林穎 邢泉 高現(xiàn)靈 徐萌 林正梅

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Sema3A/Nrp1信號(hào)軸在慢性牙周炎牙周組織中的表達(dá)及在牙周骨質(zhì)破壞中的作用

林穎 邢泉 高現(xiàn)靈 徐萌 林正梅

目的研究軸突導(dǎo)向蛋白3A(semaphorins3A, Sema3A)及其受體神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1, Nrp1)在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用。方法20 只SD大鼠隨機(jī)分為2 組(n=10)，實(shí)驗(yàn)組建立慢性牙周炎模型，對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，8 周后處死。micro-CT測(cè)量大鼠釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離(CEJ-ABC)，免疫組化染色計(jì)算Sema3A/Nrp1陽(yáng)性染色積分光密度，并進(jìn)行相關(guān)性分析。門(mén)診收集慢性牙周炎樣本及正常樣本各10 例，進(jìn)行免疫熒光和qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組釉CEJ-ABC明顯高于對(duì)照組(Plt;0.05)，Sema3A/Nrp表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組(Plt;0.05)，CEJ-ABC與Sema3A/NrP呈負(fù)相關(guān)(Plt;0.05)。人牙周炎樣本Sema3A/Nrp1熒光強(qiáng)度及mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(Plt;0.05)。結(jié)論Sema3A/Nrp1表達(dá)量的減少參與了慢性牙周炎骨破壞進(jìn)程。

】 慢性牙周炎(CP)； 骨質(zhì)破壞； Sema3A/Nrp1信號(hào)軸

慢性牙周炎(chronic periodontitis, CP)是頜骨最常見(jiàn)的炎癥性骨吸收疾病之一，也是造成失牙的主要病因之一。臨床上多采用牙周潔治及刮治去除牙周袋內(nèi)的感染物質(zhì)，以促進(jìn)牙周組織的恢復(fù),但大量研究表明，經(jīng)過(guò)徹底的牙周治療后仍有部分患者的牙槽骨水平難以達(dá)到令人滿意的愈合效果，面臨牙拔除的可能。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，軸突導(dǎo)向蛋白3A(semaphorins3A, Sema3A)/受體神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1, Nrp1)信號(hào)軸是一對(duì)不僅能抑制破骨細(xì)胞分化，而且能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟的雙重調(diào)節(jié)因子，有可能成為一種新的治療靶標(biāo)[1]。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，Sema3A/Nrp1信號(hào)軸在促進(jìn)骨形成中具有重要作用[2-3]。

然而，Sema3A/Nrp1在炎性骨吸收條件下的表達(dá)規(guī)律及作用目前尚未深入探究，因此本研究擬探索Sema3A/Nrp1信號(hào)軸在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用，為防治慢性牙周炎骨吸收提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從中山大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2011-0029]購(gòu)買(mǎi)7～8 周齡的雄性SD大鼠20 只，并在中山大學(xué)(北校區(qū))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(粵)2012-0081]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已獲中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床樣本

1.3 主要試劑和儀器

Micro-CT掃描儀(Scanco,瑞士)；兔抗大鼠/人Sema3A多克隆抗體、兔抗大鼠/人Nrp1單克隆抗體(Abcam,英國(guó))；TRAP染色試劑盒(Sigma,美國(guó))；組織mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；SYBR Green I，全自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)儀(Roche,美國(guó))；DAPI(Thermo fisher,美國(guó))；全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡(Zeiss,德國(guó))。

1.4 動(dòng)物分組及建模

將20 只SD大鼠隨機(jī)分為2 組，每組10 只。實(shí)驗(yàn)組大鼠2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分別在雙側(cè)上頜第二磨牙齦溝處綁線結(jié)扎(5-0絲線)，并輔以高糖飲食[4]。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。8 周后脫頸處死各組大鼠，分離上頜骨組織用于Micro-CT分析及病理學(xué)分析。

1.5 Micro-CT掃描

已分離的大鼠上頜骨樣本立即固定在4%多聚甲醛中，48 h后轉(zhuǎn)移樣本進(jìn)行Micro-CT掃描。掃描參數(shù)如下：電壓70 kV，電流114 mA，精度20 μm，掃描時(shí)間3 000 ms。并進(jìn)行3D重建，測(cè)量上頜第二磨牙頰側(cè)近中、近中、腭側(cè)近中及頰側(cè)遠(yuǎn)中、遠(yuǎn)中、腭側(cè)遠(yuǎn)中6 個(gè)位點(diǎn)的釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂(cementoenamel junction to alveolar bone crest, CEJ-ABC)的距離，并取均值代表該樣本的骨吸收程度。

1.6 蘇木素-伊紅染色

4)注意作為修正標(biāo)記語(yǔ)的well，如果well處于話輪的中間，則為自己修正標(biāo)記語(yǔ)；而處于話輪開(kāi)始時(shí)，則為他人修正標(biāo)記語(yǔ)。

