張曉健 ，鄭裕國

1.浙江工業(yè)大學生物工程學院，杭州 310014 2.浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室，杭州 310014

甘油原料轉化生產手性環(huán)氧氯丙烷關鍵酶的開發(fā)

張曉健1，2，鄭裕國1，2

1.浙江工業(yè)大學生物工程學院，杭州 310014 2.浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室，杭州 310014

手性環(huán)氧氯丙烷是一種重要的三碳手性合成子，在醫(yī)藥、農藥、化工、材料等領域有著廣泛的應用。開發(fā)以甘油替代石油基原料合成手性環(huán)氧氯丙烷的綠色合成工藝具有重要的開發(fā)價值。生物催化技術可有效提高過程安全性與原子經濟性，降低“三廢”排放，提升產品質量。闡述了生物催化合成手性環(huán)氧氯丙烷關鍵酶技術的研究進展，進行了生物合成路線設計、鹵化酶酶庫構建、鹵醇脫鹵酶與環(huán)氧化物水解酶的篩選與改造、鹵醇脫鹵酶/環(huán)氧化物水解酶雙酶串聯合成手性環(huán)氧氯丙烷工藝構建等技術開發(fā)，為手性環(huán)氧氯丙烷綠色生物合成技術的研究與應用提供理論基礎與技術支持。

甘油；手性環(huán)氧氯丙烷；1，3-二氯-2-丙醇；生物催化；鹵醇脫鹵酶；環(huán)氧化物水解酶

新世紀以來，作為化石燃料的重要替代產品，生物柴油備受青睞，產量與市場迅速擴張。在生物柴油生產過程中，會產生大量的副產物甘油[1-2]。隨著生物柴油產業(yè)的飛速發(fā)展，甘油在全球范圍內過剩，市場價格一路下跌。相較于石油基原料，從甘油出發(fā)，合成具有高附加值的甘油衍生產品不但具有原料可再生、綠色環(huán)保等優(yōu)點，而且在生產成本上逐漸顯現優(yōu)勢，成為綠色化工的重要新興領域[3-5]。

手性環(huán)氧氯丙烷（epichlorohydrin，ECH）是一種重要的三碳手性合成子，廣泛應用于手性制藥與精細化工產業(yè)，是包括新型他汀類降血脂藥物、芳氧丙胺醇類β-腎上腺素拮抗劑、抗生素海藻唑啉、左旋肉堿、維生素等多種重要手性藥物的合成前體（圖1）[6-7]。隨著 手性制藥與精細化工產業(yè)的不斷擴張，對手性環(huán)氧氯丙烷的需求也隨之不斷擴大。

傳統(tǒng)的手性環(huán)氧氯丙烷合成方法是以石油基原料丙烯出發(fā)合成手性環(huán)氧氯丙烷，存在著原料價格高、副產物多、原子經濟性差、“三廢”排放大等嚴重問題。近年來，甘油出發(fā)的合成路線得到發(fā)展，主要是通過甘油氯化合成1，3-二氯-2-丙醇，再經皂化反應生產環(huán)氧氯丙烷，最后采用salen催化劑拆分獲得（R）-或者（S）-環(huán)氧氯丙烷。該技術雖已在工業(yè)生產中得到應用推廣，但仍存在一些嚴重缺陷：生產過程中需加溫加壓，屬于高耗能過程；存在大量強酸強堿的使用，環(huán)保問題突出；手性拆分制備手性環(huán)氧氯丙烷，理論產率不超過50%，催化劑價格昂貴。當前的手性環(huán)氧氯丙烷生產工藝不能滿足現代綠色化學的發(fā)展要求[6-8]。

生物催化具有高活性、高立體選擇性、反應條件溫和等優(yōu)勢，成為可持續(xù)發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。探索開發(fā)手性環(huán)氧氯丙烷的生物催化合成途徑是近年來科學家研究的熱點[6]。本文結合國內外研究進展，基于筆者團隊研究成果，探索開發(fā)甘油出發(fā)的手性環(huán)氧氯丙烷生物合成技術，開展了酶法合成路線設計、關鍵酶的開發(fā)及生物催化體系的構建優(yōu)化等工作，為手性環(huán)氧氯丙烷的綠色合成技術開發(fā)提供理論指導與技術支持。

