周晨辰 陸 琤 張鵬飛 張 硌*

穩(wěn)定敲低PLEKHQ1基因細胞株的建立*

周晨辰①陸 琤①張鵬飛①張 硌①*

目的：建立穩(wěn)定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1細胞株。方法：在293TX細胞中進行病毒的包裝，用獲得的高滴度慢病毒感染RAW和THP-1細胞，通過免疫印跡和熒光顯微鏡，檢測病毒感染后RAW和THP-1細胞PLEKHQ1蛋白表達的變化。結(jié)果：PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染后表現(xiàn)出明顯的干擾作用，感染后能明顯下調(diào)RAW和THP-1細胞的PLEKHQ1蛋白表達。結(jié)論：穩(wěn)定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1細胞株的建立，可為進一步研究PLEKHQ1在相關(guān)疾病中的功能奠定基礎(chǔ)。

PLEKHQ1基因；RAW細胞株；慢病毒感染

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，由單核細胞或其他前體細胞分化而來，因此通常將單核細胞和巨噬細胞統(tǒng)稱為單核巨噬系統(tǒng)(mononuclear phagocyte system，MPS)[1-2]。作為機體“第一道防線”的巨噬細胞，是一類多重功能的免疫細胞，其既是先天免疫的主要“執(zhí)行者”，又參與啟動適應性免疫反應。隨著研究的深入，巨噬細胞在免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復、組織重塑、血管發(fā)生、腫瘤侵襲和體溫調(diào)控等過程中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)[3-6]。巨噬細胞相關(guān)的研究引起了學術(shù)界的極大關(guān)注。

PLEKHQ1(pleckstrin homology domain containing， family Q member 1)是一種包含490個氨基酸的蛋白質(zhì)[7-8]。目前為止，尚無文獻專門對其功能進行報道。因此，本研究為進一步研究PLEKHQ1的特性，選用巨噬細胞RAW和單核細胞THP-1細胞作為目標細胞株，利用慢病毒感染體系，體外包裝病毒后對細胞進行病毒感染，并結(jié)合嘌呤霉素篩選以及流式細胞儀篩選的方法建立穩(wěn)定敲低PLEKHQ1的RAW和THP-1細胞株，為進一步研究PLEKHQ1在相關(guān)疾病中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1)Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；離心過濾器購自德國Millipore公司；Tanon 5200全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

(2)包裝質(zhì)粒PMD、SPA、表達載體PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1、control shRNA質(zhì)粒、293TX細胞和RAW和THP-1細胞為本室保存。嘌呤霉素(puromycin)，PLEKHQ1抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化酶標記二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司；ECL顯影試劑購于美國Thermo公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；血清購自美國Hyclone公司。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印NC膜購自美國Pall公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

采用293TX、RAW和THP-1細胞：將細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于37 ℃的5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 慢病毒感染

1.3.1 病毒包裝

293TX包裝細胞培養(yǎng)在含雙抗和10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI1640培養(yǎng)基中，于細胞對數(shù)生長期時接種，接種后用不加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗中的干涉序列為PLEKHQ1-lentiviral shRNA#1(5-ACAAGGTCAGTGACATCAA-3)，control shRNA (5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3)。接種于60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿，總質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為9 μg，分別為包裝質(zhì)粒PMD 1.5 μg，SPA 3 μg，表達載體PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1 4.5 μg。轉(zhuǎn)染后8 h或過夜更換無抗生素培養(yǎng)基，然后36～48 h再補充5 ml無抗生素培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后72 h收上清，0.22 μm濾器過濾。為提高病毒滴度，可用規(guī)格為10 K的離心過濾器以4000 r/min離心20 min濃縮含病毒的上清。濃縮后置于-4 ℃保存，隔天或立刻使用[9]。

1.3.2 RAW細胞的感染及篩選

待感染的RAW和THP-1細胞對數(shù)生長期時接種至6孔板中，接種細胞時感染，將濃縮后的病毒全部加入培養(yǎng)皿中。RAW細胞極易存活，因此感染細胞的細胞數(shù)量為單個或數(shù)個細胞為宜，而感染THP-1細胞的密度為5 d后長滿為宜。4～5 d可看見部分細胞發(fā)綠色熒光。此時RAW細胞使用嘌呤霉素5 μg/ml處理24 h，然后換為新鮮的完全培養(yǎng)基以促進細胞生長。THP-1細胞為懸浮細胞，無法通過嘌呤霉素篩選，因此采用流式細胞儀篩選分離獲得。

