李淑英，辛鳳姣，王鳳忠

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193

納豆激酶，一種潛在的用于預(yù)防與治療心血管疾病的功能食品添加劑

李淑英，辛鳳姣，王鳳忠

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193

納豆激酶是一種具有高效纖維蛋白溶解活性的絲氨酸蛋白酶，由枯草屬菌株、假單胞菌屬菌株和海洋生物合成。與常規(guī)的纖維蛋白溶解酶相比，納豆激酶具有高效、無毒、半衰期長(zhǎng)、可以口服、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在功 能性食品添加劑和心血管疾病預(yù)防與治療等方面極具應(yīng)用潛力。對(duì)納豆激酶及其生產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、重組表達(dá)、分子改造、分離純化、功能研究和安全評(píng)估等方面進(jìn)行了簡(jiǎn)單介紹，并歸納總結(jié)了納豆激酶現(xiàn)有問題，同時(shí)就其生產(chǎn)和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

納豆；納豆激酶；纖維蛋白；枯草芽孢桿菌；心血管疾病

納豆激酶（NK，E C 3.4.21.62）是由枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的一種高效纖維蛋白溶解酶，最早從傳統(tǒng)的日本大豆發(fā)酵食品——納豆中發(fā)現(xiàn)[1]。NK由 aprN基因編碼，基因開放閱讀框全長(zhǎng)1143bp，起始密碼子為GTG，終止密碼子為TAA。全蛋白由信號(hào)肽、前導(dǎo)肽和成熟肽組成：信號(hào)肽由29個(gè)氨基酸殘基組成，引導(dǎo)NK跨膜分泌；前導(dǎo)肽由77個(gè)氨基酸殘基組成，作為胞內(nèi)分子伴侶輔助NK折疊；成熟肽由275個(gè)氨基酸殘基組成，與NK的生物學(xué)功能相關(guān)，因此被稱為功能肽［圖1（a）］。NK成熟肽的分子量為27.7kDa、等電點(diǎn)6.60[2]。

以納豆枯草芽孢桿菌NC2-1合成的NK成熟肽為模板，在NCBI序列文庫(kù)中進(jìn)行序列檢索，獲得同源性大于86%的序列100條。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NK之間，以及NK與絲氨酸蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶（subtilisin）、肽酶（peptidase）、角蛋白酶（keratinase）、彈性蛋白酶（elastase）、纖維蛋白酶（ fi brinolytic enzyme）、蛋白酶（protease）等蛋白之間序列同源性極高（大于86%）（表1）。NK成熟肽的結(jié)晶結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析（PDB ID ：4DWW 和 3VYV）[3]［圖1（b）］。其活性中心包括催化三聯(lián)體（Asp32、His64和Ser221）、氧離子洞（Asn155）和底物結(jié)合位點(diǎn)（Ser125、Leu126和Gly127）[4]。NK因與枯草桿菌蛋白酶具有很高的序列和結(jié)構(gòu)同源性，而被劃分到堿性絲氨酸蛋白酶家族，但是只有NK對(duì)纖維蛋白顯示了極高的底物特異性[5]。

圖1 NK序列結(jié)構(gòu)圖

表1 NCBI序列文庫(kù)中部分與NK高同源性序列匯總

NK不僅可以直接溶解交聯(lián)狀的血栓，還可以催化血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶，增加體內(nèi)血栓溶解因子諸如t-PA的合成，失活纖維蛋白溶解抑制劑（PAI-1）等，在體內(nèi)呈現(xiàn)多重的血栓溶解活性[6]。NK具有pH和溫度穩(wěn)定性，在胃腸道中可穩(wěn)定存在且可通過腸道吸收，在血液中存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3h[6]。與常規(guī)的溶栓藥物相比，NK具有活性高、無毒副作用、半衰期長(zhǎng)、可口服、價(jià)格低廉等很多優(yōu)點(diǎn)[7]。這些優(yōu)點(diǎn)都顯示了NK在未來血栓治療方面極大的應(yīng)用潛力。

目前關(guān)于NK的研究主要集中于菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、重組表達(dá)、分子改造、分離純化、功能研究和安全評(píng)估等方面。以下將從這幾個(gè)方面展開介紹。

1 NK生產(chǎn)菌株選育

合成NK的枯草菌株都是從傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中篩選獲得，如中國(guó)的豆豉[8]，韓國(guó)的大豆醬[9]和豆醬[10-11]。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬菌株[12]和一些海洋生物[13]也可以生產(chǎn)NK。