圖1 手性環(huán)氧氯丙烷的用途

1 三酶催化合成手性環(huán)氧氯丙烷路線分析

針對當前手性環(huán)氧氯丙烷合成工藝反應條件苛刻、“三廢”排放嚴重、催化劑價格昂貴等問題，筆者團隊以甘油為出發(fā)原料，深入分析合成路徑、生物催化劑介入可行性與原子經濟性等，引入三步生物催化步驟，構建手性環(huán)氧氯丙烷的生物合成過程（圖2）。首先設計采用鹵化酶催化甘油氯化合成1，3-二氯-2-丙醇，之后利用鹵醇脫鹵酶脫鹵環(huán)化制備環(huán)氧氯丙烷，最后在立體選擇性環(huán)氧化物水解酶的作用下，水解拆分獲得光學純的R或S型環(huán)氧氯丙烷。該三酶組合催化合成工藝徹底革除了原有化學合成工藝中強酸高溫氯化、皂化、貴金屬催化劑拆分等過程，產物光學純度高，催化劑成本明顯降低，酸堿用量大幅壓縮，副產物、溶劑用量、“三廢”排放量和能耗大幅度降低，具有顯著的優(yōu)越性。

圖2 以甘油為原料合成手性環(huán)氧氯丙烷的生物合成工藝線路

2 鹵化酶催化甘油氯化的探索

生物催化鹵化在21世紀逐漸成為新的研究熱點，不斷有新的含鹵生物物質被發(fā)現，相關的生物鹵化過程被探討，新型的鹵化酶被發(fā)掘研究。目前已經報道的鹵化酶主要有四類：過氧化物鹵化酶（haloperoxidase）、黃素依賴鹵化酶（ fl avin-dependent halogenase）、無血紅素鐵依賴鹵化酶（non-haem irondependent halogenase）以及SA M為底物鹵化酶（halogenases using S- adenosylmethionine）等[9-12]。Wu等[13]利用氯過氧化物酶催化3-氯丙烯氧化反應合成（R）-環(huán)氧氯丙烷，產物e.e.值為97.5%，產率達67.3%。然而，對生物鹵化反應的研究尚處于起步階段，已經報道具有鹵化能力的微生物仍較少，鹵化酶數量和種類更是屈指可數，生物鹵化機制的研究尚處于起步階段，大大制約了生物催化鹵化技術的開發(fā)與應用。目前國內外尚無甘油的生物催化氯化的報道，相關催化機制也不明確。

筆者團隊通過基因挖掘等生物信息學手段，在GenBank、EMBL、DDBJ等公共DNA數據庫快速篩選、挖掘潛在的鹵化酶基因序列，并加以功能驗證。共獲得42條過氧化物鹵化酶序列、32條黃素依賴鹵化酶序列、26條無血紅素鐵依賴鹵化酶序列以及潛在的3條SAM為底物鹵化酶序列。合成以上基因并構建重組載體，在工程菌中進行鹵化酶的高效可溶表達，建立了大容量、多樣性的鹵化酶酶庫。以此為基礎，并跟蹤生物鹵化領域的國內外最新進展，綜合利用結構模擬、定向進化、基因編輯等多種手段進行潛在甘油氯化酶的篩選、改造及生物催化甘油氯化機制的研究。

3 鹵醇脫鹵酶催化1，3-二氯丙醇合成環(huán)氧氯丙烷

鹵醇脫鹵酶（halohydrin dehalogenase，Hhe，EC 4.5.1.X）屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族，可通過分子內親核取代機制催化鄰鹵醇轉化為環(huán)氧化物和鹵化氫。近年來的研究發(fā)現，鹵醇脫鹵酶在生物催化與轉化領域發(fā)揮著重要的作用，利用其合成光學純的手性環(huán)氧化物中間體具有巨大的應用價值。國內外已經開展鹵醇脫鹵酶催化合成手性環(huán)氧氯丙烷的研究，并取得了一定的成果[14-15]。

3.1 鹵醇脫鹵酶的篩選與酶庫構建

長期以來，有報道的鹵醇脫鹵酶的數量非常有限。2013年，科學家通過宏基因組篩選、數據發(fā)掘等方法，篩選獲得多株鹵醇脫鹵酶，并根據同源性把這些新發(fā)現的酶分為四個亞類，拓展了鹵醇脫鹵酶的種類和多樣性[16]。在現有的鹵醇脫鹵酶中，對手性環(huán)氧氯丙烷合成具有立體選擇性催化能力的酶株十分有限，且立體選擇性往往不理想[6，17]。來源于Arthrobacter erithii H10a的鹵醇脫鹵酶DehA可催化1，3-二氯-2-丙醇合成（R）-環(huán)氧氯丙烷，e.e.值達89.3%。 來 源 于Corynebacterium sp. N-1074的HheB，選擇性催化合成（R）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值達90%[18]。

