潘訓(xùn)彬，張秀霞，魯耀鵬，鄭佩華，王安利，冼健安?

氨氮和亞硝酸鹽對紅螯螯蝦幼蝦和亞成蝦的急性毒力

潘訓(xùn)彬1，張秀霞2，魯耀鵬1，鄭佩華1，王安利1，冼健安2?

1華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510631；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71101

【目的】近年來，紅螯螯蝦養(yǎng)殖面積越來越廣泛，明確不同規(guī)格的紅螯螯蝦對氨氮和亞硝酸鹽的耐受力，有利于提高其養(yǎng)成率，促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。【方法】在水溫24～25℃、pH 7.9～8.0的條件下，研究了氨氮和亞硝酸鹽對紅螯螯蝦幼蝦和亞成蝦的急性毒性，分析半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)?！窘Y(jié)果】總氨氮對紅螯螯蝦幼蝦的24、48、72和96 h LC50分別為 188.0、136.15、104.67 和 88.00 mg·L-1，SC 為 8.80 mg·L-1；總氨氮對亞成蝦的 24、48、72 和 96 h LC50分別為344.01、270.46、205.15 和 167.68 mg·L-1，SC 為 16.77 mg·L-1；非離子氨對幼蝦的 24、48、72 和 96 h LC50分別為 10.16、7.35、5.65和 4.75 mg·L-1，SC 為0.48 mg·L-1；非離子氨對亞成蝦的 24、48、72 和96 h LC50分別為18.58、14.60、11.08 和 9.05 mg·L-1，SC為 0.91 mg·L-1；亞硝酸鹽對幼蝦的 24、48、72 和 96 h LC50分別為 46.76、33.88、27.97 和 22.81 mg·L-1，SC 為 2.28 mg·L-1；亞硝酸鹽對亞成蝦的 24、48、72 和 96 h LC50分別為 77.56、59.33、45.41 和 37.48 mg·L-1，SC 為 3.75 mg·L-1。 【結(jié)論】紅螯螯蝦對氨氮的耐受力高于亞硝酸鹽，亞成蝦對氨氮和亞硝酸鹽的耐受力高于幼蝦。

紅螯螯蝦；氨氮；亞硝酸鹽；急性毒性

紅螯螯蝦Cherax quadricarinatus(von Martens)原產(chǎn)自澳大利亞，是目前世界上主要養(yǎng)殖的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類之一。紅螯螯蝦自20世紀(jì)90年代便已引入我國試養(yǎng)，由于蝦苗繁殖量低及凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei Boone正處于養(yǎng)殖熱潮，致使紅螯螯蝦沒能大面積推廣，僅有少量規(guī)模的養(yǎng)殖。近年來，凡納濱對蝦疾病頻發(fā)、養(yǎng)成率低下，羅非魚養(yǎng)殖也面臨利潤空間低等狀況，這些主養(yǎng)品種一直處于低迷且難以短時(shí)恢復(fù)的狀態(tài)。紅螯螯蝦具備食性廣、個(gè)體大、生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、出肉率較高、肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)(趙云龍等，2000)。近幾年，借著克氏原螯蝦Procambarus clarkii Girard的養(yǎng)殖勢頭，紅螯螯蝦的養(yǎng)殖規(guī)模也逐漸擴(kuò)大。但是，紅螯螯蝦養(yǎng)殖方面的研究仍較少，主要集中在育苗技術(shù)方面的研究報(bào)道(羅文等，2004；吳志新等，2000；趙云龍等，2000)。氨氮和亞硝酸鹽是水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖過程中主要的2種水體毒性污染物(寇紅巖等，2014；冼健安等，2014)，本文研究了氨氮和亞硝酸鹽對2種規(guī)格的紅螯螯蝦的毒性，確定了半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)，以期為紅螯螯蝦的人工養(yǎng)殖提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用紅螯螯蝦購自海南省瓊海市某私人養(yǎng)殖場，幼蝦體長 25～38 mm，體重 0.83～1.88 g，亞成蝦體長72～93 mm，體重38.31～54.92 g。實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖1周，水溫24～25℃，pH 7.9～8.0，溶解氧5.6～6.0 mg·L-1。 實(shí)驗(yàn)前停食24 h，選取處于蛻皮間期、健康無病患、附肢完整的螯蝦作為實(shí)驗(yàn)用蝦。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

