丁宇，楊磊，王晨光，田愷，劉鳳娟，于燕燕

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308）

食品級(jí)過(guò)氧化氫在細(xì)胞水平的毒理學(xué)研究

丁宇，楊磊，王晨光，田愷，劉鳳娟，于燕燕

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308）

過(guò)氧化氫作為強(qiáng)氧化劑的代表物之一，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，起到防腐、漂白、除臭等作用。而食品中殘留及非法添加的過(guò)氧化氫對(duì)消費(fèi)者健康存在著嚴(yán)重危害。近年來(lái)，細(xì)胞毒理學(xué)作為一門熱門學(xué)科，用于研究外源性物質(zhì)對(duì)生命細(xì)胞損傷作用規(guī)律及其機(jī)制，從而進(jìn)行食品安全性分析，具有準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)和研究領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)研究食品級(jí)過(guò)氧化氫的危害。

過(guò)氧化氫；細(xì)胞毒理學(xué)；食品安全

過(guò)氧化氫（H2O2）以其優(yōu)良的氧化、漂白、消毒作用，廣泛運(yùn)用在各類化工、食品、紡織、醫(yī)藥、電子及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域[1]。近年來(lái)，隨著我國(guó)食品行業(yè)不斷發(fā)展，食品級(jí)過(guò)氧化氫在食品領(lǐng)域中的礦泉水、乳品、飲料、水產(chǎn)品、水果、啤酒等食品生產(chǎn)過(guò)程中廣泛運(yùn)用。由于利益驅(qū)使及監(jiān)管不足的內(nèi)外因素，導(dǎo)致其在食品工藝中存在超標(biāo)添加的問(wèn)題，進(jìn)而引發(fā)各類食物中毒事件。例如利用過(guò)氧化氫加工雞爪、泡椒魚(yú)皮、漂白開(kāi)心果等。按照我國(guó)近年所頒布的食品添加劑運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，過(guò)氧化氫在達(dá)到食品級(jí)別的要求下，可用于食品加工制備，不過(guò)在制成出售前，要求能及時(shí)清除，并嚴(yán)格檢測(cè)，只有在其含量達(dá)標(biāo)的情況下，才可以銷售。

在發(fā)達(dá)國(guó)家，過(guò)氧化氫的使用在劑量、使用范圍、都受到嚴(yán)格監(jiān)督。在我國(guó)，當(dāng)前百姓越來(lái)越關(guān)注健康問(wèn)題，對(duì)于各類食品添加劑的殘留也越來(lái)越重視，眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一旦人體攝入過(guò)量的過(guò)氧化氫，必定會(huì)造成身體的傷害，包括對(duì)細(xì)胞的損害，加速人體衰老、及引發(fā)器官癌變等[2]，尤其是其能產(chǎn)生過(guò)量的羥基自由基，將參與到人體內(nèi)的羥基化反應(yīng)及電子轉(zhuǎn)移，造成人體細(xì)胞的壞死或病變，從而危害人體健康，屬于毒性各類毒性中的最大自由基。

相關(guān)研究顯示，過(guò)氧化氫的檢測(cè)方式很多，包括化學(xué)滴定法、分光光度法、高效液相色說(shuō)來(lái)法、熒光光度法、電化學(xué)分析法等[3-4]。近年來(lái)，隨著細(xì)胞水平毒理學(xué)檢測(cè)與研究逐漸興起，通過(guò)對(duì)外源性毒害因子所產(chǎn)生的致癌性，對(duì)機(jī)體細(xì)胞毒性和特異細(xì)胞毒作用、毒物代謝及其毒效應(yīng)的作用機(jī)制的等方式，來(lái)開(kāi)展藥物篩選、食品安全性分析。此外，細(xì)胞培養(yǎng)還將對(duì)功能食品的效果成分展開(kāi)毒性評(píng)價(jià)[5-8]。現(xiàn)階段，有關(guān)細(xì)胞毒理學(xué)已在食品界獲得廣泛運(yùn)用，細(xì)胞毒理學(xué)透過(guò)離體培育的細(xì)胞不僅能用作研究目標(biāo)毒物對(duì)于靶細(xì)胞毒性和其毒物于細(xì)胞內(nèi)展開(kāi)的生物轉(zhuǎn)化[9-10]。還可用作研究目標(biāo)毒物對(duì)靶細(xì)胞的功能，通過(guò)細(xì)胞毒理學(xué)有助于有效評(píng)價(jià)食品安全性，達(dá)到檢測(cè)食物中的毒素、重金屬及農(nóng)藥殘留、添食品加劑等[11-13]。