1.4 免疫印跡檢測

細胞用放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液[50 mmol/L Tris(pH值 7.4)，150 mmol/L的NaCl溶液，1% NP-40，0.1%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)]，加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑裂解，SDS-PAGE電泳分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至NC膜。脫脂牛奶封閉液封閉1 h。加入一抗，室溫溫育2 h或4 ℃溫育過夜。用三羥甲基氨基甲烷鹽吐溫(tris buffered saline tween，TBST)緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入相應的二抗，室溫溫育1 h。再用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。將增強化學發(fā)光(enhanced chemi luminescence，ECL)顯色液加到膜上，用保鮮膜將膜包起來后放入Tanon 5200化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)中曝光、顯影，并保存數(shù)據(jù)。

1.5 顯微鏡觀察

感染的RAW和THP-1細胞長到4～5 d后，取出在倒置熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。且在激發(fā)光(450～490 nm藍光波長)照射下，觀察RAW和THP-1細胞感染情況，判定其感染率。

2 實驗結(jié)果

2.1 PLEKHQ1基因蛋白表達水平的檢測

RAW和THP-1細胞分別感染對照病毒和PLEKHQ1干擾病毒，經(jīng)嘌呤霉素篩選，培養(yǎng)傳代后收細胞進行Western印跡檢測。與shRNA感染的細胞相比，PLEKHQ1干擾病毒感染的RAW和THP-1細胞其PLEKHQ1的蛋白表達水平明顯降低，在PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1感染后的RAW和THP-1細胞中PLEKHQ1幾乎不表達，表明穩(wěn)定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1細胞株已經(jīng)建立成功(如圖1所示)。

圖1 免疫印跡檢測RAW和THP-1細胞株中PLEKHQ1表達示圖

圖中shRNA為control shRNA感染的細胞；sh1為PLEKHQ1-lentiviral shRNA#1感染的細胞。

2.2 PLEKHQ1敲低后對COS-7細胞形態(tài)的影響

構(gòu)建的慢病毒表達載體導入細胞后能夠表達具有綠色熒光蛋白特征的融合蛋白，在激發(fā)光照射下產(chǎn)生穩(wěn)定的綠色熒光[10]。用其感染RAW和THP-1細胞4～5 d后則可見綠色熒光蛋白的表達，細胞外觀形態(tài)顯示，病毒感染前后RAW和THP-1細胞株形態(tài)無明顯改變，因此PLEKHQ1的敲低對RAW和THP-1細胞株形態(tài)無顯著影響(如圖2所示)。

圖2 熒光顯微鏡觀察PLEKHQ1敲低后對RAW和THP-1細胞形態(tài)的影響示圖

圖中control為control shRNA感染的細胞；sh1為PLEKHQ1-lentiviral shRNA#1感染的細胞。

3 結(jié)論

PLEKHQ1又被稱為PLEKHO2(pleckstrin homology domain containing， family O member 2)，結(jié)構(gòu)上其N端含有一個PH結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin Homolgy Domain)，PH結(jié)構(gòu)域負責形成蛋白-蛋白和蛋白-脂質(zhì)之間的相互作用，并包含一個氯離子通道結(jié)構(gòu)域[11-13]。在人體內(nèi)，編碼PLEKHQ的基因位于15號染色體上[13-15]。到目前為止，尚無任何文獻專門對其功能進行報道。本研究前期進行的生物信息學分析顯示，PLEKHQ1可能參與細胞因子與受體的相互作用，其PH結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合磷脂。表達譜數(shù)據(jù)顯示其在巨噬細胞中特異性高表達，表示PLEKHQ1可能在巨噬細胞功能調(diào)控中發(fā)揮作用。因此，建立穩(wěn)定敲低PLEKHQ1的巨噬細胞和單核細胞細胞株對后續(xù)PLEKHQ1生物學功能的基礎(chǔ)研究具有重要意義。

本研究以RAW和THP-1細胞株為研究對象，通過慢病毒介導的方法，獲得了穩(wěn)定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1細胞株。結(jié)果顯示，RAW和THP-1細胞株中PLEKHQ1的表達能力得到了有效抑制。

[1]Wynn TA，Chawla A，Pollard JW.Macrophage biology in development，homeostasis and disease[J].Nature，2013，496(7446)：445-455.

[2]Shi C，Pamer EG.Monocyte recruitment during infection and inflammation[J].Nat Rev Immunol，2011，11(11)：762-774.