Micro-CT掃描后，將大鼠上頜骨樣本放置在10% EDTA二鈉溶液中脫鈣至少2 個(gè)月。脫鈣結(jié)束后，樣本被制備成8 mm×6 mm×4 mm的方塊進(jìn)行脫水及包埋。沿磨牙近遠(yuǎn)中方向?qū)⑾瀴K切成4 mm厚度的連續(xù)切片并進(jìn)行HE染色。由2 位獨(dú)立的病理醫(yī)師在25 倍及100 倍光鏡下對(duì)各組大鼠牙周情況進(jìn)行評(píng)估。

1.7 免疫組化染色

每個(gè)樣本選取2 張連續(xù)切片按免疫組化步驟進(jìn)行染色，其中Sema3A/Nrp1抗體的使用濃度均為1∶500。染色結(jié)束后由2 位獨(dú)立的病理醫(yī)師在400 倍光鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，Image Pro Plus軟件評(píng)估大鼠牙周區(qū)域Sema3A/Nrp1陽(yáng)性染色的積分光密度(integrated optical density, IOD)。

1.8 免疫熒光染色

收集到的新鮮組織樣本立即固定在4%多聚甲醛中，48 h后進(jìn)行脫水及包埋。包埋結(jié)束后將蠟塊切成4 mm厚度的連續(xù)切片，選取其中一張切片進(jìn)行雙標(biāo)免疫熒光染色，其中Sema3A/Nrp1抗體的使用濃度均為1∶100，紅色熒光標(biāo)記的驢抗兔IgG作為Sema3A第二抗體，綠色熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為Nrp1第二抗體，藍(lán)色熒光標(biāo)記的DAPI作為染核試劑。染色后由2 位獨(dú)立的病理醫(yī)師在400 倍倒置熒光顯微鏡下對(duì)各組Sema3A/Nrp1的表達(dá)及定位情況進(jìn)行評(píng)估。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集新鮮組織樣本在液氮中速凍，置于研缽中研磨。提取總RNA，測(cè)定RNA純度及濃度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，熒光定量檢測(cè)組織中相對(duì)mRNA含量。引物序列見(jiàn)表 1。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)循環(huán)40 次，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，采用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。

表 1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié) 果

2.1 SD大鼠牙周炎模型建立

建模8 周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠上頜第二磨牙牙齦明顯紅腫、探診易出血，齦溝加深， 已出現(xiàn)顯著的牙周炎癥狀。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組溝內(nèi)上皮及結(jié)合上皮增生程度增加，膠原纖維破壞，漿細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨輕度吸收；對(duì)照組臨床及病理檢查牙周組織無(wú)明顯異常(圖 1)。Micro-CT三維重建結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)钠骄嚯x達(dá)0.87 mm，對(duì)照組為0.61 mm，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2,表 2)。

圖 1 蘇木素-伊紅染色結(jié)果

圖 2 Micro-CT三維重建顯示釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離

Fig 2 Micro-CT results showing the CEJ-ABC distance

2.2 Sema3A/Nrp1表達(dá)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組Sema3A/Nrp1陽(yáng)性染色結(jié)果及IOD值見(jiàn)圖 3。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Sema3A/Nrp1 IOD值均顯著下降，且兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，提示在牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Sema3A/Nrp1的表達(dá)水平下調(diào)(圖 3)。

2.3 相關(guān)性分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法對(duì)各組釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離與Sema3A/Nrp1的IOD值進(jìn)行相關(guān)性分析，表 2顯示二者呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示Sema3A/Nrp1信號(hào)軸的表達(dá)水平與骨吸收密切相關(guān)。同時(shí)，Sema3A與其受體Nrp1的表達(dá)水平間也具有明顯的正相關(guān)關(guān)系。

表 2 Sema3A/Nrp1染色I(xiàn)OD值與CEJ-ABC的關(guān)系

2.4 臨床樣本Sema3A/Nrp1定性、定位、定量表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組免疫熒光染色結(jié)果見(jiàn)圖 4。其中藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核的表達(dá)情況，紅色熒光代表Sema3A+的表達(dá)情況，綠色熒光代表Nrp1+的表達(dá)情況。熒光染色合成圖顯示Sema3A蛋白主要在胞質(zhì)及胞膜表達(dá)，Nrp1蛋白主要在胞膜表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Sema3A/Nrp1信號(hào)軸的表達(dá)強(qiáng)度及密度顯著降低(Plt;0.05)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Sema3A/Nrp1的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(Plt;0.05)(圖 5)。

圖 3 免疫組化染色結(jié)果(×400)

Fig 3 IHC staining results(×400)

圖 4 免疫熒光染色結(jié)果(×400)

Fig 4 IF staining results(×400)