本文利用細(xì)胞毒理學(xué)中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)研究食品級(jí)過(guò)氧化氫的危害。

1 材料

1.1 材料與試劑

無(wú)鈣臺(tái)氏液：135 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2，0.33 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，5.5 mmol/L葡萄糖，用NaOH溶液調(diào)至pH7.4；含鈣臺(tái)氏液：于無(wú)鈣臺(tái)氏液中加進(jìn)CaCl2至1.8 mmol/L；KB液：50 mmol/L聚谷氨酸，40 mmol/L KCl，20 mmol/L ?；撬?，20 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），3 mmol/L MgCl2，以 KOH 溶液調(diào)pH7.4；膠原酶、蛋白酶：日本公司 Yakult公司；H2O2、5，5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸）：Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器

Facscan流式細(xì)胞儀：美國(guó)Dickinson公司；HHS電熱恒溫水浴鍋：天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FV300激光掃描共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司；311A細(xì)胞培養(yǎng)箱：日本ESPC公司；3K15離心機(jī)：德國(guó)sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌細(xì)胞分離

試驗(yàn)選擇選用健康成年豚鼠（300 g～400 g），1%戊巴比妥鈉按進(jìn)行腹腔注射麻醉后，取出心臟并將主動(dòng)脈連于Langendorff灌流裝置中，維持37℃恒溫及供氧條件以含鈣臺(tái)氏液連續(xù)灌流約3 min（沖洗心臟內(nèi)殘血，予以細(xì)胞更加充裕的氧），無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流約6 min（解除心肌細(xì)胞內(nèi)橋粒與連接），以含0.05%膠原酶無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流到心室肌組織被消化（解離細(xì)胞間結(jié)締組織）；以KB液灌流沖洗并剪碎其中的心室肌組織，再機(jī)械分散至單個(gè)細(xì)胞，接著以濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，再以0.002 5%蛋白酶孵育3 min；離心3次（每次3 min）；所得細(xì)胞存儲(chǔ)在KB液，將溫度調(diào)至4℃保存。

1.3.2 細(xì)胞鈣瞬變的測(cè)定

將制備而成豚鼠心肌細(xì)胞內(nèi)加進(jìn)二甲基亞砜（DMSO）溶液，將其稀釋至 25 μmol/L 的 Fluo-340 μL染色，此后將培養(yǎng)皿放置在37℃水浴箱內(nèi)，避光水浴30 min后，加進(jìn)無(wú)鈣液400 μL沖洗2次；通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡，于視野下找出細(xì)胞（挑選出其中形態(tài)良好、染色程度最好的），以該顯微鏡展開(kāi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的熒光值變化并記錄下來(lái)，即為鈣離子的濃度變化。

參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)（λex）488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）520 nm。分別加進(jìn)濃度5 mmol/L的過(guò)氧化氫10、20、30μL，通過(guò)氧化氫終濃度：0.125、0.25、0.375 mmol/L，運(yùn)用Time Coursw程序進(jìn)行平面掃描，各試驗(yàn)組均掃描60張，每張間隔10 s，持續(xù)性觀察各試驗(yàn)組500 s內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度（FI）產(chǎn)生的變化情況。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率

將心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，隨機(jī)分成NC組，0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2處理組，分別作用 1、3、6、12 h，隨后通過(guò)（AO/EB）染色法展開(kāi)檢測(cè)。用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，通過(guò)200個(gè)細(xì)胞計(jì)算凋亡率。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

將每10秒所對(duì)應(yīng)鈣離子熒光值減掉基線鈣離子熒光值，所獲得的數(shù)據(jù)作為某時(shí)鈣瞬變熒光強(qiáng)度，取其中50個(gè)時(shí)間點(diǎn)并計(jì)算平均值，代表鈣瞬變熒光強(qiáng)度值。透過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，針對(duì)多樣本比較運(yùn)用單因素方差法展開(kāi)分析，以P<0.05代表具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 心肌細(xì)胞鈣瞬變