毒性實(shí)驗(yàn)參考羅靜波等(2005)和鐘君偉等(2013)的方法。實(shí)驗(yàn)在放置30 L水的塑料儲物箱(52.5 cm×37.5 cm×32 cm)中進(jìn)行。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定濃度范圍后，再按等對數(shù)間距分別設(shè)置對照組和7個(gè)濃度梯度組，濃度設(shè)置如表1所示。以NH4Cl(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)作為氨氮來源，NaNO2(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)作為亞硝酸氮來源，根據(jù)設(shè)定的濃度準(zhǔn)確稱量并溶解到水中。幼蝦組每箱放置幼蝦20尾，亞成蝦組放置10尾，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)期間不投喂，及時(shí)取出死亡個(gè)體及排污，觀察記錄24、48、72和96 h的死亡個(gè)體數(shù)。為保證水體的實(shí)驗(yàn)濃度穩(wěn)定，每24 h換水及投藥一次。

表1 氨氮和亞硝酸鹽氮的實(shí)驗(yàn)濃度Table 1 The experimental doses of ammonia-N and nitrite-N

1.3 數(shù)據(jù)處理

死亡率數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey多重比較分析組間差異性顯著程度，P＜0.05為差異性顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 SPSS 18.0的 Probit分析法計(jì)算LC50，其中響應(yīng)頻率(response frequency)為死亡個(gè)數(shù)，觀測值匯總(total observed)為實(shí)驗(yàn)動物數(shù)(幼蝦60尾、亞成蝦30尾)，協(xié)變量(covariates)為相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)劑量，模型(model)設(shè)定為概率(probit)，轉(zhuǎn)化(transform)設(shè)定為對數(shù)底為10(log base 10)。SC按以下公式計(jì)算(Sprague，1971):

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對紅螯螯蝦的急性毒性效應(yīng)

如表2、表3所示，對照組無死亡現(xiàn)象，在氨氮急性脅迫下，隨著脅迫濃度增加和脅迫時(shí)間的延長，幼蝦和亞成蝦的死亡率均不斷上升，氨氮毒性效應(yīng)增強(qiáng)。幼蝦組中，總氨氮濃度為50.00和67.45 mg·L-1時(shí)，分別在48和24 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其他濃度組均在24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡；總氨氮濃度為165.58、223.36和301.30 mg·L-1時(shí)，分別在96、72和48 h內(nèi)全部死亡。亞成蝦組中，總氨氮濃度為100.00和134.90 mg·L-1時(shí)，分別在72和24 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其他濃度組均在24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡；總氨氮濃度為331.13、446.68 和 602.56 mg·L-1時(shí)，分別在 96、72和72 h內(nèi)全部死亡。

依據(jù)表2、表3的結(jié)果，計(jì)算氨氮的LC50和SC，結(jié)果如表4所示?？偘钡獙t螯螯蝦幼蝦和亞成蝦的24 h LC50分別為188.08和344.01 mg·L-1，SC分別為8.80和16.77 mg·L-1。非離子氨對紅螯螯蝦幼蝦和亞成蝦的24 h LC50分別為10.16和18.58 mg·L-1，SC分別為0.48和0.91 mg·L-1。

表2 氨氮對紅螯螯蝦幼蝦的急性毒性Table 2 Acute toxicity of ammonia-N on juvenile C.quadricarinatus

表3 氨氮對紅螯螯蝦亞成蝦的急性毒性Table 3 Acute toxicity of ammonia-N on subadult C.quadricarinatus

表4 氨氮對紅螯螯蝦的半致死濃度和安全濃度Table 4 The LC50s and SC of total ammonia-N and non-ionic ammonia to C.quadricarinatus

2.2 亞硝酸鹽對紅螯螯蝦的急性毒性效應(yīng)

