田璨熙，宋金秋，向曉寒，崔麗紅

(湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系， 湖南 吉首 416000)

獼猴桃潰瘍病病菌新篩選方法與菌種鑒定

田璨熙，宋金秋，向曉寒，崔麗紅*

(湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系， 湖南 吉首 416000)

【目的】研究高效篩選獼猴桃潰瘍病致病菌的新方法對湘西地區(qū)感染潰瘍病的獼猴桃植株進行快速病菌分離與鑒定?！痉椒ā恳砸荒晟J猴桃枝條對不同糖濃度和氮濃度基質(zhì)耐受情況為依據(jù)和柯赫氏法則來驗證高效篩選病原菌方案的可行性與提取經(jīng)篩選得到獼猴桃潰瘍病病菌的DNA并擴增16SrDNA進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。【結(jié)果】本實驗得到一高碳氮比(C∶N=10∶1)的篩選培養(yǎng)基，其對獼猴桃潰瘍病致病菌篩選效率優(yōu)于目前已報道的篩選基質(zhì)；經(jīng)篩選獲得潰瘍病致病菌為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種，與目前已報道的丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種親緣關(guān)系較遠，有區(qū)別于以往的文獻報道?！窘Y(jié)論】以高碳氮比(C/N)的菌種選擇壓力用于丁香假單胞桿菌獼猴桃致病菌的篩選是高效的。丁香假單胞桿菌獼猴桃致病菌可能出現(xiàn)新的變異。

獼猴桃潰瘍?。欢∠慵賳伟麠U菌；篩選；獼猴桃，植物病害

【研究意義】湖南湘西地區(qū)的獼猴桃種植面積達50 hm2，占總耕地面積比例較高，紅陽獼猴桃為湘西州地區(qū)主要經(jīng)濟樹種，獼猴桃種植及次級產(chǎn)業(yè)為該地區(qū)地方經(jīng)濟的發(fā)展，農(nóng)民脫貧致富提供了主要的產(chǎn)業(yè)支撐。【前人研究進展】獼猴桃潰瘍病自20世紀(jì)80年代以來已成為該地區(qū)乃至全國獼猴桃種植的高發(fā)病[1-5]，但有效防治獼猴桃潰瘍病的技術(shù)應(yīng)用目前仍屬于世界性難題，因此解決獼猴桃潰瘍病的防治問題已經(jīng)成為該區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展直接面臨的風(fēng)險和挑戰(zhàn)[6-10]。【本研究切入點】本論文基于上述現(xiàn)狀，以研究獼猴桃潰瘍病病菌自身特性作為研究起點，首先針對湘西地區(qū)獼猴桃潰瘍病病原菌篩選分離方法進行改進。通過對病菌高效篩選方法的研究，為后期的防治技術(shù)研究提供新的思路?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 本論文旨在研究獼猴桃潰瘍病病原菌高效篩選分離方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 基質(zhì)對獼猴桃枝條生長的影響及分離基質(zhì)配方設(shè)計

依據(jù)獼猴桃枝條離體培養(yǎng)條件來設(shè)計篩選培養(yǎng)及條件：用不同濃度的蔗糖溶液離體培養(yǎng)獼猴桃植株枝條，濃度分別設(shè)置為1 %，2 %，3 %，4 %，5 %，6 %;連續(xù)培養(yǎng)15 d后，記錄枝條上出芽情況；用不同濃度的NH4NO3生理鹽水溶液離體培養(yǎng)獼猴桃植株枝條，濃度分別設(shè)置為0.1 %，0.2 %，0.3 %，0.4 %，0.5 %，0.6 %，0.7 %，連續(xù)培養(yǎng)15 d后，記錄枝條上出芽情況。依據(jù)培養(yǎng)結(jié)果來確定分離培養(yǎng)基的基質(zhì)組成，并將該分離培養(yǎng)基與目前報道的獼猴桃潰瘍病細菌分離培養(yǎng)基[10-11]作比較。

1.2 病原微生物的分離

收集2-4月份不同獼猴桃潰瘍病高發(fā)地區(qū)的紅陽獼猴桃潰瘍病枝干部病樣共15份，再將采集樣品分別經(jīng)無菌水表面沖洗，20 s,75 %乙醇溶液浸泡，無菌水沖洗3次后，用無菌刀片收集枝干上的病變組織，切碎放入100 mL無菌水中，加入無菌玻璃球，24 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。取0.1 mL稀釋菌液涂布于1號固體培養(yǎng)基，24 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h后觀察生長情況，挑取在該培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下生長較好的菌落進行轉(zhuǎn)接純化。將純化后的菌體接種于未染病的獼猴桃枝干培養(yǎng)7 d，選取新染病的枝干再進行細菌分離純化，與其原始細菌16SrDNA序列作對比，進行柯赫氏法則(Koch's Rule)驗證。

