馬寧寧，謝春花，游瀅瀅，張爽，宋洋

（天津師范大學生命科學學院天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

多效唑對平菇生理生化及動態(tài)殘留的影響

馬寧寧，謝春花，游瀅瀅，張爽，宋洋*

（天津師范大學生命科學學院天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

多效唑是一種生長調節(jié)劑也是殺菌劑，其在菌菇中的限量標準并不明確。研究噴施不同濃度多效唑50、100、150、200、250、300 μg/mL對采后10 d內平菇子實體中多效唑的動態(tài)殘留情況以及其對子實體的失重率、蛋白質含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）酶活性的影響。結果表明，在平菇施加50 μg/mL多效唑，采后2 d的殘留量會降解至0.5 μg/mL（MRL）以下；施加150 μg/mL的多效唑，采后5 d后殘留量會低于最高限量殘留（maximum residue limit，MRL）；同時，較高濃度的多效唑（150、200 μg/mL）對降低失重、維持營養(yǎng)和保護酶等生理指標的穩(wěn)定，具有一定的作用。綜上所述，多效唑在平菇中的建議使用濃度不超過150 μg/mL。

多效唑；平菇；生理生化；動態(tài)殘留

平菇（Pleurotus ostreatus）富含蛋白質、維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分[1]，是一種人工大面積栽培的食用菌，新鮮的菇體的含水量可以達到90%，在菌體的表面沒有顯著的保護結構[2]，不便于采后保存，故采摘后常溫保存時間為2 d～3 d，貨架期非常短[3-4]。因此，應加強對菌菇保鮮技術的開發(fā)，延長貨架期。

多效唑，又稱氯丁唑，是一種常見的植物生長調節(jié)劑，低毒無致畸、致癌、致突變作用[5]，大鼠兩代繁殖的毒性最大的無作用劑量是41.4 mg/（kg·d）[6]，人體每日允許的攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0.1 mg/kg[7]，容易被植物吸收，可以抑制植物生長，提高葉綠素含量，促進根的形成[8]，同時可促進形成花芽，坐果等[9]，在農(nóng)業(yè)中的應用在于它對作物生長的控制效應。研究發(fā)現(xiàn)，多效唑可調節(jié)農(nóng)產(chǎn)品的生長速率，影響農(nóng)產(chǎn)品生理生化過程。2017年，蘇昭柏等[10]通過研究不同濃度多效唑對秧苗素質的影響發(fā)現(xiàn)100 μg/mL的多效唑溶液浸種可以控制苗高、提高秧苗素質，張磊等[11]發(fā)現(xiàn)噴施多效唑可以提高小豆籽粒的可溶性糖和淀粉總量，達到增產(chǎn)的目的；2016年，殷文濤等[12]研究了不同濃度多效唑處理對西瓜幼苗生長生理的影響表明在西瓜種子萌芽期噴施5 μg/mL的多效唑、子葉微展期噴施10 μg/mL的多效唑均可降低植株高度、提高葉綠素含量和根系活力，吳娟等[13]研究不同濃度多效唑對板栗的影響發(fā)現(xiàn)多效唑濃度為300 μg/mL時保護酶活性最高、植株抗逆性最強。多效唑作為生長抑制劑目前美國只允許在草坪草上使用，歐盟允許其在蘋果和梨上使用。目前中國、歐盟、日本、澳大利亞等制定了多效唑在水果、蔬菜、糧食和油料等多種作物中的最大殘留限量值[14]，其中我國規(guī)定荔枝、稻谷、小麥、蘋果、菜籽油、花生仁中多效唑的限量殘留是0.5 μg/mL，油料中為 0.2 μg/mL[15]，雖然多效唑在中國登記的作物不包括食用菌，也未制定其相關最大殘留限量，據(jù)雜志報道[16]，多效唑已被應用于部分食用菌。本試驗擬通過研究采后施加不同濃度多效唑對平菇的生理生化影響及在平菇子實體中的殘留動態(tài)結果分析，對多效唑對采后平菇的生理生化影響以及合理噴施濃度進行分析判斷，為多效唑在平菇采后的應用提供理論支撐，為多效唑在其他食用菌中的應用研究提供科學依據(jù)，為食用菌中多效唑殘留限量標準的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平菇：新鮮平菇，采摘于天津市農(nóng)業(yè)科學院林果所。采后立即運回天津師范大學生命科學學院，清理，4℃保存。