筆者團隊基于不同pH下酚酞溶液的吸光度變化，建立了產鹵醇脫鹵酶微生物高通量篩選模型，從環(huán)境樣品中篩選對1，3-二氯-2-丙醇具有較強脫鹵環(huán)氧化能力的菌株，并通過基因挖掘等生物信息學手段，在公共DNA數據庫快速篩選、挖掘潛在的鹵醇脫鹵酶并進行功能驗證。目前已獲得32條鹵醇脫鹵酶序列，并在大腸桿菌中進行重組表達，構建了多株高活性、高立體選擇性的鹵醇脫鹵酶重組工程菌。以此為基礎，建立用于環(huán)氧氯丙烷合成的鹵醇脫鹵酶酶庫。其中，來源于Tistrella mobilis ZJB1405的鹵醇脫鹵酶HHDHTm催化合成（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值＞60%，反應2 min，底物轉化率達95.2%[19]。

3.2 鹵醇脫鹵酶的立體選擇性催化機制與分子改造

研究顯示鹵醇脫鹵酶的立體選擇性受到酶的底物口袋尺寸、底物口袋和鹵素結合域相關氨基酸殘基等因素的影響。Tang等[20]對來源于Arthrobacter sp. AD2的鹵醇脫鹵酶HheAAD2的定點突變研究顯示，改變酶的鹵素離子結合域關鍵氨基酸殘基可顯著影響酶對底物2-氯-1-苯乙醇的立體選擇性。對來源于Arthrobacter sp. AD1的HheC進行迭代飽和突變，改變底物口袋相關的氨基酸殘基并進而改變底物p-硝基-2-溴-1-苯乙醇在活性中心的定位與構象，產生的突變酶具有極高的S型底物選擇性[21-22]。環(huán)氧氯丙烷分子小，在酶活中心空間位阻小，手性識別困難，目前關于鹵醇脫鹵酶立體選擇性催化手性環(huán)氧氯丙烷的分子機制尚未得到深入揭示。

筆者團隊對HheC的三維蛋白結構分析發(fā)現，175～188位氨基酸殘基形成的環(huán)參與鹵素離子的結合，推測以上位點在催化過程中的構象變化參與了酶的立體選擇性調節(jié)。Phe12和Trp249位氨基酸殘基也參與鹵素離子的穩(wěn)定與釋放，對酶的立體選擇性與活性發(fā)揮著重要作用（圖3）。選擇以上位點進行定點突變和聯合突變，經高通量篩選獲得高活性HheC突變體P175S/W249P，催化1，3-二氯-2-丙醇合成（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值由野生型HheC的5.7%提高至95.3%。

圖3 鹵醇脫鹵酶HheC的三維結構

3.3 鹵醇脫鹵酶催化手性環(huán)氧氯丙烷反應體系優(yōu)化

將HheC突變體P175S/W249P在大腸桿菌工程菌中重組表達，以重組工程菌為全細胞催化劑，催化1，3-二氯-2-丙醇合成手性環(huán)氧氯丙烷。通過反應體系優(yōu)化與反應過程控制，構建并優(yōu)化鹵醇脫鹵酶催化手性環(huán)氧氯丙烷反應體系。底物濃度為20mmol/L、pH10.0時，反應5min，（S）-環(huán)氧氯丙烷的收率達93.7%，e.e.值達95.3%。當底物濃度提升至40mmol/L時，（S）-環(huán)氧氯丙烷的產率與e.e.值分別為90.2%和92.1%（圖4）。產物e.e.值與產率等主要指標優(yōu)于國內外文獻報道水平[18-19，23]。

圖4 HheC突變體P175S/W249P不對稱催化（S）-環(huán)氧氯丙烷合成反應過程

4 環(huán)氧水解酶拆分制備手性環(huán)氧氯丙烷

4.1 環(huán) 氧水解酶的篩選

環(huán)氧化物水解酶（epoxide hydrolase，EH，EC 3.3.2.3）能夠催化外消旋環(huán)氧化物選擇性水解，制備高光學純度的環(huán)氧化物和相應的鄰位二醇。微生物來源的環(huán)氧化物水解酶來源廣，獲得方便，且具有很高的立體選擇性，在手性環(huán)氧化物生物合成中的應用已成為研究熱點[24-25]。利用環(huán)氧化物水解酶可對外消旋的環(huán)氧氯丙烷進行高效拆分，獲得光學純的手性環(huán)氧氯丙烷。