如表5、表6所示，對照組無死亡現(xiàn)象，在亞硝酸鹽急性脅迫下，隨著脅迫濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長，幼蝦和亞成蝦的死亡率均不斷上升，亞硝酸鹽毒性效應(yīng)增強(qiáng)。幼蝦組中，亞硝酸氮濃度為10.00、13.49 和 18.20 mg·L-1時(shí)，分別在 72、48 和24 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其他濃度組均在24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡；亞硝酸氮濃度為44.67和60.26 mg·L-1時(shí)，分別在72和48 h內(nèi)全部死亡。亞成蝦組中，亞硝酸氮濃度為20.00和26.98 mg·L-1時(shí)，分別在48和24 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其他濃度組均在24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡；亞硝酸氮濃度為66.22、89.34和120.52 mg·L-1時(shí)，分別在96、72和48 h內(nèi)全部死亡。

依據(jù)表5、表6的結(jié)果，計(jì)算亞硝酸氮的LC50和SC，結(jié)果如表7所示。亞硝酸氮對紅螯螯蝦幼蝦和亞成蝦的24 h LC50分別為46.76和77.56 mg·L-1，SC分別為2.28和3.75 mg·L-1。

表5 亞硝酸氮對紅螯螯蝦幼蝦的急性毒性Table 5 Acute toxicity of nitrite-N on juvenile C.quadricarinatus

表6 亞硝酸氮對紅螯螯蝦亞成蝦的急性毒性Table 6 Acute toxicity of nitrite-N on subadult C.quadricarinatus

表7 亞硝酸氮對紅螯螯蝦的半致死濃度和安全濃度Table 7 The LC50s and SC of nitrite-N to C.quadricarinatus

3 討論

3.1 氨氮對蝦類的急性毒性

氨氮是水生動物含氮廢物的主要排泄形式，對于甲殼動物，因物種而異，其含氮廢物有40%～90%以氨氮的形式從鰓上皮組織排出。此外，微生物對殘餌和糞便中的含氮有機(jī)物進(jìn)行氨化作用所產(chǎn)生的氨氮，也是養(yǎng)殖水體中氨氮的主要來源(冼健安等，2014)。因此，在集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中，氨氮往往隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長而不斷積累，成為養(yǎng)殖環(huán)境中主要的脅迫因子之一。研究表明，氨氮具有較強(qiáng)的毒性，可對蝦類的生長、變態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、生理代謝、免疫力和抗病力等產(chǎn)生負(fù)面作用。

多種蝦類的氨氮LC50和SC已有報(bào)道，如凡納濱對蝦(孫國銘等，2002)、南方濱對蝦Litopenaeus schmitti Burkenroad(Barbieri，2010)、 斑 節(jié) 對 蝦Penaeus monodon Fabrieiu(胡賢德等，2009)、羅氏沼蝦 Macrobrachium rosenbergii De Man(王龍等，2011)、克氏原螯蝦(羅靜波等，2006；鐘軍偉等，2013)等。 本研究中，水溫 24～25℃、pH 7.9～8.0、溶解氧5.6～6.0 mg·L-1的條件下，氨氮對體長25～38 mm、體重0.83～1.88 g的紅螯螯蝦幼蝦的48 h LC50為136.15 mg·L-1，與陳孝煊等(1995)的研究結(jié)果相似。氨氮對體長25～38 mm和72～93 mm的紅螯螯蝦的24 h LC50分別為188.08和344.01 mg·L-1。雖然各研究所選用的蝦大小規(guī)格有一定的差異，但經(jīng)粗略比較，克氏原螯蝦的氨氮耐受力要強(qiáng)于紅螯螯蝦。就規(guī)格大小而言，紅螯螯蝦亞成蝦的氨氮耐受能力遠(yuǎn)高于幼蝦，與克氏原螯蝦相似(鐘君偉等，2013)，規(guī)格越大，氨氮耐受力越強(qiáng)。