不同濃度H2O2對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變影響見(jiàn)表1、圖 1。

表1 不同濃度H2O2對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變影響Table 1 Different concentrations of H2O2induced Intracellular Ca2+transient

圖1 0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變Fig.1 Intracellular Ca2+transient induced by 0.1，0.25，0.5 mmol/L H2O2

由表1可見(jiàn)，在加入3種不同濃度（0.1、0.25、0.5 mmol/L）H2O2引起鈣瞬變?cè)黾?，而且隨濃度升高而增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著（P<0.01）分別為84.07±19.68，269.82±59.61，478.09±87.15。心肌細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞，正常情況下不存在明顯的凋亡。

2.2 細(xì)胞凋亡

H2O2各劑量組的細(xì)胞凋亡率和空白對(duì)照組展開(kāi)比較，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在作用時(shí)間1、3 h下H2O2組均伴隨H2O2濃度增大，豚鼠心肌細(xì)胞凋亡率隨之增大；作用到6 h時(shí)，0.25 mmol/L劑量組細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高值23.3%，該峰值后細(xì)胞凋亡率便隨H2O2濃度增大而下降；作用12 h的H2O2組隨H2O2濃度增大，細(xì)胞凋亡率隨之增大，至0.25 mmol/L時(shí)凋亡率達(dá)18.9%的峰值，此后隨H2O2濃度增大反下降。

心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，在正常情況下是無(wú)明顯凋亡的。不過(guò)疾病狀態(tài)之下，比如心肌梗塞、缺血、缺氧及再灌注損傷，心肌細(xì)胞將產(chǎn)生顯著凋亡；本結(jié)果證實(shí)低劑量（0.1、0.25、0.5 mmol/L）H2O2可明顯強(qiáng)化心肌細(xì)胞鈣離子濃度，同時(shí)還有著時(shí)間和劑量依賴性，從而可誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而對(duì)整個(gè)人體健康造成危害[14-15]。

H2O2對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞凋亡率影響見(jiàn)表2。

表2 H2O2對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞凋亡率影響Table 2 Flow cytometry analyses of cell apoptosis induced by H2O2

3 結(jié)論

1）Ca2+屬于眾多細(xì)胞凋亡信號(hào)載體，對(duì)于細(xì)胞生存和凋亡存在重要作用[16-18]，本試驗(yàn)通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞熒光值變化，代表鈣離子濃度變化，發(fā)現(xiàn)0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2能明顯增加心肌細(xì)胞的鈣離子濃度，并且呈時(shí)間及劑量依賴性。

2）豚鼠心肌細(xì)胞在 0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2影響下DNA凋亡率隨著暴露劑量增加而增加。

本試驗(yàn)中的過(guò)氧化氫作為外源性活性氧，進(jìn)入人體內(nèi)后可作為信號(hào)，通過(guò)誘導(dǎo)線粒體的通透性轉(zhuǎn)為變孔開(kāi)放，推動(dòng)線粒體的鈣離子內(nèi)流，同時(shí)令細(xì)胞自身線粒體和其它線粒體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)是透過(guò)影響電壓的依賴性鈣離子通道從而令非特異性細(xì)胞膜鈣離子通透性產(chǎn)生變動(dòng)及產(chǎn)生鈉鈣離子交換等，進(jìn)而影響鈣離子（Ca2+）由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放[19]，進(jìn)而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+穩(wěn)態(tài)，促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)超負(fù)荷反應(yīng)[20]。由此可判定外源性過(guò)氧化氫透過(guò)心肌細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)受損，造成內(nèi)源性活性氧生成的增加，進(jìn)而出現(xiàn)氧化應(yīng)激，推動(dòng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的重新分布，最終誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

本文利用細(xì)胞毒理學(xué)中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)，研究食品級(jí)過(guò)氧化氫的對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變以及細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為今后食品級(jí)過(guò)氧化氫檢測(cè)及毒理學(xué)研究提供參考。

[1]張平均.食品級(jí)過(guò)氧化氫的消毒特性及其在食品行業(yè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)乳品工業(yè),2005(7):47-50