筆者團隊以環(huán)氧氯丙烷為目標底物，從環(huán)境樣品中篩選或在公共DNA數據庫中進行基因挖掘，獲得37條環(huán)氧化物水解酶序列，以此為基礎，建立了環(huán)氧化物水解酶酶庫。其中來源于Parvibaculum lavamentivorans ZJB14001的PlEH2催化拆分制備（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值＞99%，產率為12.8%。來源于Agromyces mediolanus的AmEH水解拆分消旋環(huán)氧氯丙烷制備（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值＞99%，產率為21.5%[26]。

4.2 環(huán)氧化物水解酶的立體選擇性催化機制與分子改造

近年來，環(huán)氧化物水解酶的分子機制逐漸得到揭示，通過理性、半理性設計，定向進化等手段進行分子改造獲得高活性、高立體選擇性環(huán)氧化物水解酶逐漸引起科學家們的興趣。Spelberg等[27]對來源于Agrobacterium radiobacter AD1 的ArEH進行定點突變，將參與底物結合和環(huán)氧開環(huán)的Tyr突變?yōu)镻he后，突變酶對R型芳香類環(huán)氧化物的對映選擇性提高了2～5倍。Thomaeus等[28]基于土豆環(huán)氧化物水解酶StEH的晶體結構與穩(wěn)態(tài)動力學分析，對Tyr149位點氨基酸殘基進行突變，破壞了質子傳遞鏈氨基酸殘基與水的氫鍵，顯著提高了酶對反式二苯乙烯氧化物的對映選擇性。

筆者團隊選擇對環(huán)氧化物水解酶AmEH進行定點飽和突變與聯合突變，構建大容量突變文庫。基于4-對硝基芐基嘧啶與環(huán)氧化物反應在600nm處吸光值發(fā)生變化的原理，建立環(huán)氧化物水解酶高通量篩選模型。篩選獲得AmEH突變體W182F/S207V/N240D。突變體改變了關鍵親核氨基酸殘基Asp181的氧原子與被進攻的（R）-環(huán)氧氯丙烷或（S）-環(huán)氧氯丙烷的環(huán)氧碳原子之間的距離與夾角（圖5），催化（R）-環(huán)氧氯丙烷水解的酶活及對映體選擇率分別是原始酶的約1.7倍和7.0倍。

4.3 環(huán)氧化物水解酶促手性拆分反應條件優(yōu)化

20世紀90年代，科學家即開始了對環(huán)氧水解酶拆分環(huán)氧氯丙烷的研究。Woo等[29]利用來自Novosphingobium aromaticivorans的環(huán)氧化物水解酶催化拆分環(huán)氧氯丙烷，底物濃度500mmol/L，獲得（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值＞99%，產率為10.7%。Yildirim等[30]利用來自Aspergillus niger的環(huán)氧化物水解酶拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷，產物（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值為99%，產率為26%。

圖5 AmEH（a）或突變體（b）分別與（R）-或（S）-環(huán)氧氯丙烷的分子對接模擬

筆者團隊在前期分子改造研究的基礎上，以表達AmEH突變體W182F/S207V/N240D重組大腸桿菌為全細胞催化劑，通過反應體系優(yōu)化，構建了環(huán)氧化物水解酶手性拆分環(huán)氧氯丙烷技術。底物濃度75mmol/L，反應35min，拆分獲得（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值＞99.9%，產率達45.8%；底物濃度進一步提高至450mmol/L，反應90min，（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值＞99.9%，產率為40.5% （圖6）[31]。與目前已報道的環(huán)氧化物水解酶相比，AmEH突變體的對映選擇性高，并且具有較高的底物耐受性與產物產率，工業(yè)應用開發(fā)潛力巨大。

圖6 環(huán)氧化物水解酶AmEH突變體催化不對稱拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷的反應進程

5 雙酶偶聯催化制備手性環(huán)氧氯丙烷

鹵醇脫鹵酶催化1，3-二氯-2-丙醇不對稱合成手性環(huán)氧氯丙烷，理論產率可達100%，但由于目前已有鹵醇脫鹵酶的立體選擇性尚不理想，產物的光學純度還不能達到工業(yè)生產要求。環(huán)氧化物水解酶拆分制備手性環(huán)氧氯丙烷具有高度立體選擇性，但理論產率不超過50%。筆者團隊構建了鹵醇脫鹵酶/環(huán)氧化物水解酶雙酶串聯催化合成（S）-環(huán)氧氯丙烷技術，利用立體選擇性鹵醇脫鹵酶催化1，3-二氯-2-丙醇高效合成（S）-環(huán)氧氯丙烷，利用環(huán)氧化物水解酶選擇性水解體系中少量的（R）-環(huán)氧氯丙烷，實現手性環(huán)氧氯丙烷的高產率、高光學純制備。

