， ， ， 濟(jì)紅(貴州省生物研究所， 貴陽(yáng) 550009)

金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系建立

席培宇，王虹，劉燕，王濟(jì)紅
(貴州省生物研究所， 貴陽(yáng) 550009)

目的：研究金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系，為規(guī)?；a(chǎn)金鐵鎖提供技術(shù)支持。方法：通過(guò)組織培養(yǎng)，以金鐵鎖植株幼莖為外植體，建立芽增殖體系，成功誘導(dǎo)新芽分化產(chǎn)生不定根，建立了金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系。結(jié)論：成功建立金鐵鎖不定根離體培養(yǎng)體系，對(duì)進(jìn)一步規(guī)模化培養(yǎng)金鐵鎖不定根具有重要意義。

金鐵鎖； 組織培養(yǎng)； 不定根

金鐵鎖(Psammosilenetunicoides)是石竹科金鐵鎖屬植物，是我國(guó)中成藥保密品種“云南白藥”的重要成分之一[1-2]。據(jù)《中華本草》記載，金鐵鎖以根入藥，具有散瘀止痛、消癰排毒和祛風(fēng)濕的功效，可治風(fēng)濕痹痛，創(chuàng)傷出血，跌打損傷，筋骨疼痛和蛇咬傷等癥[3]?，F(xiàn)代研究證明，金鐵鎖主要化學(xué)成分為三萜類(lèi)皂苷[4]、環(huán)肽[5]以及內(nèi)酰胺等[6-8]，根部主要藥用成分總皂苷有鎮(zhèn)痛、抗炎、止血、免疫調(diào)節(jié)等多種藥效作用[9-11]。除云南白藥系列外，金鐵鎖還是多種知名中成藥的主要配藥，如百寶丹系列、貴州金骨蓮膠囊、云南紅藥膠囊等[12-13]。金鐵鎖作為我國(guó)西南地區(qū)的道地藥材和特有的單屬種植物，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道較少，目前對(duì)其研究主要集中在化學(xué)成分[14-16]、藥理作用[9-11]、生物學(xué)特性[17-18]等方面，繁育技術(shù)[19-24]和栽培技術(shù)[25-28]研究報(bào)道還相對(duì)較少。

當(dāng)前，采用“毛狀根”[29]、“不定根”[30]等生物技術(shù)定向培養(yǎng)植物細(xì)胞或器官來(lái)獲取次生代謝產(chǎn)物，是珍稀瀕危藥用植物資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用研究的熱點(diǎn)和有效途徑。如王穎芳等發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)南方紅豆杉產(chǎn)生的毛狀根中可產(chǎn)生紫杉醇，可作為紫杉醇的主要來(lái)源[31]；劉峻等研究人參毛狀根時(shí)發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷含量是原藥材的1.7倍[32]；步懷宇等研究發(fā)現(xiàn)，滇黃芩毛狀根中黃芩苷是原藥材的7.18倍[33]。金鐵鎖“毛狀根”培養(yǎng)也有少量報(bào)道[34-36]。李景濱等[36]利用發(fā)根農(nóng)桿菌成功誘導(dǎo)金鐵鎖產(chǎn)生毛狀根，并發(fā)現(xiàn)金鐵鎖毛狀根生物量增加了14.11倍，總皂苷是原植物的4倍。雖然通過(guò)毛狀根培養(yǎng)技術(shù)能明顯提高金鐵鎖總皂苷含量，但目前的研究還處于初級(jí)階段，且存在轉(zhuǎn)基因不明成分的風(fēng)險(xiǎn)。金鐵鎖不定根培養(yǎng)技術(shù)與毛狀根不同，不定根不僅有生長(zhǎng)速率快、遺傳穩(wěn)定、激素自養(yǎng)等特點(diǎn)，最重要的是它不需要發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)，直接通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基激素種類(lèi)或配比，通過(guò)組織培養(yǎng)就能誘導(dǎo)產(chǎn)生，不存在轉(zhuǎn)基因問(wèn)題。因此本研究擬建立的金鐵鎖“不定根培養(yǎng)”技術(shù)體系，可作為當(dāng)前解決金鐵鎖資源緊缺，市場(chǎng)需求旺盛供需矛盾突出的有效途徑之一。

1 材料與方法

1.1 材 料

金鐵鎖植株盆栽于貴州省生物研究所試驗(yàn)大棚，取其幼嫩莖段作為試驗(yàn)材料。

1.2 方 法

將試驗(yàn)材料經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后用高錳酸鉀溶液浸泡30 min左右，然后用自來(lái)水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用升汞處理8～10 min，無(wú)菌水沖洗3～5遍，用無(wú)菌濾紙吸去表面水分后，切成1 cm左右莖段。