1.3 病原菌16SrDNA序列測定及分析

(1)基因組DNA提取。在菌液離心取出置于研缽，液氮研磨，并將研磨好的菌漿轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，標(biāo)記菌名稱，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，用槍頭吸打均勻，使菌體充分懸浮。加入250 μl 10 % SDS，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻。 加入3 μl 蛋白酶K(20 ng/μl)，輕輕混勻，37 ℃水浴1 h。加入150 μl 5 mol/L NaCl，輕輕混勻。 加入150 μl 2 % CTAB，輕輕混勻，65 ℃水浴20 min。12 000 r/min常溫離心20 min。小心吸取上清至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置30 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min。吸掉上清，在吸水紙上空干液體，加750 μl 70 %乙醇，輕彈管壁，使沉淀懸浮并反復(fù)顛倒幾次，12 000 r/min，4 ℃離心2 min。每管加入30 μl純化水溶解沉淀(水中加Rnase，終濃度10 ng/μl)，用手輕彈管壁，4 ℃溶解過夜。

圖1 不同蔗糖濃度培養(yǎng)條件下的出芽數(shù)Fig.1 The number of cultivate budding in different concentration of sucrose

(2)PCR擴增 16s引物序列。27F: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

反應(yīng)體系： H2O 17.8 μl ，Buffer 3 μl，d NTP 2 μl，Primer1 3 μl，Primer2 3 μl，DNA模板 1 μl，酶 0.2 μl，總體積 30 μl。

1.4 序列測定與數(shù)據(jù)分析

PCR 產(chǎn)物直接進行序列測定后用國際基因數(shù)據(jù)庫的比較分析: 將獲得的DNA 序列輸入Genbank，以blast程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有序列進行比較分析。將測序結(jié)果通過Blast比對，作同源性相似度差異性分析，利用ClustalX1.83軟件對序列進行多重比較，采用MEGA7.0軟件以N-J法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，分析其親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃枝條離體保存培養(yǎng)效果及分離培養(yǎng)基的選擇

如圖1～2所示，獼猴桃枝出芽率不會隨糖濃度的升高而明顯增大，獼猴桃對糖濃度的適應(yīng)性較好，但獼猴桃枝條的發(fā)芽率受銨鹽濃度的影響較大。獼猴桃潰瘍的發(fā)病期大多為初春季，基本符合高碳源的生長環(huán)境，可以利用基質(zhì)碳氮比(C/N)為主要篩選條件來設(shè)計分離培養(yǎng)基。經(jīng)過初步設(shè)計，選擇以遲效碳源和速效氮源，并使碳氮比達10∶1的高碳氮比(C/N)基質(zhì)(1號培養(yǎng)基)作為分離條件來對獼猴桃潰瘍病病菌進行篩選。表1表明，1號培養(yǎng)基對獼猴桃潰瘍病病菌的分離效果優(yōu)于目前已報道的其它篩選培養(yǎng)基,。

2.2 對不同來源地的紅陽潰瘍病病菌比較結(jié)果

通過對不同來源地的紅陽潰瘍病病菌按1.2方法進行分離純化之后，共有2株菌種通過柯赫氏法則的驗證且致病力相相同。如圖3所示，兩菌株經(jīng)16SrDNA序列測序分析發(fā)現(xiàn)其DNA片段大小一致，均為1401 bp。用blast程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有相似序列進行比較分析，該菌株同丁香假單胞桿菌獼猴桃致病菌(編號AB001439.1)16SrDNA相似率達99 %。因此，結(jié)合取樣寄主和致病性檢測結(jié)果，可以確定本試驗分離所得菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidae)。

圖2 不同NH4NO3濃度培養(yǎng)條件下的出芽數(shù)Fig.2 The number of cultivate budding in different concentration of NH4NO3

培養(yǎng)基總菌落數(shù)均值(CFU/mL)獼猴桃潰瘍病菌落總數(shù)均值(CFU/mL)有效菌落數(shù)平均比例(%)1號培養(yǎng)基8×1071×10712.5假單胞菌CFC選擇培養(yǎng)基4×109未發(fā)現(xiàn)未知NA培養(yǎng)基5×1091×1082KB培養(yǎng)基5×1092×1084