利用含鹵醇脫鹵酶HheC突變體P175S/W249P重組工程菌與含環(huán)氧化物水解酶AmEH突變體W182F/S207V/N240D重組工程菌為催化劑，通過反應體系優(yōu)化與過程控制，構建雙酶串聯催化合成（S）- 環(huán)氧 氯丙烷技術。底物濃度20mmol/L，經雙酶串聯催化，反應10～15min，產物（S）-環(huán)氧氯丙烷的e.e.值＞99.9%，產率達91.2%。底物濃度提高至100mmol/L，產物e.e.值＞99%，產率為54.2%[18]。該技術克服了手性環(huán)氧氯丙烷合成中，使用單一生物催化劑的不足，在原子經濟性、產品光學純度與產率方面優(yōu)勢明顯，開發(fā)潛力巨大。

6 總結與展望

采用生物催化技術，由甘油出發(fā)合成手性環(huán)氧氯丙烷，具有成本低廉、條件溫和、環(huán)境友好等突出特點，符合當代綠色經濟的發(fā)展趨勢。筆者團隊通過生物催化路線設計、關鍵酶的篩選與改造、雙酶串聯催化工藝構建等技術開發(fā)，探索建立手性環(huán)氧氯丙烷的生物合成技術。筆者課題的研究對于開發(fā)甘油出發(fā)生產手性環(huán)氧氯丙烷的綠色合成技術具有重要參考意義。

甘油的生物催化氯化與高光學純度、高產率的手性環(huán)氧氯丙烷的生物制備是該領域研究的難點所在，相關研究方興未艾。相信在不久的未來，隨著生物信息學、基因組與蛋白質組學、基因編輯技術的快速發(fā)展，生物資源開發(fā)與生物催化劑改造技術進入更高層次，高活性甘油氯化酶與高立體選擇性鹵醇脫鹵酶、環(huán)氧化物水解酶等關鍵酶將得到進一步深入研發(fā)，進而推動手性環(huán)氧氯丙烷生物合成技術的發(fā)展與應用，助力我國傳統(tǒng)化工產業(yè)的改造升級。

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Research and development on key enzymes for biosynthesis of chiral epichlorohydrin using glycerol

ZHANG Xiaojian1，2，ZHENG Yuguo1，2
1. College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China 2. Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, Hangzhou 310014, China

Chiral epichlorohydrin is an important three-carbon chiral building block for applications in pharmacy, pesticide,chemical, material and many other industries. It is of great value to develop green process for chiral epichlorohydrin synthesis from glycerol. Technologies of biocatalytic synthesis were applied to improve process safety, to reduce waste discharge,and to upgrade product quality. The biosynthesis chiral epichlorohydrin was developed, and the related technologies were described including design of synthetic route, construction of halogenase library, screening and modi fi cation of halohydrin dehalogenase and epoxide hydrolase, as well as production of chiral epichlorohydrin using halohydrin dehalogenase/epoxide hydrolase cascade biocatalysis. Our studies contribute to the exploration and development of chiral epichlorohydrin synthesis.

glycerol; chiral epichlorohydrin; 1,3-dichloro-2-propanol; biocatalysis; halohydrin dehalogenase; epoxide hydrolase

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.06.009

鄭裕國，教授，博士生導師。浙江工業(yè)大學生物工程學院院長、生物轉化與生物凈化教育部工程研究中心主任、浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室主任、浙江省生物催化與微生物發(fā)酵重點科技創(chuàng)新團隊負責人等。長期從事生物化工研究和產業(yè)化技術開發(fā)，以第一完成人獲國家技術發(fā)明二等獎2項、國家科技進步二等獎1項、省部級科學技術一等獎6項、中國專利優(yōu)秀獎1項。發(fā)表SCI論文200余篇，授權發(fā)明專利90多件。主持開發(fā)的產業(yè)化技術建成工業(yè)化生產裝置10余套，近3年新增銷售50多億元。先后獲得全國優(yōu)秀教師、全國優(yōu)秀科技工作者、浙江省功勛教師等稱號。E-mail：zhengyg@zjut.edu.cn