[2]陳迪航,李綿慶.過(guò)氧化氫的應(yīng)用領(lǐng)域與主要生產(chǎn)方法[J].化工技術(shù)與開(kāi)發(fā),2011,40(3):32-35

[3]黃玉艾,王菲,盧靜.細(xì)胞技術(shù)在食品毒理學(xué)毒性快速篩選方面的應(yīng)用研究[J].食品科學(xué),2007(8):535-537

[4]S G Rhee,T S Chang,W Jeong,et al.Methods fordetection and measurement of hydrogen peroxide inside andoutside of cells[J].Molecules and Cells,2010,29(6):539-549

[5]MAIER E,KURZ K,JENNY M,et al.Food preservatives sodiumbenzoate and propionic acid and colorant curcumin suppress The L-type immune response in vitro[J].Food and Chemical Toxicology,2010,48(7):1950-1956

[6]BRUNER L H,CARR G J,CURREN R D,et al.Validation of alternativemethods for toxicity testing[J].Environ Health Perspect,1998,106(2):477-484

[7]Makris SL,Kim JH,Ellis A,et al.Current and future needs for developmental toxicity testing.[J].Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol,2011,92(5):384-394

[8]PIERSMA AH.Alternative methods for developmental toxicity testing[J].Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology,2006,98(5):427-431

[9]沈雪,王昊,關(guān)爽,等.細(xì)胞毒性在食品安全性中的應(yīng)用研究[J].食品科學(xué),2008,29(9):621-623

[10]黃玉艾,王菲,盧靜.細(xì)胞技術(shù)在食品毒理學(xué)毒性快速篩選方面的應(yīng)用研究[J].食品科學(xué),2007,28(8):535-537

[11]MWANZA M,KAMETLER L,BONAI A,et al.The cytotoxic effect offumonisin B1 and ochratoxin A on human and pig lymphocytes usingthe Methyl Thiazol Tetrazolium (MTT)assay.[J].Mycological Research,2009,25(4):233-238

[12]PENG Liang,WANG Bochu,REN Peng.Reduction of MTT by flavonoids in the absence of cells[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2005,45(2):108-111

[13]BREDFELDT T G.Low-level Arsenic toxicity in human bladder cells[D].Arizona:The University of Arizona,2006

[14]徐長(zhǎng)慶,張偉華.心血管系統(tǒng)鈣敏感受體的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病理生理雜志,2010,26(2):409-413

[15]吳強(qiáng),陳吉.氧化應(yīng)激與心肌細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)心血管病研究雜志,2004,2(7):570-572

[16]Yang L,Xu J,KameyamaM.Mechanisms underlying the modulation of L-type Ca2+channel by hydrogenperoxide in guinea pig ventricular myocytes[J].Physiol Sci.Nov,2013,63(6):419-426

[17]高青華,朱彤,楊磊.壬基苯酚對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣電流的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,39(2):81-83

[18]Brookes PS,Yoon Y,Robotham JL,et al.Calcium,ATP,and ROS:Amitochondriallove-hatetriangle[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2004,287(4):817-833

[19]東方,高世勇,季宇彬.Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,29(13):1602-1604

[20]Kroemer G,Reed JC.Mitochondrial control of cell death[J].Na Med,2000,6(5):513-519

Toxicological Studies on Food Grade Hydrogen Peroxide at Cell Level

DING Yu，YANG Lei，WANG Chen-guang，TIAN Kai，LIU Feng-juan，YU Yan-yan
（Technical Center for Safety of Industrial Products of Tianjin Enter-Exit Inspection Quarantine Bureau，Tianjin 300308，China）

As one of the representative of strong oxidizing agent，hydrogen peroxide is widely used in the food industry.However，there is a serious harm to the health of consumers in the food residue and illegally added hydrogen peroxide.In recent years，as a hot subject，cellular toxicology has been used to study the law and mechanism of the damage of exogenous substances on living cells which has a good application prospect in the field of food safety detection and research.In this paper，the changes of cell morphology and cell apoptosis were used to study the harm of food grade hydrogen peroxide.

hydrogen peroxide；cell toxicology；food safety

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.038

丁宇（1980—），男（漢），高級(jí)工程師，研究生，研究方向：危險(xiǎn)品檢測(cè)。

2017-03-23