原始菌株NK的表達(dá)量一般較低，研究人員通常會(huì)通過誘變的方法，提高生產(chǎn)菌株的NK表達(dá)量、活力和穩(wěn)定性等。如通過紫外誘變納豆菌原生質(zhì)體，使生產(chǎn)菌株NK的比活力提高16.6%，65℃處理15min后熱穩(wěn)定性提高20%[14]；通過鹽酸羥胺和紫外復(fù)合誘變使NK生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶能力提高68%[15]；通過紫外誘變使NK生產(chǎn)菌株的活力提高了8.81%[16]；筆者課題組前期研究，采用60Co-γ射線輻照誘變使得NK生產(chǎn)菌株的纖維蛋白水解活性提高了29.62%，熱穩(wěn)定性提高了82.31%[17]；通過紫外誘變銅綠假單胞菌CMSS使得NK表達(dá)量提高2倍多[18]。

2 發(fā)酵條件優(yōu)化

為了提高菌株的產(chǎn)酶能力，研究人員對(duì)菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，主要針對(duì)發(fā)酵原料、接菌量、發(fā)酵溫度、pH等方面。固態(tài)發(fā)酵一般用于生產(chǎn)發(fā)酵食品。以鷹嘴豆作為發(fā)酵原料，通過對(duì)發(fā)酵溫度和濕度優(yōu)化，可以顯著提升解淀粉芽孢桿菌LSSE-62培養(yǎng)基中NK產(chǎn)量，最終在34℃、起始濕度50%時(shí)，該菌株表達(dá)NK的纖維蛋白水解活性高達(dá)39.28 FU/g[19]。在豆渣中補(bǔ)充3%的糖蜜和2%的谷氨酸，pH7.0、45℃發(fā)酵24h后，枯草芽孢桿菌GXA-28生產(chǎn)NK的纖維蛋白水解活性高達(dá)986 U/g[20]。

與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵主要為了提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。研究顯示通過發(fā)酵條件優(yōu)化可顯著提高NK的表達(dá)量。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化發(fā)酵配方和產(chǎn)酶條件，在最佳培養(yǎng)基中NK活性最高可達(dá)1300 U/mL，與原始培養(yǎng)基相比，增加了6倍[21]。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸和金屬離子是枯草芽孢桿菌合成NK的限制因素，通過補(bǔ)充谷氨酸鹽和金屬離子，NK的產(chǎn)量提高4倍（260mg/L）[22]。通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成（葡萄糖、蛋白胨、CaCl2和MgSO4），在最適培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌合成NK的纖維蛋白水解活性高達(dá)3194.25U/mL，比優(yōu)化前提高2倍多[23]。通過調(diào)整葡萄糖和蛋白胨比例，進(jìn)行高密度補(bǔ)料分批發(fā)酵條件優(yōu)化，當(dāng)葡萄糖與蛋白胨的比例為0.33∶1時(shí)，NK的纖維蛋白水解活性達(dá)到14 500U/mL，比之前提高4.3倍[24]。以上結(jié)果表明盡管研究人員采用的NK檢測(cè)方法各異，無法進(jìn)行橫向比較，但是就菌株自身而言，發(fā)酵條件優(yōu)化前后NK的表達(dá)量還是發(fā)生了顯著變化。

