張一帆

(鄭州蘭博爾科技有限公司，河南 鄭州 450000)

?分析測(cè)試?

幾丁聚糖聚合度的測(cè)定方法

張一帆

(鄭州蘭博爾科技有限公司，河南 鄭州 450000)

介紹了以50%乙腈溶液分別溶解稀釋殼寡糖單體標(biāo)準(zhǔn)品及檢測(cè)樣，并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，分別得到殼寡糖標(biāo)樣溶液和檢測(cè)溶液，采用高效液相色譜測(cè)定兩溶液的幾丁聚糖聚合度。根據(jù)色譜峰保留時(shí)間定性分析；根據(jù)峰面積定量計(jì)算得各單體的含量之和，即為幾丁聚糖的含量；根據(jù)聚合度為i的幾丁聚糖單體含量占幾丁聚糖總含量的比值，來(lái)考察樣品的聚合度分布情況。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣與檢測(cè)樣對(duì)比分析結(jié)果可知，該方法具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度良好、精確度良好、線性關(guān)系良好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適用于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)產(chǎn)品幾丁聚糖聚合度的檢測(cè)。

幾丁聚糖 ; 聚合度 ; 高效液相色譜

0 前言

由于化學(xué)殺菌劑長(zhǎng)期使用和使用劑量的逐年增大，病原微生物的抗藥性越來(lái)越強(qiáng)，為了降低抗藥性，增強(qiáng)植物的抗病害能力，細(xì)胞活化型抗性誘導(dǎo)劑生物制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用日益廣泛，幾丁聚糖就是其中之一。幾丁聚糖又名殼多糖、殼聚糖、甲殼素、海力源等，是從蟹、蝦殼中應(yīng)用遺傳基因工程提取的動(dòng)物性高分子纖維素，被科學(xué)界譽(yù)之為“第六生命要素”。幾丁聚糖水劑為誘導(dǎo)活性強(qiáng)、對(duì)人畜無(wú)毒、對(duì)環(huán)境無(wú)污染、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單和有雙重功能的新一代生物制劑，它可以增強(qiáng)作物抵御病害的能力，增強(qiáng)作物抵御低溫干旱的能力，對(duì)環(huán)境友好。

目前在國(guó)內(nèi)登記的幾丁聚糖劑型有水劑、懸浮種衣劑、可濕性粉劑、顆粒劑、懸浮劑、水乳劑等幾種劑型，可用于水稻稻瘟病的防治，可以調(diào)節(jié)冬小麥、春大豆、棉花、玉米的生長(zhǎng)，防治黃瓜、萵苣的霜霉病、白粉病、根結(jié)線蟲(chóng)病等，還可以防治番茄的晚疫病、柑橘的炭疽病，對(duì)蘋(píng)果樹(shù)的斑點(diǎn)落葉病也有效果，在作物的病蟲(chóng)害防治中應(yīng)用廣泛。經(jīng)查詢農(nóng)藥電子手冊(cè)，幾丁聚糖毒性為：急性經(jīng)口LD50gt;4 640 mg/kg，急性經(jīng)皮LD50gt;2 150 mg/kg；毒性為低毒。

聚合度是考察幾丁聚糖聚合情況的指標(biāo)，不同聚合度范圍的幾丁聚糖殺菌效果不同。聚合度測(cè)定有比旋光度法、超離心法、高壓電泳法、凝膠色譜法，這四種方法誤差較大或者操作繁瑣，往往采用兩種方法測(cè)定得出相同結(jié)論才能確定其聚合度。采用高效液相色譜法對(duì)聚合度分布情況進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確度較高。具體方法為：試樣用50%乙腈溶解后，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，采用親水鍵合色譜測(cè)定，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間定性，根據(jù)峰面積定量，各單體的含量之和為幾丁聚糖的含量。根據(jù)聚合度為i的幾丁聚糖單體含量占幾丁聚糖總含量的比值，來(lái)考察樣品的聚合度分布情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

高效液相色譜儀：附蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜工作站；色譜柱： 250 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)填Click Maltose 色譜柱填充物；過(guò)濾器：濾膜孔徑為0.22 μm；微量進(jìn)樣器：50 μL；電子天平。

水：符合GB/T 6682一級(jí)水的要求；50%乙腈溶液：量取500 mL乙腈加水稀釋至1 000 mL；緩沖液：甲酸—甲酸銨，pH值為3.1，100 mmol/L；幾丁聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：氨基葡萄糖鹽酸鹽(≥99%)、殼二糖(≥98%)、殼三糖(≥96%)、殼四糖(≥97%)、殼五糖(≥90%)、殼六糖(≥80%)、殼七糖(≥85%)。

1.2高效液相色譜操作條件

流動(dòng)相為乙腈—水(體積比為1∶1，甲酸—甲酸銨調(diào)節(jié)pH值3.1)，乙腈梯度洗脫，具體如表1所示。

表1 乙腈梯度洗脫表

流速1.000 mL/min；色譜柱溫度為30 ℃；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射(ELSD)；檢測(cè)器溫度：80 ℃；檢測(cè)器通氣量：1.5 L/min；進(jìn)樣量：20 μL。殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖示意圖見(jiàn)圖1，聚合度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖示意圖