甲醇（國產(chǎn)色譜純）：天津市化學試劑供銷公司；乙腈：美國賽默飛世爾科技有限公司；SPE固相萃取柱（1 000 mg，6 mL）：美國塞分科技有限公司；多效唑的標準品（99%）：山東省西亞化學工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀：美國Waters公司；固相萃取儀：天津市奧特賽恩斯儀器有限公司；紫外分光光度計（Lambda 35）：美國Perkin Elmer公司。

1.3 多效唑殘留量的測定

1.3.1 溶液配制

標準溶液：精確稱取多效唑標準品質量0.005 0 g（精確至0.000 1 g），甲醇溶液溶解定容稀釋至濃度為0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL，過 0.22 μm 濾膜，待用。

施用多效唑溶液：稱取多效唑標準品，少量甲醇溶液溶解，用水稀釋到 50、100、150、200、250、300μg/mL，每個濃度的溶液200 mL。

1.3.2 色譜條件

流速是1 mL/min；溫度為40℃；波長是220 nm；進樣量為20 μL；色譜柱為XBridge C18色譜柱；流動相是乙腈∶水=1∶1（體積比）。

1.3.3 樣品處理

稱已經(jīng)粉碎好的平菇子實體樣品5.00 g，加入乙腈溶液10 mL，渦旋，加入NaCl 1.50 g靜置10 min渦旋后8 000 r/min，10 min離心，取上清液備用。然后用5 mL甲醇和5 mL水預處理固相萃取柱，取上清液過柱，再用5 mL水和5 mL 5%甲醇淋洗萃取柱，棄去淋洗液，抽干小柱，5 mL甲醇洗脫小柱，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 生理指標測定方法

失重率測定：失重率/%=（菇體初始時的質量-菇體測定時的質量）/菇體初始時的質量×100。

蛋白質含量測定：考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。

可溶性糖、丙二醛含量測定：《植物生理實驗指導》第四版——丙二醛的測定。

SOD酶活性測定：《植物生理實驗指導》第四版——超氧化物岐化酶活性的測定：比色法。

POD酶活性測定：《植物生理實驗指導》第四版——過氧化物酶活性的測定（Ⅱ）：比色法。

1.5 處理方法

試驗設置6個處理，在平菇采摘前1天噴施已配制好的施用多效唑溶液，對照用蒸餾水，采摘時每個處理平菇采摘質量為3.00 kg，4℃密封（LDPE保鮮自封袋，400 mm×250 mm×0.020 mm）保存。

在噴施藥品并風干后 2 h、2 d、5 d、8 d、10 d 測定平菇樣品的多效唑的殘留情況和失重率等生理生化指標。

2 結果與分析

2.1 多效唑在平菇中的動態(tài)殘留

本試驗通過對提取方法、凈化方法、色譜條件的優(yōu)化，最終確定的試驗條件是乙腈提取，SPE固相萃取柱萃取凈化。液相色譜檢測時檢測條件為流動相是乙腈∶水=1∶1（體積比），檢測波長為220nm，柱溫是40℃。

2.1.1 標準曲線和檢出限

結果表明，在 0.20 μg/mL～10.00 μg/mL 濃度范圍內多效唑的質量濃度與對應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性范圍，其回歸曲線方程是y=48 693x+298.17，R2=0.999 7，測得方法的檢出限為0.005 μg/mL。標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve line

2.1.2 樣品測定

本試驗對平菇子實體噴施的不同濃度多效唑（0～300 μg/mL）在10 d內的動態(tài)殘留變化進行分析。根據(jù)我國規(guī)定多效唑在果蔬中的最高殘留限量標準（MRL）為0.5 μg/mL，不同濃度多效唑在平菇子實體中的殘留見表1。

表1 不同濃度多效唑在平菇子實體中殘留情況Table 1 Residual situation of different concentrations of paclobutrazol in Pleurotus ostreatus

由表1結果可以看出，噴施多效唑兩天，除50μg/mL噴施濃度外，其它噴施濃度的子實體殘留量均超過MRL。隨著時間變化，多效唑動態(tài)殘留趨勢是逐漸下降的，這與多效唑在平菇子實體中的降解有關。多效唑濃度低于150 μg/mL時5 d～10 d后殘留量均低于MRL；噴施濃度大于150 μg/mL時，殘留量始終高于MRL，且其降解程度逐漸減小。這是由于高濃度的多效唑對子實體生長代謝產(chǎn)生了抑制作用，阻礙了菌絲體對多效唑的降解過程。