3 重組表達(dá)與分子改造

為了增加NK的產(chǎn)量并簡(jiǎn)化下游純化過程，NK基因被克隆并在各種表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，如大腸桿菌[25]、枯草芽孢桿菌[26]、乳酸乳球菌[27]、酵母[28]、昆蟲[29]和植物[30]。大腸桿菌因?yàn)檫z傳背景清楚、操作簡(jiǎn)便且培養(yǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，被用作NK重組表達(dá)的首選系統(tǒng)。然而，NK在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá)，大部分蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中喪失活性。通過將NK基因的信號(hào)肽與周質(zhì)分泌信號(hào)肽PelB融合，使得NK在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，但是所得NK的纖維蛋白溶解活性卻顯著低于天然分離的NK[31]。不過，2016年Ni等[27]研究發(fā)現(xiàn)，將NK包涵體與重折疊溶液直接混合時(shí)，蛋白質(zhì)可以簡(jiǎn)單地恢復(fù)到天然活性蛋白水平?？莶菅挎邨U菌作為NK的來源菌株、食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)及其分泌表達(dá)特性，也成為NK重組表達(dá)的首選系統(tǒng)。然而，枯草芽孢桿菌自身表達(dá)多種胞外蛋白酶，大量降解了該系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。研究人員已經(jīng)通過8種胞外蛋白酶表達(dá)基因缺陷菌株解決了該類問題，顯著提高NK表達(dá)水平[32]。此外，通過缺失枯草芽孢桿菌的多個(gè)裂解基因，可顯著增強(qiáng)該菌株的生物量和NK表達(dá)量（增加了2.6倍）[33]。改造地衣芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)信號(hào)肽和信號(hào)肽酶，可以顯著改善NK的表達(dá)量，在AprE信號(hào)肽和I型信號(hào)肽酶sipV組合表達(dá)后，NK活性高達(dá)35.60FU/mL，比原始菌株增加4.68倍[34]。NK在真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)。NK在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，且具有纖維蛋白水解活性[29]，然而該系統(tǒng)生產(chǎn)成本高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且其表達(dá)量極低。NK在煙葉中通過BeYDV系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，且具有纖維蛋白溶解活性，但是該重組NK會(huì)引起煙草葉片壞死[30]。

除了選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)和對(duì)宿主菌株進(jìn)行遺傳修飾外，表達(dá)原件的優(yōu)化也是增加NK表達(dá)量的有效途徑。將aprN基因啟動(dòng)子（PaprN）的-10元件（TACAAT）替換為共有原件（TATAAT），可顯著提升NK的表達(dá)量（643mg/L）[35]。此外，通過啟動(dòng)子優(yōu)化構(gòu)建高效生產(chǎn)NK的自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)果表明與最佳啟動(dòng)子P23組合下，NK的活性增加93.6 FU/mL[36]。

除了通過基因工程增強(qiáng)NK的表達(dá)量外，研究人員通過蛋白質(zhì)工程定向進(jìn)化該蛋白，改善NK的催化特性，特別是NK結(jié)構(gòu)獲得解析后，更加促進(jìn)了該類工作的進(jìn)展[3]。通過DNA family shuf fl ing構(gòu)建突變文庫(kù)，提高NK的催化活性，最后篩選所得突變株NK的催化活性比原始菌株提高2.3倍[37]。定點(diǎn)突變可顯著提高NK的催化活性和抗氧化活性等。如使用具有相同特征的氨基酸殘基替換101位Ser，可明顯增強(qiáng)NK的纖維蛋白溶解活性[38]；通過定點(diǎn)突變優(yōu)化位于催化殘基Ser221附近的氨基酸殘基Met222，顯著增加了NK的氧化穩(wěn)定性[39]；與野生型NK相比，將31位Ile殘基替換為L(zhǎng)eu使該酶的催化效率提高約2倍[40]。

4 NK分離純化

除了日本國(guó)民食用鮮納豆外，其余國(guó)家市售產(chǎn)品主要以NK粗酶膠囊為主，目前，尚無純酶制劑實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。從鮮納豆或者生產(chǎn)菌株發(fā)酵液中提取和純化NK將是一項(xiàng)極大的挑戰(zhàn)。常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法，如有機(jī)溶劑分級(jí)、鹽析、色譜層析和凝膠過濾，已被用于NK的分離純化。然而，冗長(zhǎng)的純化過程、極低的蛋白質(zhì)得率和復(fù)雜的操作過程等缺點(diǎn)嚴(yán)重阻礙了這些技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用[41]。

近年來，研究人員相繼開發(fā)了幾種有效NK純化方法。如，使用膨脹床可高效地從發(fā)酵液中純化NK，產(chǎn)量高達(dá)95%，比傳統(tǒng)方法提高了約50%[42]。此外，研究人員開發(fā)了一種新型的膨脹床吸附劑Fastline PRO，結(jié)合pH和離子濃度優(yōu)化，可以顯著提高其對(duì)發(fā)酵液中NK的吸附能力[43]。使用AOT/異辛烷反膠束提取法純化NK，提取率高達(dá)80%[44]。通過三相分配法可以從發(fā)酵液中純化NK，而且純化所得NK的pH和溫度穩(wěn)定性提高，在pH6.0和60℃下具有最大活性[45]。然而，不同的純化方法對(duì)NK的活性影響不同。此外，純化制品中保留的雜質(zhì)成分可能會(huì)引起過敏反應(yīng)，進(jìn)而阻礙了其作為血栓治療藥物的應(yīng)用[46]。NK產(chǎn)品的純度問題已經(jīng)引起了食品藥品監(jiān)督管理局的關(guān)注。目前，融合表達(dá)技術(shù)已經(jīng)被廣泛用來增加重組NK的產(chǎn)量和純度。如在大腸桿菌中將NK或其前體與卵清蛋白的C末端接頭多肽融合表達(dá)，然后通過溫度誘導(dǎo)激活內(nèi)含肽自剪接釋放活性NK，同時(shí)切除前導(dǎo)肽[47]。