選用1/2 MS培養(yǎng)基附加30 g/L蔗糖，12 g/L瓊脂，1 g/L活性炭，1 g/L PVP為基本培養(yǎng)基，通過(guò)添加不同比例的激素組合，在24 ℃和12 h/d光照周期下進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、芽增殖培養(yǎng)及其不定根誘導(dǎo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將處理后的金鐵鎖莖段分別接種到2,4-D、NAA和KT不同激素組合的培養(yǎng)基上，3 d后可見(jiàn)金鐵鎖莖基部開(kāi)始膨脹，6 d后莖段腋芽處開(kāi)始萌動(dòng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，腋芽逐漸伸長(zhǎng)并長(zhǎng)出新莖葉。14 d后統(tǒng)計(jì)新生芽誘導(dǎo)率，結(jié)果(見(jiàn)表1)表明，金鐵鎖莖段在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均可以生長(zhǎng)并長(zhǎng)出新莖葉，但不同激素組合對(duì)外植體的芽誘導(dǎo)能力不同。在2,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.3 mg/L中，苗生長(zhǎng)狀態(tài)及莖間高度最理想，獲得的誘導(dǎo)苗最適合繼代增殖。

表1 不同植物激素組合對(duì)金鐵鎖芽誘導(dǎo)的影響

激素組合編號(hào)激素濃度(mg/L)2，4?DNAAKT外植體個(gè)數(shù)(個(gè))新生芽數(shù)量莖節(jié)間長(zhǎng)度新生芽生長(zhǎng)情況A10．20．10．340多適中莖節(jié)粗且間距適中，分枝少，長(zhǎng)勢(shì)好。A20．20．10．540較多短莖節(jié)粗且間距短，分枝多，長(zhǎng)勢(shì)好。A30．20．11．040少長(zhǎng)莖節(jié)細(xì)長(zhǎng)，新生芽分枝少，長(zhǎng)勢(shì)一般。

表2 不同植物激素組合對(duì)無(wú)菌苗繼代增殖的影響

激素濃度(mg/L)2，4?DNAAKT外植體個(gè)數(shù)(個(gè))新生芽個(gè)數(shù)(個(gè))增殖系數(shù)生長(zhǎng)狀況0．50．10．340521．300．50．10．540691．730．50．11．040561．400．50．50．340751．880．50．50．540972．430．50．51．040681．70叢生芽分枝較多，長(zhǎng)勢(shì)好；隨說(shuō)KT濃度增加，新芽葉片逐漸變淺至出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象并分泌出紅色代謝物；叢生芽分枝多，長(zhǎng)勢(shì)好；隨說(shuō)KT濃度增加，新芽葉片逐漸變淺并出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；

2.2 芽增殖培養(yǎng)基的篩選

在新生芽成功誘導(dǎo)后，從莖節(jié)基部長(zhǎng)出叢生芽并漸漸伸長(zhǎng)。待苗長(zhǎng)至1～3 cm時(shí)，就可以進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)中激素為2,4-D與NAA和KT的不同組合，培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)側(cè)芽增殖系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。在金鐵鎖組培苗增殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著KT濃度增大，芽增殖系數(shù)不斷升高，但KT濃度不宜過(guò)高，濃度過(guò)高反而出現(xiàn)增殖的抑制及組培苗玻璃化現(xiàn)象，有些組培苗甚至還分泌出紅色的代謝物。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨著2,4-D濃度增加，繼代苗愈傷組織形成率越高，不適合后期誘導(dǎo)不定根試驗(yàn)。

由此可見(jiàn)，1/2 MS+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L培養(yǎng)基最利于金鐵鎖組培苗的繼代增殖，生長(zhǎng)高度適中，有較好的增殖系數(shù)(2.43倍)，愈傷組織形成率低，組培苗的葉色濃綠，莖粗，非常適宜誘導(dǎo)不定根培養(yǎng)。

注：a為啟動(dòng)培養(yǎng)基上的接種；b為A 1激素組合誘導(dǎo)苗；c為A 2激素組合誘導(dǎo)苗；d為A 3激素組合誘導(dǎo)苗。圖1 不同激素組合對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

以第2代繼代莖段較粗的無(wú)菌苗為試驗(yàn)材料，取其幼嫩莖段切成1 cm左右作為外植體，分別考察不同濃度的IBA和NAA對(duì)不定根誘導(dǎo)的影響。NAA和IBA分別設(shè)0.05，0.1，0.3，0.5 mg/L 4個(gè)濃度，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。結(jié)果表明，IBA對(duì)誘導(dǎo)不定根的分化和生長(zhǎng)起著關(guān)鍵作用。當(dāng)IBA濃度為0.1 mg/L時(shí)，不定芽14 d后就形成不定根并快速生長(zhǎng)，而在平衡濃度NAA的培養(yǎng)基上，叢生苗分支較多，但生長(zhǎng)緩慢、不定根誘導(dǎo)率過(guò)低、主根分枝少，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，不適合不定根的誘導(dǎo)；當(dāng)IBA濃度提高至0.3 mg/L時(shí)，也有根的生成，但生根較晚，且無(wú)明顯主根生成，生根率較低；當(dāng)IBA濃度升高至0.5 mg/L時(shí)，沒(méi)有不定根生產(chǎn)，但也會(huì)產(chǎn)生愈傷組織，說(shuō)明高濃度IBA有利于愈傷組織的形成(圖3)。綜上所述，金鐵鎖組培苗不定根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.1 mg/L。