圖2 聚合度測(cè)定結(jié)果

圖2中標(biāo)注的2～15，為聚合度。聚合度為2～7的峰與標(biāo)準(zhǔn)品特征峰基本一致，即可判定樣品中含有幾丁聚糖。

2 測(cè)定步驟

2.1殼寡糖標(biāo)樣溶液的配制

分別稱取殼寡糖單體標(biāo)準(zhǔn)品約0.05 g(精確到0.001 g)，加50%的乙腈溶液溶解并稀釋至100 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液備用。

2.2試樣溶液的配制

稱取試樣約0.5 g(精確到0.001 g)，加50%的乙腈溶液溶解并稀釋至100 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液備用。

2.3測(cè)定

在上述色譜條件下將殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品組分的色譜保留時(shí)間，取20 μL試樣溶液注入高效液相色譜儀分析，測(cè)定各個(gè)組分保留時(shí)間和色譜峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)照，對(duì)每一個(gè)色譜峰進(jìn)行歸屬。

2.4結(jié)果計(jì)算

幾丁聚糖的聚合度(以幾丁聚糖單體的含量計(jì))X2按式(1)計(jì)算：

(1)

3 結(jié)果與討論

3.1線性關(guān)系曲線的測(cè)定

按照上文“殼寡糖標(biāo)樣溶液的配制方法”，配制5個(gè)不同濃度的殼寡糖單體的標(biāo)樣溶液，在上述液相色譜操作條件下進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)樣溶液進(jìn)樣兩次。殼寡糖單體標(biāo)樣質(zhì)量表示為m，殼寡糖單體峰面積(以殼七糖計(jì))表示為R，其結(jié)果如表2所示。

表2 聚合度測(cè)定線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

以m為橫坐標(biāo)，R(R1、R2平均值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

圖3 聚合度測(cè)定的線性關(guān)系圖

從線性關(guān)系圖可以看出線性關(guān)系較好，回歸方程為：Y=118 446 012.6X+37 056，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

3.2準(zhǔn)確度的測(cè)定

向已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試樣中加入一定量的殼寡糖單體標(biāo)樣，測(cè)定加入標(biāo)樣量，計(jì)算其回收率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可見(jiàn)該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 聚合度測(cè)定準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3.3精密度的測(cè)定

在上述分析條件下，對(duì)同一樣品分別進(jìn)行5次平行測(cè)定，幾丁聚糖聚合度(以i=7的含量計(jì))分別為14.52%、14.60%、14.83%、14.71%、14.68%，平均值為14.67%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.117，變異系數(shù)為0.79%，由測(cè)定結(jié)果可知該方法具有良好的精密度。

3.4與凝膠色譜法測(cè)定聚合度的比較

凝膠色譜法是采用凝膠色譜柱，以KH2PO4緩沖溶液為流動(dòng)相，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，以殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線作參照，測(cè)得幾丁聚糖的重均相對(duì)分子質(zhì)量，然后計(jì)算聚合度。

凝膠色譜法所用試劑：殼寡糖(不同的相對(duì)分子質(zhì)量)、硫酸、鹽酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、EDTA、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、KH2PO4。樣品需要進(jìn)行如下純化過(guò)程：

原料→稱重→熱水抽提→離心→醇沉→離心→濃縮→除蛋白→脫色→透析→過(guò)DEAE纖維素柱→水洗脫→凍干→幾丁聚糖L1。做平行試驗(yàn)，得幾丁聚糖L2。幾丁聚糖聚合度的計(jì)算方法為：幾丁聚糖聚合度=幾丁聚糖重均相對(duì)分子質(zhì)量/幾丁聚糖中糖最小單元相對(duì)分子質(zhì)量。

對(duì)同一樣品用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，用凝膠色譜法測(cè)定的聚合度的兩次分析結(jié)果分別為9.2和9.7；用液相色譜法測(cè)定的兩次分析結(jié)果分別為：i=7，14.5%、14.8%；i=8，26.1%、26.5%；i=9，17.8%、17.5%；i=10，12.5%、12.1%。

由以上分析過(guò)程和分析結(jié)果可以看出，使用高效液相色譜法操作簡(jiǎn)單，更能準(zhǔn)確直觀地得知不同聚合度的幾丁聚糖在產(chǎn)品中所占的比例。而凝膠色譜法要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的處理過(guò)程，是用相對(duì)分子質(zhì)量的平均值與最小值的對(duì)比來(lái)表示聚合度，只是一個(gè)大概數(shù)值。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣與測(cè)試樣的幾丁聚糖聚合度，對(duì)比分析兩者結(jié)果，表明該檢測(cè)方法具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度良好、精確度良好、線性關(guān)系良好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中可以起到指導(dǎo)作用，可以準(zhǔn)確把控產(chǎn)品質(zhì)量，是分析幾丁聚糖聚合度的較為適用的方法。

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2017-07-14

張一帆(1988-)，女，助理工程師，從事農(nóng)藥方面的研究工作，電話：15090757582。