不同濃度多效唑處理在平菇子實體中殘留量差異顯著性結果表明，各組處理間多效唑殘留量差異均極顯著，這說明多效唑在平菇子實體中的殘留情況與噴施濃度有關，隨多效唑噴施濃度的增加，其殘留量變化情況是先上升后下降的。多效唑可以影響細胞內SOD等酶的活性和脫落酸、赤霉素等激素的含量，同時也會影響細胞質膜的穩(wěn)定性[17]，過高濃度的多效唑會破壞子實體的細胞穩(wěn)定性，造成子實體吸收多效唑的能力下降，故多效唑使用量過高時，其殘留量會下降。

2.2 不同濃度的多效唑對平菇失重率的影響

采后平菇的質量損失包括水分損失和呼吸損失，失重率是菇體采后品質變化的重要指標之一，不同濃度多效唑處理下平菇子實體失重率變化見表2。

表2 不同濃度多效唑對平菇子實體失重率的影響Table 2 Effects of different concentrations of paclobutrazol on the weight loss rate of Pleurotus ostreatus

由表2可知，平菇子實體失重率隨貯藏時間的增加而增加。在整個貯藏期內，所有處理組的菇體失重率與對照組相比差異均極顯著（P＜0.01），多效唑施用濃度的越高子實體的失重率越小，且150、200 μg/mL多效唑濃度處理的平菇子實體失重率的變化最小，差異不顯著（P＞0.05），而 250、300 μg/mL 多效唑濃度處理的平菇子實體失重率與150、200 μg/mL多效唑濃度處理組相比差異極顯著。

2.3 不同濃度的多效唑對平菇中可溶性糖含量的影響

糖類是生物體中主要的供能物質，生物體中糖類含量的高低反映出生物體代謝活動的強弱。多效唑對平菇子實體可溶性糖含量的影響見表3。

表3 多效唑對平菇子實體可溶性糖含量的影響Table 3 Effect of Paclobutrazol on Soluble Sugar Content of Pleurotus ostreatus

由表3可知，貯藏時間越長平菇子實體中可溶性糖含量越低；隨著噴施多效唑濃度的增加，平菇子實體中可溶性糖含量的下降趨勢有所緩解，且多效唑濃度越高，可溶性糖含量的變化越小，且多效唑濃度為250 μg/mL和300 μg/mL時，可溶性糖含量變化極小。由此可知，多效唑可以緩解采后平菇中可溶性糖的分解，保持子實體的品質和質量。

2.4 不同濃度的多效唑對平菇中丙二醛含量的影響

丙二醛含量的高低表示細胞的膜脂過氧化的程度以及細胞對逆境條件的反應程度。多效唑對平菇子實體中丙二醛變化的影響見表4。

表4 多效唑對平菇子實體中丙二醛變化的影響Table 4 Effect of paclobutrazol on the content of malondialdehyde in Pleurotus ostreatus

由表4看出，噴施多效唑溶液可以調節(jié)平菇子實體中丙二醛的產(chǎn)生。試驗結果表明，與對照組相比，噴施多效唑溶液的平菇子使體內丙二醛增量變緩，且濃度低于200 μg/mL時，多效唑濃度越高，其丙二醛含量變化量隨之減小，而多效唑濃度高于200 μg/mL時，子實體內丙二醛含量的變化量不再隨多效唑噴施濃度的增加而減少。說明多效唑處理可以提高子實體的抗逆性，減少子實體內丙二醛的含量。

2.5 不同濃度的多效唑對平菇中蛋白質含量的影響

平菇的生長發(fā)育和采后成熟衰老的過程中，蛋白質總量的變化與平菇組織的生理生化過程密切相關。多效唑對平菇子實體蛋白質總量的影響見表5。

表5 不同濃度多效唑對平菇蛋白質含量的影響Table 5 Effects of different concentrations of paclobutrazol on protein content of Pleurotus ostreatus

由表5可知，隨著貯藏時間的增加平菇中蛋白質含量是逐漸減少的，隨著多效唑噴施濃度的增加平菇中蛋白質含量的變化趨勢變緩，且在整個貯藏期內，所有處理組的菇體蛋白質含量與對照組相比差異均極顯著（P＜0.01），其他組相比多效唑濃度為250 μg/mL和300 μg/mL時，平菇子實體中蛋白質含量的變化量極小。由此可知，多效唑可以減緩平菇中蛋白質含量的降低，保持平菇品質。

2.6 不同濃度的多效唑對平菇中SOD、POD酶活性的影響

SOD對氧自由基有強烈清除作用，維持活性氧代謝平衡。多效唑對平菇子實體SOD酶活性的影響見表6。

表6 不同濃度多效唑對平菇SOD酶活性的影響Table 6 Effects of different concentrations of paclobutrazol on SOD activity of Pleurotus ostreatus