注：a，b為KT濃度較低時(shí)促進(jìn)苗的增殖；c，d為KT濃度較高時(shí)抑制苗的生長(zhǎng)，出現(xiàn)玻璃化甚至分泌紅色代謝物。圖2 不同KT濃度配比對(duì)無(wú)菌苗增殖的影響

注：a為NAA 0.05 mg/L誘導(dǎo)苗；b為NAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)苗；c為NAA 0.3 mg/L誘導(dǎo)苗；d為NAA 0.5 mg/L誘導(dǎo)苗。圖3 不同濃度NAA對(duì)莖段誘導(dǎo)不定根的影響

注：a為IBA 0.05 mg/L誘導(dǎo)苗；b為IBA 0.1 mg/L誘導(dǎo)苗；c為IBA 0.3 mg/L誘導(dǎo)苗；d為IBA 0.5 mg/L誘導(dǎo)苗。圖4 不同濃度IBA對(duì)莖段誘導(dǎo)不定根的影響

表3 不同濃度NAA對(duì)無(wú)菌苗誘導(dǎo)不定根的影響

NAA濃度(mg/L)接種不定芽數(shù)(個(gè))產(chǎn)生不定根的不定芽數(shù)(個(gè))不定根的生根率(%)根生長(zhǎng)狀況0．05401230不定根誘導(dǎo)率低，主根分枝少，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)。0．1402153不定根誘導(dǎo)率不高，主根分枝少，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)。0．34025不定根誘導(dǎo)率太低，主根分枝少，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)。0．54000沒(méi)有不定根產(chǎn)生，但有愈傷組織形成。

表4 不同濃度IBA對(duì)無(wú)菌苗誘導(dǎo)不定根的影響

IBA濃度(mg/L)接種不定芽數(shù)(個(gè))產(chǎn)生不定根的不定芽數(shù)(個(gè))不定根的生根率(%)根生長(zhǎng)狀況0．05403178不定根誘導(dǎo)率較高，長(zhǎng)勢(shì)好。0．1403895不定根誘導(dǎo)率高，生長(zhǎng)較快。0．3401640不定根誘導(dǎo)率高，但根較細(xì)，長(zhǎng)勢(shì)一般。0．54038沒(méi)有不定根產(chǎn)生，但有愈傷組織形成。

3 結(jié)論與討論

當(dāng)前金鐵鎖資源利用多以野生資源為主，人工栽培利用多采用種子繁殖[37-39]。貴州省威寧、畢節(jié)等高寒貧困山區(qū)是金鐵鎖野生資源集中分布區(qū)之一，由于長(zhǎng)期掠奪性采挖，野生資源瀕于絕滅，現(xiàn)有實(shí)生苗人工栽培繁殖周期要3年以上才能利用，還存在莖、葉生長(zhǎng)過(guò)剩，根部生長(zhǎng)緩慢和藥用成分含量低等問(wèn)題。本研究通過(guò)組織培養(yǎng)手段，建立了簡(jiǎn)便、安全、高效的金鐵鎖不定根培養(yǎng)技術(shù)體系。金鐵鎖外植體啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+2,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.3 mg/L，腋芽出芽率高，不定芽長(zhǎng)勢(shì)好；調(diào)整生長(zhǎng)素2,4-D和KT的濃度比，得出添加2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L的1/2 MS培養(yǎng)基有利于組培苗的繼代增殖，芽苗長(zhǎng)勢(shì)好，健壯質(zhì)量高；取生長(zhǎng)健壯的繼代組培苗移至1/2 MS+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根，生根率高達(dá)95%，長(zhǎng)勢(shì)良好。柴素真[30]等通過(guò)金鐵鎖莖段誘導(dǎo)出愈傷組織，再以愈傷組織為外植體誘導(dǎo)不定根，最后檢測(cè)出不定根中總皂苷重量的百分含量大約是金鐵鎖原藥材的2倍。本試驗(yàn)只選用了少量激素簡(jiǎn)單配比且取得了較好的試驗(yàn)效果，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基成分，相較于柴素真等研究結(jié)果，簡(jiǎn)化中間誘導(dǎo)愈傷組織的步驟，過(guò)程更簡(jiǎn)單，操作更簡(jiǎn)便，效率更高，這為不定根由搖瓶放大到生物反應(yīng)器的培養(yǎng)提供了技術(shù)參數(shù)，為將來(lái)通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)金鐵鎖不定根替代原料植物夯實(shí)了基礎(chǔ)，為金鐵鎖特色植物資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用建立了新的途徑。

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(本欄目責(zé)任編輯：周忠燕)

The Adventitious Roots Develop System ofPsammosilenetunicoides

XIPeiyu,WANGHong,LIUYan,WANGJihong

2016-09-30

席培宇(1987—)，女，碩士，助理研究員；主要從事貴州特色植物資源引種栽培及繁殖技術(shù)研究；E-mail：759076048@qq.com。

王濟(jì)紅(1969—)，女，研究員；E-mail：1821877303@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.131

S 567

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1001-4705(2017)02-0131-04