洋環(huán)境科學(xué),2005,24(4):63-66.

[11]姜曉芝,李志西.產(chǎn)酸菌株的分離及初步鑒定[J].中國釀造,2008,27(23):53-56.

[12]劉 蕓,曹 宜,劉 波.開菲爾粒中醋酸菌的分離鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,27(5):544-549.

[13]張忠明.高產(chǎn)醋酸菌的篩選及其形態(tài)生化特征研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,41(1):83-86.

[14]何文兵,劉雪蓮,馬冬雪.自然發(fā)酵的葡萄皮醋中醋酸菌的分離鑒定[J].中國釀造,2012,31(4):79-81.

[15]張紀(jì)忠.微生物分類學(xué)[M].上海:復(fù)旦大學(xué)出版社,1990:12.

[16]宋勇強(qiáng),胡先望,沙 芮,等.一株高產(chǎn)酸醋酸菌的分離與鑒定[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2015,27(9):997-1003.

[17]張霽紅,李明澤,曾朝珍,等.優(yōu)勢醋酸菌株的篩選鑒定及乙醇脫氫酶活性研究[J].中國釀造,2017,36(5):100-104.

[18]李元召,孫俊良,李冬霄,等.一株產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌16SrDNA的克隆及序列分析[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,41(3):3-4.

[19]蘇 波,康建平,黃 靜.16S rDNA序列分析鑒定一株芽孢桿菌[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(5):1-3.

[20]黃繼翔.產(chǎn)堿性蛋白酶芽孢菌株的鑒定[J].微生物通報(bào),2011,38(2):157-163.

[21]陳相達(dá),戴慧慧,劉 燕.一株高產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,41(1):40-47.

SUN Yifan,LIANG Xinhong*,GAO Yingying
(School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

TS26

0254-5071(2017)11-0028-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.007

2017-06-20

國家自然基金面上項(xiàng)目(31771941);河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(16IRTSTHN007)

孫一帆(1989-),女,助教,碩士,研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品釀造和安全控制。

*通訊作者:梁新紅(1971-),女,副教授,博士,研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)分離純化、功能性物質(zhì)和發(fā)酵食品釀造和安全控制。