圖 5 Sema3A/Nrp1 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

慢性牙周炎是因牙周組織感染厭氧菌或兼性厭氧菌而導(dǎo)致牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨等結(jié)構(gòu)持續(xù)性破壞的一種炎性疾病。由于細(xì)菌致病因子的存在及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活性的失衡，單純采取抑制破骨細(xì)胞分化或促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的方法都難以使牙周骨質(zhì)達(dá)到最理想的愈合效果[5-7]。Sema3A/Nrp1作為一對(duì)骨雙重調(diào)節(jié)因子，在促進(jìn)骨形成方面的作用越來(lái)越受重視[8]。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，Sema3A的表達(dá)水平在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中下調(diào)，并與疾病的活躍度及病理表現(xiàn)相關(guān)[9]，同時(shí)Sema3A可以減緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性關(guān)節(jié)炎的炎癥進(jìn)展情況[10]。本研究率先探索了Sema3A/Nrp1信號(hào)軸在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常牙周組織相比，炎性牙周組織中Sema3A/Nrp1信號(hào)軸的表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了炎癥環(huán)境下Sema3A的表達(dá)水平受到了抑制。同時(shí)本研究通過(guò)對(duì)Sema3A/Nrp1信號(hào)軸的表達(dá)水平與牙周骨質(zhì)破壞程度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此我們有理由相信，下調(diào)的Sema3A/Nrp1信號(hào)軸其抑制破骨前體細(xì)胞遷移、分化以及促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力也受到抑制，造成了牙槽骨的破壞性吸收。未來(lái)如果針對(duì)Sema3A/Nrp1信號(hào)軸進(jìn)行靶向干預(yù)，有可能顯著促進(jìn)牙周骨質(zhì)破壞的恢復(fù)。

本研究通過(guò)對(duì)Sema3A/Nrp1信號(hào)軸在大鼠及人牙周組織樣本中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步明確了它的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。Sema3A作為Semaphorins家族中的分泌性蛋白，主要在胞質(zhì)及胞膜表達(dá)，但其必須與Plexin-A1及Nrp1復(fù)合受體結(jié)合后才能協(xié)同向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，從而發(fā)揮作用。然而正是由于其受體Plexin-A1及Nrp1既在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞胞膜表面表達(dá)，又在成骨細(xì)胞胞膜表面表達(dá)，因此決定了Sema3A作為骨雙重調(diào)節(jié)因子的分子基礎(chǔ)[11]。通過(guò)對(duì)Sema3A及其受體Nrp1表達(dá)水平的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)二者具有明顯的正相關(guān)性(rS-N=0.977，Plt;0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了二者作為一對(duì)骨調(diào)節(jié)信號(hào)軸蛋白的協(xié)同關(guān)系。

慢性牙周炎導(dǎo)致的骨質(zhì)吸收，是由于病原微生物刺激而導(dǎo)致牙周組織抗感染免疫反應(yīng)的結(jié)果。在牙周炎的病理變化過(guò)程中，其致病菌牙齦卟啉單胞菌的內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)發(fā)揮了重要的致病作用[12-13]。LPS可以促進(jìn)炎性因子如TNF-α、IL-1等的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的成熟[14-15]。因此我們推測(cè)LPS可能是影響Sema3A/Nrp1信號(hào)軸表達(dá)下調(diào)的重要因素，該部分內(nèi)容還需要進(jìn)一步深入研究。

總之，通過(guò)建立大鼠根尖周炎模型及對(duì)人臨床樣本的檢測(cè)，證實(shí)Sema3A/Nrp1在慢性牙周炎中表達(dá)下降，并與牙槽骨的骨質(zhì)缺損密切相關(guān)，為慢性牙周炎等炎癥性骨吸收的病理研究和治療提供新的思路和依據(jù)。

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(收稿： 2016-12-27 修回： 2017-02-15)

TheexpressionofSema3a/Nrp1signalaxisintheperiodontaltissuewithchronicperiodontitisandit'sroleinbonedestruction

LINYing,XINGQuan,GAOXianling,XUMeng,LINZhengmei.

510055Guangzhou,GuanghuaSchoolofStomatology,HospitalofStomatology,SunYat-senUniversity,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofStomatology,China

Objective: To explore the role of Semaphorins 3A(Sema 3A) and its receptor Neuropilin-1(Nrp1) in the development of chronic periodontitis of rats and clinical samples.Methods20 SD rats were divided into 2 groups. Rats in the experimental group were induced into chronic periodontitis models. Rats in control group were not treated. After 8 weeks, maxilla of all the rats were collected for micro-CT scanning and IHC staining. The distance from cementoenamel junction to alveolar bone crest(CEJ-ABC) and the IOD of Sema3A/Nrp1 positive staining in rats were analyzed. 20 clinical samples of chronic periodontitis(n=10) and normal periodontal tissues(n=10) were collected for immunofluorescence and qRT-PCR analysis.ResultsThe CEJ-ABC distance of chronic periodontitis group was higher than that of the control group(Plt;0.05). The IOD of Sema3A/Nrp1 in experimental group was lower than that of the control group(Plt;0.05) and with a negative correlation with bone loss(Plt;0.05). Immunofluorescence and qRT-PCR analysis showed that the expression level of Sema3a/Nrp1 in clinical samples with chronic periodontitis was also lower than that of the healthy subjects(Plt;0.05).ConclusionThe reduced Sema3A/Nrp1 plays an important role in the development of bone destruction in chronic periodontitis.

Chronicperiodontitis(CP)；Bonedestruction；Sema3a/Nrp1signalaxis

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)： 81300874)； 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)： 2016B050502008)； 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(編號(hào)： A2016195)

510050 廣州， 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

林正梅 E-mail: linzhm@mail.sysu.edu.cn

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.001