2.3 病菌的鑒定與分類

如圖3所示，將分離物與丁香假單孢桿菌獼猴桃致病變種相近的物種進行聚類，16SrDNA聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離得到的菌種TC-8與FJ755789.1菌株的親緣關(guān)系最近。而與已報道的丁香假單孢桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae)GQ914994.1、AJ889840.1、JN629035.1、EU906856.1及AB001439.1菌株親緣關(guān)系較遠。

3 討 論

3.1 獼猴桃潰瘍病病菌的篩選方法分析

試驗采用病理樣品多為表面出現(xiàn)褐化膿液的感染后期枝條，雜菌數(shù)量較多，一般培養(yǎng)基很難對獼猴桃潰瘍病菌進行高效分離,用本試驗設(shè)計的1號培養(yǎng)基分離目的菌落較為方便。另外，在本試驗篩選條件下由于菌落總數(shù)較小，不排除病原菌的篩選不完全的情況。

圖3 16SrDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.3 Electrophoesis of PCR reactions of l6SrDNA in agarose gel

目前綜合所有已報道獼猴桃潰瘍病病菌研究結(jié)果可以推論[11-25]：目前獼猴桃潰瘍病病菌已存在多菌種致病的情況。

3.2 獼猴桃潰瘍病病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

經(jīng)本試驗篩選條件得到的丁香假單胞桿菌獼猴桃致病菌與目前已報道的獼猴桃潰瘍病病菌雖同為丁香假單胞桿菌，但菌種在N-J發(fā)育樹上位于不同分支，可能是由于此丁香假單胞桿菌的傳播較快，傳播媒介較多，此過程導(dǎo)致丁香假單胞桿菌獼猴桃潰瘍病致病菌菌株間出現(xiàn)更多變異，出現(xiàn)進化的跡象，此進化現(xiàn)象的出現(xiàn)應(yīng)是目前各種防治研究工作制約因素之一。

圖4 基于16SrDNA序列的進化樹(MEGA 7.0)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequences

4 結(jié) 論

本試驗采用的篩選培養(yǎng)基為高碳氮比(C/N)的選擇性培養(yǎng)基對丁香假單胞桿菌獼猴桃致病菌的篩選效率顯著優(yōu)于目前已報道的相對較低碳氮比(C/N)的篩選培養(yǎng)基(如KB培養(yǎng)基與SPA培養(yǎng)基等)。實驗證明合適的高碳氮比篩選條件更有利于的生長，對目標(biāo)菌種篩選有利，能節(jié)省菌種篩選的時間。

[1]Botstein D R, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a geneticlinkage map in man using restriction fragment length polymorphism[J].Am J Hum Genet, 1980,32(3): 314-331.

[2]李 淼,李 瑤.獼猴桃潰瘍病研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，30(3):91-393.

[3]陳功友,王金生.植物病原細菌致病性決定因子[J].植物病理學(xué)報，2002，32(1):1-7.

[4]Tares S, Lemontey J M. Use of species-specific statellite fromBursaphelenchusxylophilusdiagnostic probe[J].Phytopathology, 1994, 84(3):294-298.

[5]Deng S J, Chuji H. Locafion of pathogenic mycoplasma-like organisms in plant tissue in situ hybridization[J]. Proceeding of the Japan Academy, 1991, 67(10): 197-202.

[6]Mas P, Sanchez-Navarro J A, Sanchez-Pina M A, et al.Chemiluminescent and colorigenic detection of Cherry leaf roll virus with digoxigenin-labeled RNA probes[J].Journal of Virological Methods, 1993, 45(1): 93-102.

[7]Opgenorth D C,Lat M,Sorrell M,et al.Pseudomonas canker of kiwifruit [J]. Plant Disease,1983,67(11):1283-1284.

[8]Manulis S, Valinsky L, Liehter A, et al. Sensitive and specific detection ofXanthomonascampestrispv.pelargoniiwith DNA primers and probes identified by random amplified pelymorphie DNA analysis[J].Appl Environ Microbiol, 1994,60(11): 4094-4099.

[9]Koh Y J, Nou I S. DNA markers for identification ofPseudomonassyringaepv.actinidiae[J]. Mol Cells, 2002, 13(2): 309-314.

[10]李 淼,檀根甲,李 瑤,等.不同獼猴桃品種對細菌性潰瘍病的抗病性及其聚類分析[J].植物保護,2004,30(5):51-54.