5 NK功能研究

動(dòng)物試驗(yàn)[49-51]和人體試驗(yàn)[52]均證實(shí)：NK是用于治療心血管疾病的安全、高效、低廉的純天然補(bǔ)充劑[48-52]。①NK具有極強(qiáng)的纖維蛋白溶解能力。當(dāng)給犬口服四粒NK膠囊（2000FU/膠囊）時(shí)，由化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生的腿靜脈血栓在5h內(nèi)完全溶解，恢復(fù)正常血液流動(dòng)[51]。單劑量的NK也可有效裂解交聯(lián)狀的纖維蛋白[52]。在該研究中，12名健康的年輕男性隨機(jī)服用1粒NK膠囊（2000FU），口服NK膠囊2h后，血中抗凝血酶濃度明顯增加；服用NK 4h和6h后，NK激活機(jī)體多種不同纖維蛋白溶解和抗凝血途徑。②與其他血栓溶解酶相比，NK具有更強(qiáng)的溶栓活性。經(jīng)頸總動(dòng)脈血栓的大鼠模型證實(shí)，NK處理的大鼠恢復(fù)了62%的動(dòng)脈血流量；而經(jīng)纖維蛋白溶解酶原、纖維蛋白溶解酶、纖溶酶或彈性蛋白酶等處理后，大鼠頸動(dòng)脈血壓分別只恢復(fù)的15%～0不等[49]。③NK無毒副作用。阿司匹林是臨床上常用的降低血液黏度藥物，但其經(jīng)常會(huì)引發(fā)出血或胃潰瘍；NK可以改善血液流動(dòng)，但不會(huì)產(chǎn)生任何不良反應(yīng)[52]。因子Ⅶ和Ⅷ是評(píng)價(jià)心血管疾病的常用風(fēng)險(xiǎn)因子。在人體試驗(yàn)中，三組（健康志愿者、攜帶有心血管危險(xiǎn)因子的患者和接受透析的患者）每天口服兩粒NK膠囊（2000FU/膠囊），兩個(gè)月后觀察到因子Ⅶ、Ⅷ和纖維蛋白原顯著降低且趨勢(shì)一致。期間沒有檢測(cè)到不良反應(yīng)，心率、體重和尿酸水平保持穩(wěn)定[53]。④NK可以口服且通過腸道吸收。與蚓激酶相同，NK對(duì)高度酸性的胃液有更強(qiáng)的耐受性，可以通過腸道被吸收。1995年，藤田等[49]證實(shí)NK可以被大鼠腸道吸收進(jìn)入血液降解纖維蛋白原。隨后，2013年，美國(guó)研究小組在口服攝入1粒NK膠囊（2000FU/100 mg）的健康人血清中檢測(cè)到完整的NK[54]。

目前，在日本、中國(guó)、韓國(guó)、歐盟、加拿大和美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)，已有商業(yè)化的NK產(chǎn)品作為食品補(bǔ)充劑，廣泛應(yīng)用于降低血液黏度、預(yù)防和治療血栓及改善血液循環(huán)。還有研究表明，NK可以改善其他疾病，如高血壓[54]、中風(fēng)[55]、阿爾茨海默病[56]和動(dòng)脈粥樣硬化[57]等。目前正在開展Ⅱ期臨床試驗(yàn)評(píng)估使用NK降低血栓形成風(fēng)險(xiǎn)、減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程以及緩解認(rèn)知功能衰退的潛力。