[3]Murray PJ，Wynn TA.Protective and pathogenic functions of macrophage subsets[J].Nat Rev Immunol，2011，11(11)：723-737.

[4]Chawla A，Nguyen KD，Goh YP.Macrophagemediated inflammation in metabolic disease[J].Nat Rev Immunol，2011，11(11)：738-749.

[5]Mosser DM，Edwards JP.Exploring the full spectrum of macrophage activation[J].Nat Rev Immunol，2008，8(12)：958-969.

[6]Moore KJ，Tabas I.Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Cell，2011，145(3)：341-355.

[7]Strausberg RL，F(xiàn)eingold EA，Grouse LH，et al.Generation and initial analysis of more than 15，000 full-length human and mouse cDNA sequences[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(26)：16899-16903.

[8]Ota T，Suzuki Y，Nishikawa T，et al.Complete sequencing and characterization of 21，243 fulllength human cDNAs[J].Nat Genet，2004，36(1)：40-45.

[9]周晨辰，陸琤，張鵬飛，等.穩(wěn)定敲低MYH10基因細胞株的建立[J].醫(yī)學研究雜志，2015，44(11)：51-53.

[10]鞏偉麗，徐廣，韓秋影.等.慢病毒感染方法構(gòu)建穩(wěn)定干涉pdrg1的hela細胞系[J].科學技術(shù)與工程，2013，13(22)：6385-6388.

[11]Antoshechkin A，Olalde J，Magarici M，et al.Analysis of effects of the herbal preparation Circulat on gene expression levels in cultured human fibroblasts[J].Phytother Res，2007，21(8)：777-789.

[12]Choudhary C，Kumar C，Gnad F，et al.Lysine acetylation targets protein complexes and coregulates major cellular functions[J].Science，2009，325(5942)：834-840.

[13]Oláh J，Vincze O，Virók D，et al.Interactions of pathological hallmark proteins：tubulin polymerization promoting protein/p25，betaamyloid，and alpha-synuclein[J].J Biol Chem，2011，286(39)：34088-34100.

[14]Povlsen LK，Beli P，Wagner SA，et al.Systemswide analysis of ubiquitylation dynamics reveals a key role for PAF15 ubiquitylation in DNA-damage bypass[J].Nat Cell Biol，2012，14(10)：1089-1098.

[15]Wagner SA，Beli P，Weinert BT，et al.A proteome-wide，quantitative survey of in vivo ubiquitylation sites reveals widespread regulatory roles[J].Mol Cell Proteomics，2011，10(10)：M111，013284.

Establishment of stable RAW and THP-1 cell strain with PLEKHQ1-knock-down

ZHOU Chenchen, LU Cheng, ZHANG Peng-fei, et al

Objective:To establish RAW and THP-1cell strain which PLEKHQ1 gene was stably knocked down.Methods:The lentiviral plasmids was transfected into 293TX cells to achieve package. And then the packaged lentivirus of high titer were used to infect RAW and THP-1 cell. Western blot and Fluorescence microscope were applied to detect and analyze the change of expression of PLEKHQ1protein after RAW and THP-1 cell was infected by lentivirus.Results:PLEKHQ1-lentiviral shRNA1 showed significant interference effect after it was transfected, and can obviously reduced expression of PLEKHQ1 in RAW and THP-1cells.Conclusion:The establishment of RAW and THP-1 cell strain with PLEKHQ1 knock-down can lay a foundation for further researching the function of PLEKHQ1 in relevant disease.

PLEKHQ1 gene; RAW cell strain; Lentivirus transfection

Department of Medical Engineering, The 307thHospital of PLA, Beijing 100071, China.

1672-8270(2017)11-0140-03

R-33

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.11.041

周晨辰,女,(1988- ),碩士，助理工程師。解放軍第307醫(yī)院醫(yī)學工程科，從事基因功能研究工作。

國家自然科學基金(31400739)“PH結(jié)構(gòu)域蛋白PLEKHQ1協(xié)調(diào)巨噬細胞遷移與激活的機制研究”；軍事醫(yī)學創(chuàng)新基金(2015CXJJ29)“PLEKHQ1調(diào)控細菌性膿毒敗血癥的功能和機制研究”

①解放軍第307醫(yī)院醫(yī)學工程科 北京 100071

*通訊作者：marbleluo@126.com

China Medical Equipment,2017,14(11):140-142.

2017-06-07