對于海水蝦類品種，已測定出氨氮對凡納濱對蝦(孫國銘等，2002)、南方濱對蝦(Barbieri，2010)、斑節(jié)對蝦(胡賢德等，2009)、短溝對蝦(Kir et al.，2004)、脊尾白蝦(梁俊平等，2012)的 24 h LC50。水體鹽度是氨氮毒性的重要影響因素，較高的鹽度會降低非離子氨(NH3)的比例。另外，Na＋很容易置換鰓膜上的離子氨(NH4＋)，Ca2＋和其他二價(jià)陽離子也通過增強(qiáng)鰓膜滲透性或增加Na＋的富集來減少氨的毒性，即鹽度越高，蝦類的氨氮耐受性越強(qiáng)(冼健安等，2014)。上述蝦類均為海水品種，它們在較高鹽度水體中的LC50也明顯低于2種淡水螯蝦，表明螯蝦總科的蝦類可能相對其他科的蝦類具有更強(qiáng)的氨氮耐受力，這可能是螯蝦能夠在惡劣水質(zhì)環(huán)境中生存的重要原因之一。

氨氮由離子氨和非離子氨2種形式組成，由于非離子氨不帶電荷，容易透過細(xì)胞膜進(jìn)入蝦體內(nèi)，所以氨氮的毒性主要集中在非離子氨上，而非離子氨所占的比例又與水體溫度、pH及鹽度有關(guān)(冼健安等，2014)。因此，分析特定環(huán)境條件下的非離子氨毒性可能更具參考價(jià)值。針對本研究實(shí)驗(yàn)水體的環(huán)境條件，換算得到非離子氨對紅螯螯蝦幼蝦和亞成蝦的24 h LC50分別為10.16和18.58 mg·L-1，結(jié)果與克氏原螯蝦(鐘君偉等，2013)較接近，紅螯螯蝦的非離子氨耐受性也高于其他蝦類(梁俊平等，2012； 孫國銘等，2002； Barbieri，2010； Kir et al.，2004)。

3.2 亞硝酸鹽對蝦類的急性毒性

亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中另一種常見的含氮毒性污染物，主要由氨經(jīng)過亞硝化細(xì)菌的轉(zhuǎn)化而來。因此，在集約化養(yǎng)殖過程中，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長，氨氮逐漸積累，亞硝酸鹽的濃度也會越來越高。亞硝酸鹽對蝦類也產(chǎn)生各種毒性影響，如抑制生長和變態(tài)發(fā)育(彭自然等，2004；Mallasen＆ Valenti，2006)、破壞組織結(jié)構(gòu)(胡義波等，2005)、降低血淋巴載氧能力(Cheng＆Chen，1999)、擾亂氮的生理代謝(Lee＆Chen，2004)、抑制免疫力和抗病力(黃翔鵠等，2006；冼健安等，2016；Chand＆ Sahoo，2006； Xian et al.，2011)等。 因此，亞硝酸鹽也是養(yǎng)殖者重點(diǎn)監(jiān)測的指標(biāo)之一。

亞硝酸鹽對多種蝦類的LC50已有較多的報(bào)道，如克氏原螯蝦(羅靜波等，2005；於葉兵等，2011)、羅氏沼蝦(Chen＆Lee，1997)、日本沼蝦M.nipponense(Wang et al.，2004)和馬氏沼蝦 M.malcolmsonii(Chand＆Sahoo，2006)。本研究中，亞硝酸氮對紅螯螯蝦幼蝦和亞成蝦的24 h LC50分別為46.76和77.56 mg·L-1，略高于其他淡水蝦類。就規(guī)格大小而言，紅螯螯蝦亞成蝦的亞硝酸鹽耐受能力遠(yuǎn)高于幼蝦，規(guī)格越大，亞硝酸鹽耐受力越強(qiáng)。

對于海水蝦類品種，亞硝酸氮對凡納濱對蝦(Lin ＆ Chen，2003)、斑 節(jié) 對 蝦(Chen et al.，1990a)、中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis(Chen et al.，1990b)和長毛對蝦 P.penicillatus(Chen＆Lin，1991)的24 h LC50已測得。紅螯螯蝦的亞硝酸鹽耐受性明顯低于這些海水種類，這是由于鹽度對亞硝酸鹽的毒性影響很大，鹽度越高，蝦類的亞硝酸鹽耐受力越高。鹽度影響亞硝酸鹽毒性主要與Cl-的含量有關(guān)，Cl-可與NO2-競爭鰓上的吸收位點(diǎn)，鹽度越高，Cl-含量越高，被吸收進(jìn)入體內(nèi)的N就越少，毒性效應(yīng)越低(寇紅巖等，2014)。