測定結果見表6，平菇子實體中SOD酶活性隨貯藏時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但酶活性峰值出現(xiàn)時間由于多效唑的使用發(fā)生改變。與對照相比，除多效唑濃度為250、300 μg/mL外，隨多效唑噴施濃度的增加，平菇SOD酶活性峰值出現(xiàn)時間隨之推遲，并且最終SOD酶活性與對照組相比差異均極顯著（P＜0.01），其中多效唑濃度為 150 μg/mL 和 200 μg/mL時，其酶活性峰值出現(xiàn)時間最晚，最終酶活性較高，二者差異性不顯著（P＞0.05）。

POD可分解氧化氫分解，避免過氧化氫對生物有機體的毒害作用。菇體中的POD酶活性越強，菇體的抗逆性就越強。多效唑對平菇子實體POD酶活性的影響見表7。

表7 多效唑對平菇子實體POD酶活性的影響Table 7 Effect of paclobutrazol on POD activity of Pleurotus ostreatus

測定結果如表7，隨貯藏時間的增加平菇子實體中POD酶活性呈先上升后下降的趨勢。除多效唑濃度為300 μg/mL外，試驗組中平菇子實體最終POD酶活性極顯著（P<0.01）高于對照組。除多效唑濃度為250、300μg/mL外，處理組中平菇子實體POD酶活性的峰值出現(xiàn)時間均為第5天，對照組峰值出現(xiàn)時間為第2天。

3 結論

通過多效唑動態(tài)殘留結果分析，噴施多效唑的濃度低于150 μg/mL時，平菇子實體中多效唑在第10天時的殘留量低于MRL，多效唑濃度高于150 μg/mL時，多效唑殘留量均高于MRL，且動態(tài)殘留趨勢發(fā)生改變，其原因與多效唑不僅是一種生長抑制劑還是一種殺菌劑有關，過高濃度的多效唑會破壞對平菇菌絲體結構的穩(wěn)定性，從而影響其代謝過程對平菇子實體的生長代謝產(chǎn)生抑制作用。在多效唑對平菇采后生理生化影響的研究中發(fā)現(xiàn)，平菇采前1天噴施150 μg/mL和200 μg/mL的多效唑溶液可以抑制平菇的自身代謝過程，減緩水分的損失，延緩平菇的衰老，延長其保存時間，增加平菇的經(jīng)濟價值；多效唑使用濃度為250 μg/mL和300 μg/mL時，平菇子實體的失重率、蛋白質含量、可溶性糖含量、丙二醛含量以及酶活性變化趨勢均發(fā)生改變，其原因是過高濃度的多效唑會破壞平菇的菌絲穩(wěn)態(tài)，抑制其正常生長代謝，這與多效唑動態(tài)殘留研究試驗所得結論一致。綜合以上結果，建議平菇中使用多效唑的濃度應不超過150 μg/mL。

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Effects of Paclobutrazol on Physiological，Biochemical and Dynamic Residues of Pleurotus Ostreatus

MA Ning-ning，XIE Chun-hua，YOU Ying-ying，ZHANG Shuang，SONG Yang*
（Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Paclobutrazole was a growth regulator and a fungicide，and its limited standard in bacteria was not clear.The effects of different concentrations of paclobutrazol 50，100，150，200，200，300 μg/mL on the dynamic residues and physiological and biochemical effects of paclobutil in Pleurotus ostreatus were investigated.The physiological and biochemical indexes included the weight loss rate of the fruiting body Content，soluble sugar content，malondialdehyde content，superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）enzyme activity.The results showed that 50 μg/mL paclobutrazol was applied to Pleurotus ostreatus and the residual amount was reduced to 0.5 μg/mL（MRL）after 2 days.Apply 150 μg/mL of paclobutrazol，residues were lower than the maxi mum residue after 5 days.At the same time，higher concentrationsof paclobutrazol （150 μg/mL and 200 μg/mL）had a certain effect on reducing the stability of physiological factors such as weight loss，maintenance nutrition and protective enzymes.In view of the above，paclobutrazol in Pleurotus ostreatus recommended concentration of not more than 150 μg/mL.

paclobutrazol；Pleurotus ostreatus；physiology and biochemistry；dynamic residue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.037

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301487）；天津市科技計劃項目（13JCQNJC14800）；天津市科技計劃項目（14ZCDGNC00098）

馬寧寧（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測。

*通信作者：宋洋（1983—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品安全與檢測。

2017-08-21