6 NK安全評(píng)估

納豆在日本作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品已有一千多年的歷史。據(jù)報(bào)道，納豆可顯著延長(zhǎng)日本國(guó)民的壽命[1]。研究發(fā)現(xiàn)納豆提取物可顯著降低脂褐素的積累，延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的壽命[58]。用納豆和其生產(chǎn)菌株（1.51×109CFU/mL）接種大鼠沒有產(chǎn)生任何毒性跡象。治療14d后，通過組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，在肺、肝、腦或腎中未觀察到活的枯草芽孢桿菌殘留。在14d的研究期間，當(dāng)飼喂單劑量的NK（2000mg/kg）時(shí)，在急性毒性研究中未觀察到明顯的不良跡象或死亡率。當(dāng)重復(fù)給予單次日劑量（1000mg/kg）的NK 90d時(shí)，臨床沒有檢測(cè)到任何異常[59]。在臨床研究中，當(dāng)健康志愿者每日口服NK（10mg/kg），經(jīng)連續(xù)28d測(cè)試，其尿液、血壓、脈搏均無顯著變化[59]。

7 前景與展望

上述研究已經(jīng)證實(shí)納豆激酶在未來的心血管疾病預(yù)防與治療領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力。但NK在未來的食品和醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用主要依賴于提高生產(chǎn)菌株的表達(dá)量、增強(qiáng)其特性、開發(fā)純酶制劑等。首先，研究發(fā)現(xiàn)通過菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、遺傳改造和蛋白質(zhì)工程等技術(shù)可使NK的表達(dá)量提高到毫克級(jí)，但是作為功能食品添加劑或者藥品實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，產(chǎn)量達(dá)到克級(jí)在經(jīng)濟(jì)上才可行。NK生產(chǎn)菌種是此項(xiàng)技術(shù)的核心，高通量的篩選方法是選育高水平生產(chǎn)菌株的前提，進(jìn)一步的研究可以集中在高通量篩選方法的搭建。其次是NK的特性，如催化效率、穩(wěn)定性和口服半衰期等，決定該酶實(shí)現(xiàn)應(yīng)用的致命因素。雖然已經(jīng)開展了大量工作來改善NK的催化特性和穩(wěn)定性，但是NK熱穩(wěn)定性的研究幾乎毫無進(jìn)展，而該特性在其分離提取、劑型開發(fā)和存儲(chǔ)運(yùn)輸過程中起決定性作用。再者，NK從消化道運(yùn)送到循環(huán)系統(tǒng)中的分子機(jī)制需要進(jìn)一步闡明，這需要從NK的pH值、輔因子和胃腸道消化酶的耐受性入手，需要闡明這些特性與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系。最后，制備NK純酶制劑是實(shí)現(xiàn)藥物開發(fā)的前提。因此，需要開發(fā)新的分離提取工藝，以提高NK的得率、活性以及穩(wěn)定性。相信在不久的將來，生物信息學(xué)、基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的飛速發(fā)展將為高純度性能優(yōu)良的NK從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)化生產(chǎn)鋪平道路。

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Nattokinase, a potential functional food additives for cardiovascular disease prevention and treatment

LI Shuying，XIN Fengjiao，WANG Fengzhong
Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing 100193, China

Nattokinase is a serine protease with a potent fi brin-degrading activity, and produced by Bacillus sp., Pseudomonas sp. and marine creatures. Compared with conventional fibrinolytic enzymes, nattokinase has many advantages such as high ef fi ciency, non-toxic, long half-life, oral administration and low cost, which shows high potential in the fi elds of functional food additives and cardiovascular disease prevention and treatment and so on. In this paper, the nattokinase was introduced brie fl y,and the breeding of the strains, the optimization of the fermentation conditions, the recombinant expression, the molecular transformation, the separation and puri fi cation, the function research and the safety assessment were also summarized. Finally, the existing problems of nattokinase were summarized and the prospect of production and application were also discussed.

natto; nattokinase; fi brin; Bacillus subtilis; cardiovascular disease

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.014

李淑英，博士，副研究員。主要從事微生物發(fā)酵，功能成分的分離、提取、鑒定、大量制備、功能研究、機(jī)制探索、改造和生物合成等研究工作。E-mail：lishuying2000@163.com

王鳳忠，研究員，碩士生導(dǎo)師，食品功能因子研究與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)首席科學(xué)家，現(xiàn)任中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所副所長(zhǎng)。從事特色農(nóng)產(chǎn)品加工及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)工作，圍繞石斛等特色農(nóng)產(chǎn)品開展相關(guān)的功能食品開發(fā)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。E-mail：wangfengzhong@sina.com