綜上所述，紅螯螯蝦對氨氮的耐受力高于亞硝酸鹽，其規(guī)格越大，氨氮和亞硝酸鹽耐受力也越強(qiáng)。相對其他蝦類，紅螯螯蝦的氨氮耐受力較強(qiáng)，亞硝酸鹽耐受力強(qiáng)于其他淡水蝦類，而弱于海水蝦類。紅螯螯蝦幼蝦的氨氮和亞硝酸鹽的SC分別為8.80和2.28 mg·L-1，亞成蝦的氨氮和亞硝酸鹽的SC分別為16.77和3.75 mg·L-1，SC相對較高，實(shí)際養(yǎng)殖狀態(tài)下遠(yuǎn)低于SC，但在養(yǎng)殖過程中也應(yīng)盡量控制氨氮和亞硝酸鹽的含量，以防慢性脅迫帶來的不良影響。此外，2～3 cm的幼蝦是目前放塘的常用規(guī)格，幼蝦的耐受力相對較弱，在養(yǎng)殖前期應(yīng)注意加強(qiáng)水質(zhì)調(diào)控、穩(wěn)定水質(zhì)，以免環(huán)境因子的劇烈變化而導(dǎo)致的脅迫毒害作用。

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Acute toxicity of ammonia and nitrite on juvenile and subadult redclaw crayfish(Cherax quadricarinatus)

PAN Xunbin1， ZHANG Xiuxia2， LU Yaopeng1， ZHENG Peihua1， WANG Anli1， XIAN Jian′an2?

1College of Life Science， South China Normal University， Guangzhou， Guangdong 510631， China；2Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

【Aim】 In recent years，the aquaculture of redclaw crayfish has significantly increased.The aim of this study is to understand the ammonia-N and nitrite-N tolerance of different life stages of red claw crayfish to improve the survival rate and promote the redclaw crayfish production in aquaculture.【Method】 The acute toxicity of ammonia-N and nitrite-N on juvenile and subadult redclaw crayfish was tested，and the half lethal concentrations(LC50)and safe concentrations(SC)under 24～25℃ and pH 7.9～8.0 were determined.【Result】 The LC50s of total ammonia-N for juvenile crayfish at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 188.0， 136.15，104.67 and 88.00 mg·L-1， and the SC was 8.80 mg·L-1.The LC50s of total ammonia-N for subadult at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 344.01， 270.46， 205.15 and 167.68 mg·L-1， and the SC was 16.77 mg·L-1.The LC50s of non-ionic ammonia for juvenile at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 10.16， 7.35， 5.65 and 4.75 mg·L-1， and the SCwas 0.48 mg·L-1.The LC50s of nonionic ammonia for subadult at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 18.58， 14.60， 11.08 and 9.05 mg·L-1， and the SCwas 0.91 mg·L-1.The LC50s of nitrite-N for juvenile at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 46.76， 33.88， 27.97 and 22.81 mg·L-1， and the SC was 2.28 mg·L-1.The LC50s of nitrite-Nfor subadult at 24 h，48 h，72 h and 96 h were 77.56，59.33，45.41 and 37.48 mg·L-1，and the SC was 3.75 mg·L-1.【Conclusion】 The tolerance of redclaw crayfish to ammonia-N was stronger than nitrite-N， and the tolerance of subadult to ammonia-N and nitrite-N was stronger than that of juvenile.

Cherax quadricarinatus； ammonia； nitrite； acute toxicity

10.3969/j.issn.2095-1787.2017.04.011

2017-03-31 接受日期(Accepted):2017-05-17

海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(ZDYF2016084)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(1630052016011、1630052016021)

潘訓(xùn)彬，男，實(shí)驗(yàn)師。研究方向:水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學(xué)，水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料學(xué)。E-mail:defun＠126.com

?通信作者(Author for correspondence)，E-mail:xian-ja＠163.com

(責(zé)任編輯:郭瑩)