[11]Takikawa Y,Serizawa S,Ichikawa T, et al.Pseudomonassyringaepv.actinidaepv. nov.The causal bacterium of canker of kiwifruit in Japan[J].Ann.Phytopath Soc.Japan, 1989, 55:437-444

[12]Deng S J, Chu H. Location of pathogenic mycoplasma-like organisms in plant tissue in situ hybridization[J]. Proceeding of the Japan Academy, 1991, 67(10): 197-202.

[13]李 瑤，承河元，錢子華.稱猴桃潰瘍病防治研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001,28(2): 139-143.

[14]宋曉斌，王培新，張學(xué)武，等.稱猴桃細菌性潰瘍病生物防治初步研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2002, 17(1): 49-50.

[15]盛存波，安德容，魯燕漢，等.一株抗稱猴桃潰瘍病的芽抱桿菌分離和篩選研究初報[J].植物保護科學(xué),2005,4(12): 346-348.

[16]Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation [J]. Microbiology Reviews,1995, 59:143-169.

[17]Wise M G, McArther J V, Shimkets L J. Bacterial diversity of a Carolina bay as determined by 16S rRNA gene analysis: Confirmation of novel taxa[J]. Appl. Environ. Microbiol.，1997, 63:1505-1514

[18]Brunel B, Givaudan A, Lanois A, et al. Fast and accurate identification of Xenorhabdus and Photorhabdus species by restriction analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes[J]. Appl. Environ. Microbiol.，1997, 63:574-580

[19]Vandamme P,Pot B,Gillis M, et al. MicrobioloAical Reviews, 1996, 60: 407-438.

[20]Harmsen D, Kareh H. 16S rDNA for diagnosing pathogens: aliving tree[J].ASM News,2004,70(19):19-24.

[21]楊 霞，陳 陸，王川慶.16SrRNA基因序列分析技術(shù)在細菌分類中應(yīng)用的研究進展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008, 36(2): 55-60.

[22]Kim S B, Yoon J H, Kim H, et al. Int J Svst Bacteriol, 1995, 45:351-356.

[23]Lenoard J, Lascolea J R, Dryyia D. Quantitation of bacteria in cerebrospinal fluid and blood of children and its diagnostic significance[J]. Clin Microbioh, 1984, 19(2): 187.

[24]Paul K, Corkil J E, Hooi P S, et al. Isolation ofWaddliamalaysiensis, a nove lintracellular bacterium, from fruit bat(Eonycterisspelaea)[J]. Emerg Infect Dis,2005,11(2): 271-277.

[25]Tenhaken R，Levine A，Brisson L F，et al．Function of the oxidative burst in hypersensitive disease resistance[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1995,92(10):4158-4163.

(責(zé)任編輯 李 潔)

NewScreeningMethodsandIdentificationofKiwifruitCankerPathogen

TIAN Can-xi，SONG Jin-qiu，XIANG Xiao-han，CUI Li-hong*

(Department of Bioengineering, Ethnic Vocational and Technical College, Hunan Jishou 416000, China)

【Objective】A new screening method for kiwifruit pathogenic bacteria was developed and used to isolate and identify pathogenic bacteria of ulcer disease in kiwifruit. 【Method】Based on annual kiwifruit shoots sugar tolerance and nitrogen tolerance results to design pathogen screening program. 【Result】The screening medium with high C/N ratio was obtained, and the screening efficiency of this medium was better than that of other screening media. The pathogenic bacteria were Pseudomonas syringae kiwi pathogens, which have been reported to be distantly related to pathogenic variants ofPseudomonassyringaekiwifruit. The pathogen is a pathogen ofPseudomonassyringaekiwi, which is distantly related to the recently reported pathogen-like variants. 【Conclusion】High-nitrogen ratio (C/N) selection pressure for bacteriaPseudomonassyringaebacteria kiwi screening is efficient.Pseudomonassyringaebacteria kiwi showed possible as a new mutation.

Kiwifruit ulcer disease;Pseudomonassyringae; Screening; Kiwi; Plant diseases

S436.634.1

A

1001-4829(2017)11-2518-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.021

2016-12-19

湖南湘西自治州重大科研項目“獼猴桃細菌性潰瘍病抗性砧木的選育與研究”(湘西自治州財企指[2016]9號)；湖南省教育廳科研項目“獼猴桃潰瘍病病菌的拮抗微生物選育研究”(17C1576)

田璨熙(1986-)，男，講師，碩士，主要從事微生物/酶工程與發(fā)酵方面研究，*為通訊作者：崔麗紅(1974-)，女，副教授，碩士， 研究方向：林學(xué)。